Nghiên cứu thiết kế và chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo vào cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỖ HẢI LAN

ẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN
AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO
VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đỗ Hải Lan

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN
AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO
VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số: 62 42 01 12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS.TS. Lê Văn Sơn

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017


i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Lê
Văn Sơn, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam là người thầy tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này.
Tôi xin cảm ơn lãnh đạo và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng diểm công nghệ gen,
Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học,
Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi
mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình
học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS. Hoàng Văn An và
NCS. Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University, Hàn
Quốc trong quá trình tôi thực hiện luận án.
Tôi nhận được sự tạo điều kiện giúp đỡ về mọi mặt từ Ban Giám hiệu, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại học,
Trường Đại học Tây Bắc trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng
cảm ơn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng nghiệp
đã luôn động viên và khích lệ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 11 năm 2017
Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan

ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn
khoa học của GS.TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Lê Văn Sơn.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng 11 năm 2017

Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan


iii

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

MỞ ĐẦU .................................................................................................

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..........................

5

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn ..................................................................

5

1.1.1. Đặc điểm thực vật học ....................................................................

5

1.1.2. Vai trò và giá trị kinh tế ..................................................................

6

1.1.3. Tình hình phát triển cây sắn ...........................................................

8

1.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và hệ thống chuyển gen ở cây sắn...

10

1.2.1. Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống ....

10

1.2.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tái sinh cây...................................

11

1.2.3. Các nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây sắn .............................

15

1.2.4. Tạo cây sắn chuyển gen tăng cường hàm lượng tinh bột.................

18

1.3. Tinh bột và quá trình tạo tinh bột ở cây có củ ..............................

23

1.3.1. Giới thiệu về tinh bột ......................................................................

23

1.3.2. Cơ chế tổng hợp tinh bột ................................................................

24

1.3.3. Các enzim và gen liên quan tích lũy tinh bột .................................

26

1.4. Gen tổng hợp biểu hiện trong thực vật .........................................

31

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......

35

2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................

35

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................

36

2.2.1. Các phương pháp liên quan đến nuôi cấy mô, tái sinh cây sắn và
chuyển gen.....................................................................................

37

2.2.2. Các phương pháp liên quan đến tổng hợp gen và thiết kế vector
mang gen nhân tạo mã hóa enzyme AGPase phục vụ cho chuyển
gen ..........................................................................................

42

2.2.3. Các phương pháp liên quan đến phân tích các dòng cây chuyển

49


iv

gen ..................................................................................................
2.2.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu .....................................

52

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................

53

3.1. Kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy và tái sinh cây sắn ............

53

3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng tạo phôi soma ...................................

54

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh của phôi soma .......................

58

3.2. Kết quả tối ƣu hóa quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn

62

3.2.1. Tối ưu chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector chuyển gen vào
cây sắn ............................................................................................

62

3.2.2. Tối ưu vật liệu và phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens
vào cây sắn ..................................................................................................

64

3.2.3. Tối ưu thời điểm lây nhiễm và mật độ vi khuẩn A. tumefaciens
cho chuyển gen vào mảnh lá mầm cây sắn KM94 ........................

66

3.2.4. Tối ưu nồng độ (AS) và thời gian lây nhiễm vi khuẩn A.
tumefaciens ....................................................................................

66

3.2.5. Tối ưu thời gian đồng nuôi cấy ..............................................

68

3.2.6. Tối ưu loại kháng sinh và ngưỡng chọn lọc .............................

69

3.2.7. Phân tích cây sắn KM94/pCB-gus ...........................................

72

3.3. Kết quả thiết kế vector mang gen mã hóa AGPase ......................

73

3.3.1. Tổng hợp gen nhân tạo mã hóa AGPase ........................................

73

3.3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen AGPopt ....................

77

3.3.3.Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector
pBI121/AGPopt đã thiết kế......................................... .....................

79

3.3.4. Đánh giá sự biểu hiện của gen AGPopt trong cây thuốc lá .........

80

3.4. Chuyển gen AGPopt vào cây sắn ...............................................

88

3.4.1. Biến nạp gen AGPopt vào cây sắn KM94 nhờ A. tumefaciens
CV58/pGV2260 ...............................................................................

88

3.4.2. Phân tích cây sắn chuyển gen KM94/AGPopt ............................

90

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................

