Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (338.23 KB, 44 trang )

1

Phần 1
MỞ ĐÀU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. colĩ) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh
vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E.
coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và
gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và
nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Neu quá
trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mố. Từ đó
nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli
hoàn toàn có thế xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong đó,
nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách
nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc một; gen hly sản sinh độc tố gây
dung giải hồng cầu; gen stxl, Stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất
huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic
syndrome) ở người, gen Stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo
cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli ) mang gen It sản sinh độc tố một
kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố một chịu nhiệt (heat stable
toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. colĩ)
mang gen eae sản sinh protein intimin, ...
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy tmyền thống.
Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới có kết quả.
Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường một và cũng thường có mặt trong thực
phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân đế tìm nguyên nhân gây bệnh hay
xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây
độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước
cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương
pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp

phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm
TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang,
chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn
Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex - PCR từ mẫu
phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đoán và kiếm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và

người.Phần

2

TỎNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1.
Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người
Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này
vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống
phân loại của Bergey).
- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng
l,5//mx 0,5 ụm, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996). E. co li có
mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối
của một non và một già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi

khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường một và ở các cơ quan khác.
2.1.2.
Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37°c, pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu là 7,2
-7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên
môi trường chọn lọc ở 37°c trong điều kiện hiếu khí. E. co li thường được phân lập bằng môi
trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB). Trên môi trường thạch
EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi tmờng thạch Mac Conkey, E. coli cho
khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thế sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để
phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC
cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn
lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ
hình thành những khuẩn lạc dạng s (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích
thước khoảng 2 - 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng đế lâu
càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thế có ván mỏng trên mặt môi trường.
- Để phân biệt E. co li và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng
IMVÍC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - - (biotype 1)
hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3.
Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân o (somatic), kháng nguyên H
(ílagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype của E. coli đã được
công nhận dựa vào những kháng nguyên o, H, K. Theo Jay (2000), E. co li có trên 200 type
kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H.
2.1.4.
Ctf chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coỉv.

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn công - xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thế vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho
mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5.
Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điếm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày
của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E. coli được
chia thành 5 nhóm sau:

> STEC (Shiga toxin - producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E. colĩ)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
> EPEC (Enteropathogenic E. coli)
> EAEC (Enteroaggregative E. coli)
> ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
> Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. co li)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1.
Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau đế
đặt tên cho nhóm E. co li này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli (VTEC)
được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây
độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều
tố chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây viêm

kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic
uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga to xin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga
(Caldenvood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở
Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng nhóm E.
co li sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, không phải có gen sản
sinh độc tố là có thế gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E. coli mang
gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng
những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và
ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tổ khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins
(VT) hoặc Shiga - like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stxl và Stx2,
được mã hóa bởi gen stxl và Stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B (được mã
hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen stxA và stxB được định vị
trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC. Một dòng
STEC chỉ sản xuất độc tố Stxl, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba
dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Subtype Stx2e gây
bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người. Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có
thế được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994). Nhiều khi người ta có thể thay
thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stxl = VT1 = Sltl, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v...)
(Caldervood và ctv, 1997). Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu
phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tổ độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thế là heat stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 - MDa mà plasmid này
được tìm thấy ở nhiều dòng 0157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải 0157. Ở
Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv,

1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc lực thì khó đánh giá, vì trong các
nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư

hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mô tả
trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC
thì không được biết, nhưng nó có thế liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu
thường xuyên được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yeu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào ruột.
Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa. Protein intimin được mã
hóa bởi gen eae (E. coli attaching và etĩacing). Intimin gây tốn thương dạng bám dính và phá
hủy (attaching - and - effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biếu mô
(Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một
trong số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus
of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen
mã hóa thụ thế đế vận chuyến intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen
khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tốn thương
A/E. Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae
(Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vi
khuẩn (protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyến vị vào
màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng 0157:H7, nên người ta cho rằng có
thế serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu hiệu sinh hóa duy
nhất cho những dòng STEC 0157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc không tạo ra/? glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào việc phát hiện E. coli
không lên men sorbitol. 0157:H7 và các serotype không phải 0157 liên quan đến việc gây
bệnh ở người gồm 026:H11, O103:H2, 0111:HNM và 0113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê, heo,
chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv, 1997) và
ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng nhất trong việc lây

nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy
nhiễm những thành phần trong một và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang người
khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có
nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001).
2.1.5.2.
Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để
chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn bám
dính vào niêm mạc một và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố Shiga.
b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan
sát được trên mẫu sinh thiết một từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào
(Nataro và Kaper, 1998). Dạng tốn thương này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung
mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biếu mô. Tốn thương này khác với dạng
tốn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt,
không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết cho việc tạo tốn thương A/E là gen eae mã
hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo
Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Closfridium
rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn
đường ruột thông thường.
c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. co li gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường miệng,

