công nghệ ADN tái tổ hợp

WELCOME


Nhóm 1
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP


ADN TÁI TỔ HỢP

CÁC ENZYM CHỦ YẾU

CÁC VECTOR SỬ DỤNG

Nội dung
CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ

1

TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG


ADN TÁI TỔ HỢP
•
•

Tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau.
Nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một loài,
hoặc của các loài khác nhau.

Sơ đồ quá trình tạo dòng AND tái tổ hợp

2


CÁC ENZYM CHỦ YẾU
DÙNG TRONG KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP

(E)
(E) cắt
cắt giới
giới hạn
hạn

(E) nuclease
nuclease

Enzym

(E)
(E) polymerase
polymerase

3

((E)
E) ligase
ligase


ENZYM CẮT GIỚI HẠN

•
•

Là các enzym có khả năng cắt ADN ở những vị trí đặc hiệu thành các đoạn ADN
ngắn hơn.
Có 3 loại enzym giới hạn: 
Loại I: cắt tại điểm cách vị trí nhận biết của nó khoảng 1000-5000 nucleotid
Loại II Cắt ngay tại vị trí nhận biết
Loại III: Cắt tại điểm cách vị trí nhận biết của nó khoảng 20 nucleotid

4


ENZYM POLYMERASE

•
•
•

Xúc tác cho quá trình sao chép các a.Nu (ADN, ARN).
Tổng hợp các a.Nu bằng cách nối các Nu với nhau theo NTBS dựa theo mạch
khuôn.
Qúa trình tổng hợp diễn ra theo chiều 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’- OH tự do.

ARN
polymera
se

cADN

5


ENZYM LIGASE

•
•

Ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu
nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh
nhau. Trong sinh học phân tử, người ta coi ligase như một chất keo phân tử để kết
dính các mẫu DNA lại với nhau.
Có 2 cách:
Nối đầu bằng
Nối đầu lệch

•
•

6


CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
Vectơ chuyển gen ( một phân tử ADN) là phương tiện để đưa gen cần chuyển
vào tế bào chủ. Muốn vậy vectơ chuyển gen cần có những đặc điểm chính sau:
Có điểm khởi đầu sao chép.
Có trình tự đặc hiệu để enzym cắt giới hạn bám vào.
Có gen chỉ thị.
Có khả năng tự nhân lên nhiều bản sao

trong tế bào chủ.

•
•
•
•

7


CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
ỨNG DỤNG:

•
•
•
•
•

Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự hoặc gen.
Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự ADN, hoặc một gen.
Chuyển gen vào tế bào của sinh vật khác.
Sản xuất các ARN.
Sản xuất protein.

8


CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
VECTƠ PLASMID:

9

Plasmid pBR322


CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
VECTƠ PHAGE:

•

Dùng làm vectơ chuyển gen do khả năng thực hiện việc mang gen từ tế bào vi
khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải nạp).

•
•

Hiện nay, thường sử dụng Phage M13 làm vectơ tách dòng.
Phage M13 có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400bp, chỉ
xâm nhiễm vào E.coli.

Bluescript M13

10


CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ

•
•
•

MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG:
Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng. Hệ thống tế bào chủ
này cần đơn giản, dễ sử dụng.
Dùng để biểu hiện gen, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao như động vật, thực
vật. Hệ thống tế bào chủ này càn mang tính đặc thù.
Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.

TẾ BÀO CHỦ NHÂN SƠ

TẾ BÀO CHỦ NHÂN CHUẨN

11


TẾ BÀO CHỦ NHÂN SƠ:

•

VK E.coli được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen vì đáp ứng được các
yêu cầu của tế bào chủ lý tưởng, là một tế bào dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống, chấp
nhận nhiều vectơ.

12

TẾ BÀO CHỦ NHÂN CHUẨN:

•

Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E.coli làm tế bào chủ để tách
dòng gen vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng bao bọc NST. Do vậy các gen ở
sinh vật nhân chuẩn không thể biểu hiện được trong E.coli vì môi trường khác với
môi trường bình thường của gen sinh vật nhân chuẩn.

•

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các VSV nhân chuẩn bậc thấp
như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào phức tạp như
động vật, thực vật.

13


TẾ BÀO NẤM MEN (Saccharomyces cerevisiae):

•
•

Là một SV nhân chuẩn được ưa thích để nghiên cứu kỹ thuật di truyền.
Sử dụng nhiều để sản xuất bánh mỳ và bia.

14


CÁC TẾ BÀO CHỦ THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT:

•
•

Có thể sử dụng như các vật chủ trong các thí nghiệm thao tác gen.

•

Tảo đơn bào được sử dụng làm tế bào chủ nhiều nhất trong các thí nghiệm thao tác gen (ở
thực vật).

Các tế bào vật chủ thường được nuôi cấy trong các môi trường thích hợp và ở điều kiện này
để sử dụng trong các thí nghiệm thao tác gen so với các tế bào trong cơ thể.

15


Tế bào thận

Tế bào thận

Khỉ xanh Châu Phi

Chuột đồng nhỏ
THÀNH TỰU

16
Tế bào thận

Tế bào tử cung

Phôi người

Chuột bạch


Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp

TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP:

Tạo nguồn gen: có 3 phương pháp khác nhau để thu thập gen:

•
•
•

Thu nhận ADN từ hệ gen.
Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học.
Lập ngân hàng ADN bổ trợ (cADN).

Tạo plasmid tái tổ hợp: gắn ADN hoặc cADN vào vectơ chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp. Có
nhiều phương pháp gắn các đoạn ADN, cADN vào plasmid:

•
•
•

Phương pháp dùng đầu dính.
Phương dùng đoạn nối linker.
Phương pháp dùng enzym terminal transferase.

17


Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp
TÁCH DÒNG ADN TÁI TỔ HỢP:
Tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp hoặc vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ.

•

Biến nạp được thực hiện bằng nhiều cách:

•
•
•
•

Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất.
Phương pháp xung điện.
Phương pháp vi tiêm.
Phương pháp dùng súng bắn gen.

18


Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp
CHỌN LỌC DÒNG ADN ĐẶC HIỆU VÀ BIỂU HIỆN GEN:
Chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gen mong muốn và sau đó tạo điều kiện cho gen biểu hiện.
Chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu:

•
•

Bởi vì sử dụng các loại gen khác nhau nên tạo ra số lượng dòng ADN rất lớn hoặc một loại enzym giới hạn có
thể cắt ra những đoạn gen không mong muốn trong khi các nhà nghiên cứu chỉ muốn tách một dòng ADN cụ
thể đặc hiệu nên cần phải tiến hành chọn lọc.
Có ba hướng chính để chọn lọc dòng ADN:

•
•
•

Lai a.Nu: dùng mẫu ARN dò đặc hiệu.
Phát hiện bằng kiểu hình.
Phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm.

19


Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp
Biểu hiện của gen mong muốn:

•

Muốn gen đã tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vectơ mang đầy đủ yếu
tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gen ở động vật có vú tạo ra sản phẩm là
các protein có hoạt tính sinh học chúng ta cần với số lượng lớn và có giá trị thương
mại.

20

Thành tựu công nghệ ADN tái tổ hợp

21