93


v
4.1. Nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn phục vụ chuyển gen ..................

93

4.2. Chuyển gen chỉ thị chọn lọc gus vào cây sắn..................................

99

4.3. Tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa enzyme AGPase và
thiết kế vector pBI121/AGPopt ......................................................

103

4.4. Chuyển gen AGPopt vào cây sắn KM94 ......................................

108

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................

111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN .......................................................

112

SUMMARY .............................................................................................

113

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................

117

PHỤ LỤC .................................................................................................


vi
DANH MỤC BẢNG
STT
Bảng 1.1.

Tên bảng

Trang

Danh mục 5 loại cây chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong
ngành nông nghiệp 2015 .......................................................

7

Bảng 1.2.

Diện tích, năng suất, sản lượng sắn năm 2016 .....................

9

Bảng 3.1.

Ảnh hưởng của 2,4D, picloram và NAA lên tỉ lệ tạo phôi
soma từ 6 loại vật liệu của 2 giống sắn KM140 và KM94 .... 56

Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của nồng độ picloram tới sự hình thành phôi
soma từ đỉnh chồi và lá non của hai giống sắn KM94 và
KM140 nuôi cấy in vitro ................................................

Bảng 3.3.

58

Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo chồi của phôi
soma từ lá non và đỉnh chồi của 2 giống sắn KM140 và
KM94 ............................................................................

Bảng 3.4.

59

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tạo chồi từ
phôi soma sau 4 tuần nuôi cấy ............................................

60

Bảng 3.5.

Khả năng tạo rễ của chồi ....................................................

61

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn A. tumefaciens, vector
và loại vật liệu lây nhiễm đến hiệu quả hiệu quả chuyển gen
gus vào cây sắn KM94 và KM140 .......................................

Bảng 3.7.

63

Ảnh hưởng của phương pháp và các loại vật liệu lây nhiễm
đến hiệu quả chuyển gen gus vào của cây sắn KM94 và
KM140 ..............................................................................

Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời điểm lây nhiễm đến
hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 ..........

Bảng 3.9.

65

66

Ảnh hưởng của nồng độ AS và thời gian lây nhiễm đến hiệu
quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 ..................

67

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ AS đến
hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 ..........

68

Bảng 3.11. Ảnh hưởng ngưỡng chọn lọc của kanamycin, neomycin và 70


vii
paromomycin lên hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây
sắn KM94 ..........................................................................
Bảng 3.12. Hiệu quả chuyển gen AGPopt vào cây thuốc lá K326 .........

81

Bảng 3.13. Hàm lượng tinh bột trong lá của cây thuốc lá
K326/pBI121/AGPopt .........................................................

87

Bảng 3.14. Khả năng tạo tạo chồi và ra rễ của các mẫu sắn KM94
/AGPopt .............................................................................

90


viii
DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Hình 1.1.

Diện tích trồng sắn phân theo vùng kinh tế ..........................

8

Hình 1.2.

Cơ cấu sử dụng sắn ở Việt Nam ...........................................

10

Hình 1.3.

Sơ đồ các bước tái sinh ở cây sắn .....................................

12

Hình 1.4.

Sơ đồ bốn hệ thống chuyển gen vào cây sắn..........................

16

Hình 1.5.

Các phản ứng sinh tổng hợp tinh bột.....................................

26

Hình 1.6.

Các enzim tham gia sinh tổng hợp tinh bột............................

19

Hình 1.7.

Cấu trúc của enzim AGPase...................................................

24

Hình 2.1.

Sơ đồ thí nghiệm .................................................................... 36

Hình 2.2.

Sơ đồ các bước thiết kế vector pBI121/AGPopt ...................

42

Hình 2.3.

Sơ đồ tổng hợp vector pBI121/AGPopt ...............................

47

Hình 2.4.

Sơ đồ các bước tách chiết enzim AGPase ............................

51

Hình 3.1.

Hình ảnh minh họa các bước chuẩn bị, tạo vật liệu khởi đầu

Trang

phục vụ tái sinh cây sắn.........................................................

53

Hình 3.2.

Các loại vật liệu cho nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn ...........

54

Hình 3.3.

Hình ảnh mẫu qua các giai đoạn tái sinh cây sắn khác nhau

62

Hình 3.4.