với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi. Bệnh
thường biếu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng thành và trẻ em

lớn có phần đề kháng hom với bệnh mà nguyên nhân có thế là do mất các thụ thế đặc hiệu.
Tuy nhiên, EPEC cũng có thế gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3.
Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor - CF)
❖ Độc tổ ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố một. Có hai loại: độc tố một chịu nhiệt (ST) và độc tố
một kém chịu nhiệt (LT).
(1) Độc tổ kém chịu nhiệt (heat - labile toxin - LT):
Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng
với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT
giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương
đồng về thụ thế, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế
bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt
miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là một
oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5
kDa. Tiếu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide Ai và peptide A 2 liên kết
nhau bởi cầu nối disultur. Những tiếu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn
với ganglioside GM] và liên kết lỏng lẻo với GDlb và vài glycoprotein một (các thụ thế của
LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu
tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt
hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa
những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua
màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng
(cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành
dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức
bình thuờng ở màng tế bào biếu mô. Ket quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl"

một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây
chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT - II: LT-II có cấu trúc giống với LT - I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị A,
nhung không giống với LT-I và CT ở tiếu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào
qua cơ chế tuơng tự nhu LT-I, nhung LT-II không liên quan đến bệnh trên nguời và thú.
(2) Độc tổ chịu nhiệt (heat - stable toxin - ST)
Nguợc với LT, ST có trọng luợng phân tử nhỏ và những cầu nối disulíur của nó giải
thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST đuợc chia thành hai nhóm là STa và STb. Hai
nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả hai nhóm đuợc tìm
thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng đuợc tìm thấy trên transposon. Độc tố
STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia
enterocolitica và V. cholerae không phải 01. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu
nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC
ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ đuợc tìm
thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 1 8 - 1 9 acid amin với trọng luợng phân tử khoảng 2
kDa. STa đuợc chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli phân lập đuợc trên
heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên nguời. Cả hai độc tố có thế đuợc
tìm thấy ở các dòng ETEC trên nguời.

Thụ thế chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase c (GC-C). STa kết
hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng luợng cGMP nội bào. Hoạt động
này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl" và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng
luợng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài
chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những
tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của lớp biểu mô
ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta
cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào.

Không gây ra sự tiết cr nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3). STb không
làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại
bào. STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh
ruột cũng có thế liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv,
1992).
❖ Yếu tố định vị (colonization factor - CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy một đã được nghiên cứu kỹ.
Đe gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào một non nhờ vào lông trên bề mặt
của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens).
CFA có thế được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông
hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Có ít nhất 20 loại CF
trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã
hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường
tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh,
b. Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em thôi
bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của bệnh do ETEC
được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thế đối
với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biếu hiện triệu chứng vẫn bài thải một
lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc
tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi tmờng ở những vùng có dịch và hầu hết
trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuối đến
trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là
nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh.
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những
phưong tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những vùng
dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của
ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thành
chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên

du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC.
Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40%
các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu
tiên đến thăm những nước đang phát triển. Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và
nước uống bị ô nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14-50 giờ).
Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và
ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thế nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có thế gây ra tiêu chảy
nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường họp nhiễm ETEC nguy hiếm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi
bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm

mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ
cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm. Do đó
cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước
trong cơ thế nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đoán
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có nhiều
phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA), DNA-probe, PCR...
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1.
Nguyên tắc
PCR (polymerase Chain reaction - phản ứng tống họp dây chuyền nhờ polymerase) do
Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh
một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần
sự hiện diện của tế bào).
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA đơn,

ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét
nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện
phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer
“nguợc” (reverse primer). Ket quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu.
Những chuỗi này sẽ tồn tại duới dạng DNA chuỗi đôi. Sự tống hợp này sẽ đuợc lặp lại theo
một số chu kỳ nhất định đã đuợc thiết lập.
Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng
thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng.
Multiplex - PCR đầu tiên đuợc mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kế từ đó multiplex - PCR
đuợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiếm tra DNA (Protocol Online).
2.2.2.
Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai
đoạn:
> Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA đuợc biến
tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thuờng là ở 94 -95°c trong vòng
30 giây đến 1 phút.
> Giai đoạn 2\ Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ đuợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với
khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 - 60°c tuỳ thuộc Tm của các
primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
> Giai đoạn 3\ Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này đuợc tăng lên 72°c giúp DNA polymerase hoạt động tổng họp
DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA nằm giữa
hai primer đuợc tổng họp tạo thành chuỗi DNA.
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ đuợc lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi
luợng DNA mẫu của lần truớc. Tống DNA khuếch đại đuợc tính theo công thức: Tổng DNA
khuếch đại = m*2n Với n: Số chu kỳ; m: số bản sao của chuỗi mã hóa