Kết quả nhuộm X-gluc với các loại vật liệu lây nhiễm.......

64

Hình 3.5.

Số lượng cây

KM94/pCB-gus được tạo thành trên môi

trường chọn lọc với các kháng sinh có nồng độ khác nhau ... 72
Hình 3.6.

Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng
sắn chuyển gen ...............................................................

Hình 3.7.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen AGPopt và glgC
ở E. coli K12..................................................................

Hình 3.8.

Hình 3.9.

73

75

Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ gen
AGPopt với glgC (E. coli K12).........................................

76

Sơ đồ cấu trúc gen AGPopt tổng hợp nhân tạo......................

77

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pBI121 và
pUCIDT/AGPopt bằng XbaI và SacI ................................

78


ix
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch vector pBI121 và
AGPopt (A); điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt
với cặp mồi đặc hiệu G336 F/G336KDEL R từ vector
pBI121/AGPopt (B)..........................................................

79

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt với cặp
mồi đặc hiệu G336F G336KDEL R....................................

79

Hình 3.13. Kết quả sau khi biến nạp vector pBI121/AGPopt vào A.
tumefaciens và điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt
từ

các

dòng

khuẩn

lạc

A.

tumefaciens

CV58/

pGV2260.........................................................................

80

Hình 3.14. Hình ảnh minh họa một số bước chuyển gen AGPopt bằng
A. tumefaciens CV58/PGV2260 vào cây thuốc lá ................

81

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt các dòng thuốc lá
chuyển gen..............................................................................

82

Hình 3.16. Kết quả lai Southern các mẫu thuốc lá chuyển gen
AGPopt...........................................................................

83

Hình 3.17. Kết quả lai Western kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPopt
trong các dòng thuốc lá mang gen AGPopt ..........................

85

Hình 3.18. Hoạt tính enzim AGPase trong lá các dòng thuốc lá mang
gen AGPopt và dòng cây không chuyển gen..........................

86

Hình 3.19. Hình ảnh minh họa kết quả tái sinh cây từ phôi soma
chuyển gen AGPopt của giống sắn KM94..........................

89

Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các
dòng cây sắn KM94 chuyển gen............................................

91

Hình 3.21. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt ở các dòng cây
sắn KM94 chuyển gen AGPopt bằng cặp mồi đặc hiệu
G336F/G336KDEL R......................................................

92


x
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Viết đầy đủ

Viết tắt
2,4D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

AM

Apical meristem

AS

Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone)

BAP

6-benzylaminopurin

bp

base pair

CaMV

Cauliflower mosaic virus

CBM

Cupressus Basal Medium

CIM

Callus induction medium

CMML

Cassava maturation medium by Li et al. (1996)

COM

Callus organogenic medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diaminne tetra acetic acid

FEC

Friable embryogenic callus

gus

β-1,4-glucuronidase

ILL

Immature leaf lobe

kb

Kilobase

LB

Luria bertani

LUC

Luciferase

MS

Murashige and Skoog medium

NAA

1-naphthaleneacetic acid

nptII

neomycin phosphotransferase II

OD

Optical density - Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

SCV

Stable cell volume

TPT

Triose phosphate/phosphate translocator


xi
v/p

Vòng / phút

WT

Wild type

YEB

Yeast Extract Beef


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt
đới của Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ, đáp ứng nhu cầu lương thực cho 800 triệu
người (Paul et al., 2016). Củ sắn có hàm lượng chất khô chiếm 30 - 60% (FAO,
2013) trong đó 80% là tinh bột, được sử dụng chủ yếu làm lương thực, thức ăn chăn
nuôi, công nghiệp tinh bột, đường, nhiên liệu sinh học (Abraham, 1996). Sản phẩm
từ sắn đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị ở nước ta, đạt kim ngạch xuất khẩu
1,32 tỷ USD trong năm 2015. Trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020, Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT) đã xếp cây sắn cùng với lúa và

ngô được ưu tiên phát triển, do vậy, diện tích trồng sắn đến nay đã đạt hơn 570
nghìn ha, tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam chỉ đạt 19,15 tấn ha ở mức trung
bình của thế giới (Bộ NN và PTNT, 2016).
Để phát triển cây sắn bền vững, cần thiết phải cải tạo giống sắn nhằm không
chỉ thu được lợi nhuận cao mà còn duy trì được độ phì nhiêu của đất. Hiện nay,
trong công tác chọn tạo giống cây trồng, công nghệ gen có ứng dụng công nghệ
nuôi cấy mô, tế bào đã trở thành công cụ hiệu quả để cải biến di truyền của những
cây có hạn chế trong sinh sản hữu tính và được nhân giống vô tính là chủ yếu như
cây sắn. Trên thế giới, nghiên cứu tạo cây sắn chuyển gen đã được bắt đầu từ thập
kỷ 90 của thế kỷ trước và đến nay đã có nhiều thành tựu (Beeching, 2013), đặc biệt
trong hướng cải tiến chất lượng củ như giảm hàm lượng cyanogen (Fregene, 2002;
Taylor et al., 2004), giảm tỷ lệ amylose trong tinh bột (Fregene, 2002), tăng hàm
lượng protein, β-caroten (Morillo et al., 2012; Ovalle et al., 2016), sắt, vitamin
(Fregene, 2002; Taylor et al., 2004; Sayre et al., 2011; Li et al., 2015; Narayanan et
al., 2016), tăng tinh bột (Ihemere et al., 2006)… Việc ứng dụng công nghệ chuyển
gen nhằm tác động vào các gen tham gia quá trình tổng hợp thủy phân tinh bột để
tăng khả năng tích lũy tinh bột ở cơ quan dự trữ hướng đến nâng cao năng suất cây
có củ nói chung và cây sắn nói riêng là hướng nghiên cứu đúng đắn và đang thu hút


2
được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu.
Trong sinh tổng hợp tinh bột, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) là
enzim điều hoà quá trình tổng hợp tinh bột ở bước chuyển glucose-1-phosphate
thành ADP-glucose, nguyên liệu để tạo thành tinh bột (Buchanan et al., 2002).
Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra AGPase là sản phẩm đơn gen
của gen glgC của vi khuẩn E.coli, có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thực
vật (Iglesias et al., 1993). Khi AGPase E. coli mang đột biến điểm G336D thay thế
glycin ở vị trí 336 bằng axit aspartic có thể hoạt động hiệu quả mà không cần chất
hoạt hóa fructose-1,6-bis phosphate, có ái lực cao hơn với cơ chất (ATP và

Glucose-1-phosphate) và giảm ái lực với chất ức chế AMP (Ihemere et al., 2006).
Vì vậy, nuôi cấy mô tái sinh cây sắn, tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa
AGPase với mã di truyền phù hợp với thực vật nhưng có ưu điểm của AGPase ở vi
khuẩn và mang đột biến mong muốn, đánh giá sự biểu hiện của gen tổng hợp trên
cây mô hình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chuyển gen tổng hợp nhân tạo
vào cây sắn góp phần tạo tiền đề cho cải biến năng suất và chất lượng một số giống
sắn đang được trồng phổ biến ở nước ta.
Với những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thiết ế v
chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo v o cây sắn (Manihot esculenta
Crantz)‖.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế và đánh giá hoạt động trên cây mô hình của vector mang gen mã hóa
AGPase đã được tối ưu khả năng biểu hiện trong thực vật (AGPopt) và triển khai
chuyển gen AGPopt vào cây sắn thông qua qui trình tái sinh và chuyển gen vào
giống sắn đang được canh tác tại Việt Nam.
3. Phạm vi nghiên cứu
Về sinh lý học thực vật nghiên cứu hoàn thiện các điều kiện nuôi cấy mô tế
bào, điều kiện tạo phôi soma và tái sinh cây từ phôi soma phục việc chuyển gen ở
cây sắn.