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA
polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khỉ nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếp
theo. Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn
DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ chu kỳ thứ 4 trở đi,
trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính
theo công thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n - 2n) * X
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2
X : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR diễn
ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
■ Phân hủy và cạn kiệt cảc thành phần của phản ứng.
■ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
■ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với prỉmer mà lại bắt cặp với
nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là 10 5 thì
cần khoảng 25 - 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 - 103 thì số chu kỳ phải là 35
-40.
T

TTTmTTi "li............HĨ.............ĩ ■' Tprmrnnri11......iiTHiT-rni II miĩrm

-LL •UXUlujrJ-L*

s

1

••

u.111LIu

^

Giai đoạn biến tính
(denaturation)

nm-nTtm I I I .....11 u n I I I I I I T T I I I inrmrmTTi"[ I I r m n I I I I I I I I I I I I I r r r r r r i y
i LUiJ

‘

-LLiiJaiuUj y

■ Giai đoạn ủ bắt cặp
. (anealing)

5

^mrnmi ........... .......
Giai đoạn kéo dài
'1
- 1 V' - I I _
mi

^ìrTnTiĩrTTV,T'i‘iTriTrrr^- .

5.

extension)

■ ■■■■■■■
I—

. f I * (elongation hay
1
T^

Hình 2.1 Nguyên Ịỷ của phản ứng PCR

3/
.

o
©

<0"2

Biến tính
/
/

Lặp lại n lần

\u bắt cặp'
40-70°C

Thời gian (phút)
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3.
Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đon, có trình tự bố sung với
trình thự base của hai đầu mạch khuôn đế khởi đầu quá trình tống họp DNA. Việc chọn primer
là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer đuợc chọn phải đặc trung cho trình tự
DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ
sung giữa primer xuôi và primer nguợc và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp
bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các primer tối thiếu cho hầu hết các ứng dụng PCR
là 18 nucleotide (thuờng là 1 8 - 2 4 nucleotide). Trình tụ nằm giữa hai primer xuôi và nguợc
không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối uu trên những trình tự nhỏ hơn lkb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, đuợc chiết
tách từ vi khuẩn Thermus aquatỉcus ở suối nuớc nóng. Taq DNA polymerase không bị phá hủy
ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng họp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng duới sự hiện diện của
Mg2+. Taq DNA polymerase tổng họp DNA theo huớng 5’—>3’ và hoạt động tốt nhất ở 7072°c.
- Các nucleotide (dNTP - deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn họp 4 loại: dATP,
dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng họp DNA.
- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme đuợc sử
dụng, quan trọng nhất là ion Mg 2+. Nó hình thành một phức họp hòa tan với dNTP, rất cần cho
quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg 2+ (thuờng đuợc sử dụng ở dạng MgCl 2) là một yếu tố
ảnh huởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl 2 có
thế ảnh huởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ đế biến tính DNA thành dây đơn,
hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg 2+ phải đuợc xác định cho
từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgƠ2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng

thuờng biến thiên từ 0,5 - 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Duơng, 1998).
2.2.4.
Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA đuợc khuếch đại) sẽ đuợc phát hiện bằng
phuơng pháp điện di.
Nguyên tắc của phuơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. DNA
là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện
truờng, chúng sẽ di chuyển về điện cực duơng của điện truờng. Sự di chuyển của phân tử trong
bản gel duới tác động của một điện truờng phụ thuộc vào khối luợng của các phân tử (tức là số
nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế.
Điện di đuợc thực hiện theo phuơng nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel
agarose đuợc hiện ra duới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn
xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang duới tác dụng của tia uv (buớc sóng Ả
=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam.

Đe uớc luợng kích thuớc DNA bằng gel agarose, nguời ta sử dụng một yếu tố đánh dấu
“trọng luợng phân tử” (molecular weight make - MWM) là một tập họp nhiều trình tự DNA có
kích thuớc đã biết (DNA ladder).
2.2.5.
Những ứng dụng của PCR
2.2.5.1.
PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ
PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứng
khuếch đại. Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copy
đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này.
Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tích
pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic hngeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc và thậm chí
với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật. PCR cũng
được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trường

họp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không
thế sử dụng các phương pháp phân tích thông thường.
Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cố và cố sinh vật học,
bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trong
các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch. Phương pháp PCR cũng được sử
dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích
các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các
xác ướp.
2.2.5.2.
PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanh
chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tích
trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng không
chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di
truyền.
PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ: Khuếch đại
DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng bệnh bắt đầu
xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta có thế đề ra cách chữa trị
thích họp và ngăn chặn được thiệt hại.
2.2.5.3.
PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng được
khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đối thành DNA tái tố họp (cDNA) nhờ enzyme
reverse transcriptase.
Một ứng dụng có ích của RT - PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNA
trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điếm khác nhau. Số lượng
của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt động của gen cha mẹ. Vì
thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đối trong sự biểu hiện gen để chúng có
thể được kiểm soát.
2.2.5A. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau

Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random ampliíication) với các primer ngắn là kỹ thuật hữu
dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và suy vong
của các loài hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band
giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994).
2.2.6.
Các hạn chế của phương pháp PCR
Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh
hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta không thế quên
rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm
cũng như khi phân tích kết quả. Có thế kế ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:

2.2.6.1.
Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giói hạn đầu
tiên
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những
đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới 1,5 kb cho kết
quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực
nghiệm.
2.2.6.2.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đổi với PCR, gắn liền với khả
năng khuếch đại bản sao đổi vói phương pháp này
Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rất nghiêm
trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác
trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau những lần khuếch
đại trong một khoảng không gian kín trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được
khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết
bị dung cụ...rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thế khắc phục một phần vấn đề
này bằng một số biện pháp sau:
- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích

các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điếm cách xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho các
thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào đầu
micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
- Dùng tia tử ngoại đế loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại
truớc.
- Tất cả các thành phần phản ứng đều đuợc chia thành những luợng nhỏ, tính
toán sao cho 1, 2 lần thao tác.
2.2.6.3.
Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10~4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì
enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích
thuớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhung có ý nghĩa lớn nếu cần xác định
chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thế loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà
chỉ có thế giảm bớt; ví dụ nhu đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng,
xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh truớc khi
đi đến trình tự chính thức,...Phần 3

NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
•

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1.
Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005
3.1.2.
Địa điểm
- Mau phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu phân
heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mố Dĩ An - Bình Dưomg.

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiếm nghiệm Thú
sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí
Minh.
- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Nội dung
- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
- Nuôi cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.
- Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli.
- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA
- Ly trích DNA của E. coli phân lập được.
- Thực hiện phản ứng multiplex - PCR đế phát hiện gen gây độc của E. coli.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.
Lấy mẫu
- Mẩu phân tiêu chảy
Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyến Carry Blair.
Bảo quản ở 4 - 8°c cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ).
- Mẩu bề mặt thịt
Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có sẵn 50
ml nước peptone đệm. Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ. Bảo quản 4 - 8°c,
chuyển về phòng thí nghiệm.
- Số lượng mẫu: số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi
khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy.
STT
1
2

Bảng 3.1 Sổ lượng mẫu
Đổi tượng mẫu

Phân tiêu chảy

Phân bò
Phân bê

Sổ lượng
8
10

3
4

Thịt
Tổng cộng

Phân heo

9

Bò

9
36

3.3.2.
Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), Sorbitol- SMAC,
thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT- SMAC), hóa chất thử

IMVÍC...
3.3.2.2. Nuôi cấy và phân lập
(1) Mầu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có
những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37°c. Mau bề mặt thịt được làm đồng đều trong 125 ml
peptone đệm phosphate có bố sung kháng sinh cetixime với nồng độ 0,0125 mg/1,
vancomycin với nồng độ 8 mg/1 (FDA, 2002). ủ 24 giờ ở 37°c, cấy sang môi trường CTSMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm
đục, E. coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC.
(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. co li
- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CT- SMAC.
- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 - 1 0 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của mẫu khảo
sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau:
s 6 - 1 0 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM). s 6 - 1 0
khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS).
■S 6 - 1 0 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS).
6 - 1 0 khuẩn lạc trắng CT - SMAC (Ký hiệu TC).
(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng
(NA).
- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA. Phần khuẩn lạc còn lại của
mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cất khử ion vô
trùng đế ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tống).
(4) Thử sinh hóa
- Sau khi nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc rời rạc trên được thử phản ứng IMVÍC để xác định
E. co li.
3.2.2.3.
Ly trích DNA khuẩn lạc
Sau khi đã thu nhóm khuẩn lạc trong ống eppendorf và giữ gốc từng khuẩn lạc riêng
lẻ. Mỗi gốc được cấy sang đĩa NA. Sau 24 giờ ở 37°c, thu 6 - 1 0 khuẩn lạc cho vào eppendorf
chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H20 cất khử ion vô trùng. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành ly trích DNA đại
diện nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ.
Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E. coli của

Cema và ctv (2003) và Botteldoom và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E.
coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70°c
để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút. Thu phần nổi làm DNA
khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).

- Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli như sau:
Mầu

Phân

Cấy từng khuẩn lạc
được chọn vào từng
ống NA nghiêng
(37°c/24h)

Peptone (vancomycin, cehxime)
(37°c/24h)

Thịt

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã
chọn đế cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng,
cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H20 cất
khử ion 2 lần

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)

Multiplex - PCR

Loại bỏ các ống NA
đã giữ gốc

Ly trích DNA riêng theo từng ống NA

Multiplex- PCR

So' đồ 3.1 Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực

3.3.3.
Xác định các gen stxl, Síx2, eae, hly, Stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli
phân lập được bằng multiplex - PCR
- Việc phát hiện các gen độc lực của E. coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):
s Multiplex - PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stxl, Stx2.
S Multiplex - PCR2: Phát hiện các gen Stx2e, sta, stb, lt-I.
- Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex - PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933
hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát.
S EDL933 là đối chúng dương với các gcn eae, hly, stxl,stx2.
S H44 là đối chứng dương với các gen Stx2e, stb, lt-I.
Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse (Pháp).
❖ Multiplex - PCR1

(Dần liệu củaPaton & Paton, 1998a) * Các thành phần của phản ứng multiplex - PCR1:
* Trình tự các primer sử dụngPrimer
trong multiplex - PCR1
Trình tự đoạn primer (5’-> 3’)
Kích cỡ đoạn DNA khuếch
đại (bp)

Gen độc lực
stxl

Stx 1 -F Stxl-R
ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC

AG

180

AACGCCC ACT G AG AT c AT c
Stx2-F
Stx2

Stx2-R

Eae-F
eaeAEae-R
HlyA-F
MyAHlyA-R

GGC ACT GT CT G AAACT GCTCC TCGCC

255

AGTT AT CT G AC ATT CT G
GACCCGGCACAAGCATAAGC
CCACCTGCAGCAACAAGAGG

384

GCATCATCAAGCGTACGTTCC
AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT

534

PCRbuffer IX: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25°C) 750 mM, (NH4)2S04200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200 //M; mỗi loại primer
250 mM. Taq - polymerase AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1 n 1; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50 n 1.
* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR1 (Paton và Paton, 1998a):
Bước 1
95°c /1 phút
65°c / 2 phút
72°c /1,5 phút 10 chu kỳ

Bước 4
95°c /1 phút
62°c / 2 phút
72°c
/1,5
phút

chu kỳ

Bước 2
5°c / 1 phút
64°c / 2 phút
72°c
/1,5 1>chu kỳ
phút

Bước 5
95°c / 1 phút
61°c / 2 phút
72°c /1,5 phút
1 chu kỳ

Bước 3
95°c /1 phút
63°c / 2 phút
2°c /1,5 phút
1 chu kỳ

Bước 6
95°c / 1 phút
60°c / 2 phút
72°c /1,5 phút

Bước 7
95°c / 1 phút
60°c / 2 phút
72°c / 2,5 phút^11 chu kỳ

10 chu kỳ

❖ Multiplex - PCR2

*Các thành phần của phản ứng multiplex - PCR2:
PCRbuổer IX: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25°C) 750 mM, (NH4)2S04200 mM, 0,1 % Tween 20;

MgCl2 2mM; dNTP 200 //M; primer: LTa-F 150 ng, LTa-R 150 ng, STa-F 150 ng, STa-R
150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225 ng, Vt2e-R 225 ng; Taq - polymerase AB gen
0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5 //1; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50 ụ\.
* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR2 (Nguyên Ngoe FIai, 2002);
94°c / 5 phút
95°c / 45 giây 60°c / 45 giây 72°c / 1 phút
72°c /10 phút
3.3.4.
Sau

phản

Điện

25 chu kỳ

di trên gel aragose và đọc kết quả điện di

ứng

multiplex - PCR, 6 ỊJ,\ sản phẩm PCR cùng với

1,2 ụ, \ loading dye được điện

di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X.

Ladder cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di là 30 - 35 phút ở 100V, 250mA.