3
Về sinh học phân tử tập trung khai thác nguồn dữ liệu gen liên quan đến
AGPase, đề xuất tối ưu hóa mã di truyền cho phù hợp với thực vật và bổ sung đột
biến vào trình tự gen nhân tạo để gia tăng hiệu quả sinh tổng hợp tinh bột.
Về kỹ thuật di truyền tập trung thiết kế vector chuyển gen mang gen tổng hợp
nhân tạo, tiến hành kiểm tra hoạt động của vector và gen chuyển trên đối tượng
thuốc lá mô hình, đồng thời hoàn thiện qui trình chuyển gen và tiến hành chuyển
gen ở cây sắn.
4. Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây sắn thông qua phương pháp tạo
phôi soma.
(2) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chuyển gen gus vào cây sắn thông qua vi
khuẩn A. tumerfaciens.
(3) Nghiên cứu thiết kế cấu trúc, vector mang gen AGPopt và đánh giá sự
biểu hiện của gen AGPopt trên cây thuốc lá.
(4) Nghiên cứu chuyển gen AGPopt vào cây sắn.
5. Đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên quy trình nuôi cấy mô, tái sinh qua phôi soma trên cây sắn ở Việt
Nam được nghiên cứu hoàn thiện.
Gen mã hóa AGPase ở vi khuẩn E. coli có hoạt tính xúc tác tạo nguyên liệu
cho tổng hợp tinh bột được cải biến phù hợp biểu hiện trong hệ thống thực vật, tạo
đột biến (AGPopt) nâng cao hoạt tính enzim và được chuyển vào vector biểu hiện
thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen.
Quy trình chuyển gen chỉ thị gus đã được xây dựng thành công trên cây sắn
KM94 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Bước đầu xác định sự có mặt của gen nhân tạo AGPopt mã hóa AGPase trong
cây sắn KM94.
Ý nghĩa hoa học v thực tiễn
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro
thông qua phôi soma của một số giống sắn hiện đang được canh tác ở Việt Nam.


4
Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh
các giống sắn mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công
tác chuyển gen.
Quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn thông qua A. tumefaciens là cơ
sở khoa học để cải tiến giống sắn; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức
năng gen ở cây trồng.

Kết quả biến đổi, tổng hợp nhân tạo gen mã hóa AGPase (AGPopt), thiết kế
vector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá là cơ sở khoa học cho
việc tạo ra các giống sắn cao sản.
Bước đầu xác định được sự có mặt của gen AGPopt trong cây sắn chuyển gen,
là cơ sở cho các xác định tiếp theo về biểu hiện của gen AGPopt trong cây sắn.


5
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (ITIS, 2012), thuộc loài Manihot
esculenta, chi Manihot, tông Manihoteae,

phân họ Crotonoideae, họ

Euphorbiaceae, bộ Malpighiales (tên khác: khoai mì, cassava, tapioca...). Trong
chi Manihot có khoảng 98 loài nhưng chỉ có Manihot esculenta Crantz là loài
đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp (OECD, 2014).
Cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được trồng
cách đây khoảng 5.000 năm. Trung tâm phát sinh cây sắn được giả thiết tại vùng
Đông Bắc của Brazil thuộc lưu vực sông Amazon (OECD, 2014). Theo Hoàng Kim
và Phạm Văn Biên (1995), cây sắn được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ
XVIII, hiện chưa có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên. Hiện tại,
sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều ở
châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (OECD, 2014).
Sắn có 98 loài hoang dại nhưng được chia thành hai nhóm chính: sắn ngọt và
sắn đắng (OECD, 2014). Sắn là cây đa bội thể phức tạp, dị hợp, bộ nhiễm sắc thể 2n
= 36, thể tam bội và tứ bội có số nhiễm sắc thể tương ứng 54 và 72 (OECD, 2014).

Sắn có khả năng chịu đựng trong điều kiện sống bất lợi như khí hậu khô hạn, đất
giàu hay nghèo dinh dưỡng, đòi hỏi tối thiểu lượng phân bón, thuốc trừ sâu và nước.
Cây sắn là thực vật trung gian giữa C3 và C4 (Saithong et al., 2013; Zhang et al.,
2016). Nhiệt độ tối ưu cho quang hợp của các cây trồng trên đồng ruộng là 35 oC
nhưng phạm vi quang hợp tối ưu từ 25 đến 45oC (El-Sharkawy et al., 2012). Vì vậy,
cây sắn thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới.
Thân cây sắn có tính chất thân gỗ, có thể mọc cao từ 2 - 4 m, là bộ phận chính
để làm giống trong sản xuất. Tại mỗi mắt là một điểm sinh trưởng của chồi nách, tại
đây sẽ phát triển thành cành bên hoặc thân cây mới sau khi trồng. Số lượng thùy của