Sau khi điện di, gel được ngâm ừong 30 phút với dung dịch ethỉdỉum bromide lmg/ml

TBE. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tỉa uv bằng máy chụp gel với phần mềm
Qualỉty One 2000, Bỉo-Rad). Các band DNA được xác định bằng cách so vổi các band của đối
chứng dương và ladder.

hly

(534bp)

eae (384bp)
stx2
(255bp)

57x7(180bp)

Hình 3.1 Kết quả điện
di sản phẩm multỉplex
- PCR1
EDL933: Đối chứng dương

{stxỉ, Stx2, eae, hỉy).
Lad: Thang chuẩn. 1,2, 3,4: các mẫu
xét nghiệm

lt-I (696bp)
Vt2e (230bp) |H^ _
1

stb (172bp)
2 Lad H44 3

4

Hình 3.2 Kết quả điện dỉ sản phẩm muldplex - PCR2
H44: Đối chứng dương (Ỉt-I, Vt2e, stb). Lad: Thang chuẩn. 1,2, 3,4 là các mẫu
xét nghiệm

PHÀN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc phân lập được
Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, phân lập và phân nhóm khuẩn lạc dựa vào
kiểu hình trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC và thử phản ứng sinh hóa (IMVÍC) cho
các khuẩn lạc thu được từ 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, 9 mẫu phân heo
cai sữa tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bò, kết quả lần lượt được trình bày như sau:
4.1.1.
Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC
Mầu phân tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên bề mặt thạch MAC. ủ 37°c trong 24 giờ,
quan sát và ghi nhận được chỉ một loại khuẩn lạc màu hồng điển hình của E. coli, được kí hiệu
HM. MAC là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là E. co li. Muối mật có
trong môi trường ức chế vi khuẩn Gram dương. Khi vi khuẩn Gram âm lên men lactose thì tạo
ra acid làm cho pH của môi trường giảm, môi trường đỏ hơn và khuẩn lạc có màu đỏ
(Koneman, 1983).
Mau phân tiêu chảy nuôi cấy trên thạch SMAC, ta quan sát 2 loại khuẩn lạc: khuẩn lạc
hồng (HS) và khuẩn lạc trắng (TS). Vi khuẩn không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu
trắng.
Đặc biệt các mẫu bề mặt thịt bò được tăng sinh trong môi trường peptone đệm bố sung
vancomycin và cehxime, đó là hai loại kháng sinh có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương
và một phần vi khuẩn gram âm trong đường ruột. Sau đó, cấy chuyến vi khuẩn lên môi trường
thạch CT-SMAC với mục tiêu tăng sinh nhóm STEC, vì ceíĩxime và tellurite có tác dụng ức chế
vi khuẩn gram âm và các vi khuẩn E. coli sống hoại sinh trong ống tiêu hóa (FDA, 2002). Trên

môi trường thạch CT-SMAC, chỉ quan sát được 1 loại khuẩn lạc màu trắng (TC).
4.1.2.
Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn
Sau khi giữ gốc vi khuẩn theo từng khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA, thử phản ứng
IMVÍC và khắng định các gốc phân lập được là E. co li.
4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy
Mầu phân bò tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi truờng MAC và SMAC. Sau 24
giờ nuôi cấy ở 37°c, chọn khuẩn lạc điển hình, dùng que cấy chạm nhẹ lên từng khuẩn lạc đã
chọn rồi cấy chuyến vào từng ống NA riêng biệt. Những khuẩn lạc sau khi đã cấy chuyến thì
phần còn lại được thu chung thành nhóm khuẩn lạc: HM (khuẩn lạc hồng trên môi trường
MAC), TS (khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC), HS (khuẩn lạc hồng trên môi trường
SMAC).
Như đã đề cập ở mục 4.1.2, sau khi phân lập và xác định E. coli trong mỗi mẫu phân thì
giữ gốc vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc (dựa vào kiểu hình) trên thạch MAC (1 nhóm) và SMAC
(2 nhóm) và theo từng khuẩn lạc riêng lẻ (mỗi nhóm giữ được 6 - 1 0 gốc khuẩn lạc riêng lẻ).
Trên cơ sở đó, chúng tôi ly trích DNA của vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc hoặc từng khuẩn lạc
riêng lẻ.
Ket quả trình bày ở mục 4.1.1 cho thấy:
(1) Trên thạch MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng (HM). Như vậy nhóm khuẩn lạc
này đại diện cho E. coli có trong mẫu phân khảo sát.
(2) Trên thạch SMAC có hai loại khuẩn lạc: HS và TS. Cả hai nhóm khuẩn lạc này
được xác định là E. coli. Như vậy nhóm nào cũng đại diện được cho E. coli có
trong mẫu phân khảo sát. Tuy nhiên, theo đặc điếm của những serotype E. co li
không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu trắng, thuộc nhóm STEC. Do đó,
nhóm khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC (TS) là nhóm E. coli có thế sản sinh độc tố
Shiga (Stx).
Ket quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ phân bò tiêu chảy được trình
bày ở bảng 4.1.

Từ bảng 4.1 ta thấy có 2/8 (25%) mẫu phân chứa E. coli mang gen độc lực. Trong đó,
2/8 (25,5%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen Stx2, 1/8 (12,5%) mẫu phát hiện được E. coli
mang gen hly.
Nếu phân lập vi khuẩn này trên môi trường MAC thì có 1/8 mẫu phân (12,5%) chứa E.
coli mang gen Stx2.
Neu phân lập trên thạch SMAC và chỉ căn cứ theo nhóm khuẩn lạc đỏ hồng (HS), có
1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen Stx2. Neu căn cứ theo nhóm khuẩn lạc trắng (TS) thì
có 2/8 (25%) mẫu chứa E. colỉ mang gen Stx2, 1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen hly lẫn
Stx2.
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại
diện cho E. coli trong phân bò tiêu chảy
Gen độc lực
Mầu
Loại khuẩn lạc
Thứ tư
stxl
Stx2
eae
hly
tí
sta
stb
Vt2e
HM TS
HS
X
1

X

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

X
X
2

X
X
X

3

X
X

4

X
X
X

5

X
X
X

6
X
X

7
X
X

8
X

Tổng

8

5

7

0

2

0

1

0

0

0

0

Tỉ lệ (%)

100

62,5

87,5

0

25%

12,5
0

0

0

0

0

Tóm lại, trên cùng môi trường phân lập E. co li, những mẫu phân có cùng khuẩn lạc
giống nhau vẫn không chắc được rằng chúng mang các gen độc lực như nhau. Tuy nhiên, nhóm
khuẩn lạc nào mà multiplex - PCR không phát hiện được gen độc lực thì nhóm đó không mang
E. coli gây bệnh. Vì tiêu chảy là triệu chứng rối loạn hấp thu tại đường một. Nguyên nhân của
triệu chứng này có nhiều nguồn gốc khác nhau. Hậu quả của biểu hiện này đều làm thay đổi hệ
vi khuẩn đường một. Neu xét theo nguồn gốc do E. coli thì tiêu chảy có thể do nhóm STEC,
ETEC hoặc EPEC.
Vì thế, từ 4 nhóm khuẩn lạc mang gen độc lực đã được xác định là 1HM, 1TS, 1HS và
2TS, chúng tôi tiến hành ly trích DNA từ các gốc khuẩn lạc riêng lẻ để xác định các gen độc
lực, kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen stxl, Stx2, eae, hly của một sổ khuẩn lạc E. coli
Gen độc lực
riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy
Mầu
Loại khuẩn lạc
Thứ tự khuẩn lạc

-

-

-

+

-

-

3

-

+

-

-

4

-

+

-

-

5

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

6
7
8
9
10
1
2
3
4

5
6

1HM

hly

+

2

1HS

eae

-

1

1TS

Stx2

-

+
+
+
+
+

+
+
+

7

-

8

-

9

-

1

-

+

-

-

2

-

+

-

-

+
+
+

2TS

3

-

+

-

-

4

-

+

-

-

5

-

+

-

-

6

-

+

-

-

7

-

-

-

-

8

-

+

-

-

9

-

-

-

1

-

+

-

-

2

-

-

-

-

3

-

+

-

+

4

-

-

-

-

5

-

-

-

-

6

-

-

-

-

+

-

-

-

7

8

-

+

Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy:
(1) 9 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi truờng MAC của mẫu số 1 (1HM),
multiplex - PCRphát hiện đuợc 8/9 (88,9%) khuẩn lạc mang gen Stx2 .
(2) 9 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi truờng SMAC của mẫu số 1 (1HS),
multiplex - PCR phát hiện đuợc 9/9 (100%) khuẩn lạc mang gen Stx2.
(3) 10 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi truờng SMAC của mẫu số 1(1 TS),
multiplex - PCRphát hiện 9/10 (90%) khuẩn lạc mang gen Stx2.
(4) 8 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi truờng SMAC của mẫu số 2 (2TS),
multiplex - PCR phát hiện đuợc 3/8 (37,5%) khuẩn lạc mang gen độc lực. Trong đó, 1/8
(12,5%) khuẩn lạc mang gen Stx2 và hly, 2/8 (25%) khuẩn lạc mang gen Stx2. Chỉ có 1 khuẩn
lạc (2TS3) mang gen hly trong tống số 8 khuẩn lạc riêng rẽ thuộc nhóm 2TS phát hiện đuợc gen
hly.
Tóm lại, nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có
mang gen độc lực đó. Cho nên chọn từng khuẩn lạc để nghiên cứu là công việc chi tiết cần thiết
để xác định thành phần các serotype của E. coli trong phân. Neu mục tiêu này không được đặt
ra cho nhà nghiên cứu thì việc lấy nhóm khuẩn lạc đại diện để phát hiện các gen độc lực là
bước đi thích hợp hơn.
4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy
Tương tự như mục 4.2, kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ
phân heo tiêu chảy trên hai môi trường MAC và SMAC lần lượt trình bày ở bảng 4.3 và bảng
4.4.
Ket quả ở bảng 4.3 cho ta thấy trong 9 mẫu phân heo tiêu chảy có 8/9 mẫu (chiếm
88,89%) phát hiện được E. coli mang gen độc lực, trong đó:
- 6 mẫu (66,67%) phát hiện được gen stb, chiếm tỉ lệ phát hiện cao nhất.

- 5 mẫu (55,56%) phát hiện được gen It.
- 3 mẫu (33,33%) phát hiện được gen Vt2e.
- 2 mẫu (22,22%) phát hiện được gen hly.
- 1 mẫu (11,11%) phát hiện được gen stxl.
- 1 mẫu (11,11%) phát hiên được gen eae.

- Không phát hiện được gen Stx2 và sta của E. coli trong 9 mẫu phân
heo tiêu chảy.
- Gen stb của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy chiếm tỉ lệ cao nhất
(66,67%). Blanco và ctv (1997) nhận thấy rằng gen stb xuất hiện với tần số cao nhất 78,4%
(58/74 mẫu) so với các gen độc lực khác của E. coli phân lập được từ phân heo con tiêu chảy
hoặc phù thủng. Ông kết luận rằng độc tố STb góp phần đáng kế vào triệu chứng tiêu chảy trên
heo. Điều này cũng phù họp với kết quả nghiên cứu của Moon và ctv (1986), Harel và ctv
(1991), Handl và ctv (1992), Lê Thị Mai Khanh (2004).
- Có 3/9 mẫu (33,33%) E. coli từ phân heo tiêu chảy mang gen Vt2e. Tuy độc tố VT2e
không liên quan đến bệnh trên người, nhưng nó chính là nguyên nhân gây bệnh phù thủng trên
heo con cai sữa (DesRosiers và ctv, 2001). Kỹ thuật PCR trở thành phương pháp phát hiện
nhanh và chính xác đế phát hiện E. coli gây bệnh phù thủng (Bertschinger và Fairbrother,
1999).
Bảng 4.3 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho
E. coli trong phân heo tiêu chảy
Mấu

Gen độc lực

Loại khuẩn lạc
Thứ tư
HM

TS

stxl

HS

X
1

X
X
X

2

X
X
X

3

X
X

4

X
X
X

5

X
X
X

6

X
X
X

7

X
8

X
X

Stx2

eae

hly

Vt2e
stb

tí

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

X
X
X

9

X
Tổng

7

Tỷ lệ (%)
77,78

9
100

9
100
11,11

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

1

0

1

2

5

0

6

3

11,11
0
22,22 55,56

66,67
0
33,33

- Khác với bò, ở heo nhóm ETEC chiếm đa số trong mẫu phân tiêu chảy (stb (66,67%),
It (55,56%)). Phân bò đuợc biết là nguồn luu cữu tự nhiên của nhóm EHEC còn heo thì không.
- Môi truờng SMAC chọn lọc nhóm STEC, kết quả ở bảng 4.3 ta thấy các mẫu 1HS,

1TS, 2HS hiện diện các gen stxl, eae, hly; các mẫu 1HM, 2HM âm tính.
Do kinh phí của đề tài có hạn, đối với phân heo tiêu chảy, các nhóm khuẩn lạc mang
gen độc lực thì chúng tôi chỉ chọn ngẫu nhiên khoảng 2-3 khuẩn lạc riêng lẻ đế ly trích DNA và
chạy multiplex - PCR phát hiện các gen gây độc. Ket quả đuợc trình bày ở bảng 4.4.
Ket quả ở bảng 4.4 cho thấy
(1) 4 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên MAC đuợc lấy ngẫu nhiên, multiplex - PCR chỉ
phát hiện đuợc 1/4 số khuẩn lạc đó mang gen stb (25%).
(2) 14 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi truờng SMAC, multiplex - PCR phát hiện
đuợc 1/14 khuẩn lạc mang gen eae (7,1%); 4/14 khuẩn lạc mang gen It (28,57%); 3/14 khuẩn
lạc mang gen stb (21,43%); 4/14 khuẩn lạc mang gen Vt2e (28,57%).

9 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi truờng SMAC, multiplex - PCR phát hiện đuợc 3/9
khuẩn lạc mang gen ỉt (33,33%); 4/9 khuẩn lạc mang gen stb (44,44%) và 1/9 khuẩn lạc mang
gen Vt2e (11,11%).Bảng 4.4 Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một sổ khuẩn lạc E. coli
riêng lẻ
phân lập được từ phân heo tiêu chảy
Mẫu

Loại khuẩn lạc

Gen độc lực

khuẩn lạc được chọn

{Eae, hlỳ)

{Eae, hlỳ)

2HS