6
lá trưởng thành tương đối ổn định đối với một giống sắn. Sắn có hoa đơn tính, cả
hoa cái và hoa đực cùng nằm trên một chùm hoa, sau khi hoa cái được thụ phấn,
bầu nhụy cái phát triển thành quả (OECD, 2014).
Rễ củ được hình thành do sự phân hóa hình thành của rễ con và sự phình to
của rễ (phần rễ mọc ngang). Củ có thể dài tới 1m (trung bình từ 30 - 60cm), đường
kính củ có thể lên đến 14cm (trung bình từ 3 - 7cm). 3 tuần sau khi trồng đã thấy
xuất hiện tầng thứ cấp thể hiện sự phân hóa hình thành củ sắn. Tốc độ lớn của củ
chia thành 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: 2 - 3 tháng đầu sau khi hình thành củ, tốc độ lớn của củ chậm.
Giai đoạn 2: Từ tháng thứ 6 - 8 tốc độ lớn của củ rất nhanh.
Giai đoạn 3: Sau giai đoạn 2 đến thu hoạch, tốc độ lớn của củ giảm dần
(OECD, 2014)
Dinh dưỡng, độc tố: Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khô 20%; trong đó tinh bột
chiếm 80%; chất protein, béo, xơ, tro trong 100 g được tương ứng là 0,8 - 2,5 g, 0,2
- 0,3 g, 1,1 - 1,7 g, 0,6 - 0,9 g; chất muối khoáng và vitamin trong 100 g củ sắn là
18,8 - 22,5 mg Ca, 22,5 - 25,4 mg P, 0,02 mg B1, 0,02 mg B2, 0,5 mg PP. Trong củ
sắn, hàm lượng các acid amin không đươc cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu các
acid amin chứa lưu huỳnh. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tùy từng giống, vụ

trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích (Wheatley và Chuzel,
1993). Giá trị dinh dưỡng của sắn còn được đánh giá qua hàm lượng carotenoid tích
lũy trong củ (Carvalho et al., 2016).
Trong lá và củ sắn ngoài các chất dinh dưỡng cũng chứa một lượng độc tố
(HCN) đáng kể. Các giống sắn ngọt có 80 - 110 mg HCN kg lá tươi và 20 - 30
mg kg củ tươi. Các giống sắn đắng chứa 160 - 240 mg HCN kg lá tươi và 60 - 150
mg kg củ tươi. Tuỳ theo giống, vỏ củ, lõi củ, thịt củ, điều kiện đất đai, chế độ canh
tác, thời gian thu hoạch mà hàm lượng HCN có khác nhau (Wheatley and Chuzel,
1993).
1.1.2. Vai trò và giá trị kinh tế của cây sắn
Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và lương


7
thực, thực phẩm.
Củ sắn dùng để làm thực phẩm như ăn tươi, chế biến sắn lát khô, tinh bột sắn,
làm thức ăn gia súc, bánh kẹo, đường glucose tinh thể, mạch nha giàu maltose, mì
ăn liền, bún, miến, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, bột ngọt...(Salvador
et al., 2014). Lá sắn ngọt là loại rau xanh giàu đạm rất bổ dưỡng và để nuôi cá, nuôi
tằm. Lá sắn đắng ủ chua hoặc phơi khô để làm bột lá sắn dùng chăn nuôi lợn, gà,
trâu, bò, dê v.v...
Sắn là một mặt hàng quan trọng trong ngành công nghiệp chủ yếu là do tinh
bột của nó được sử dụng trong việc sản xuất các mặt hàng khác nhau. Tinh bột sắn
có nhiệt độ hồ hóa thấp nên dễ dàng chuyển hóa thành các đường đơn giản như
sorbitol, mannitol và maltol, là nguyên liệu để sản xuất kem đánh răng, mỹ phẩm,
dầu sơn, ascorbic acid, polyester, polyethylene nhựa (Ren, 1996), maltodextrin,
lysine, acid citric, siro glucose, hồ vải, hồ giấy, colender, phủ giấy, bìa các tông,
phụ gia dược phẩm, sản xuất màng phủ sinh học, chất giữ ẩm (Abraham, 1996).
Đặc biệt, tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho quá trình lên men để sản
xuất etanol, nhiên liệu sinh học.

Cây sắn đã mang lại hàng tỷ USD giá trị xuất nhập khẩu và thương mại cũng
như tạo ra hàng triệu việc làm và thu nhập cho người nông dân, doanh nghiệp ở
nhiều quốc gia.
Năm 2015, cây sắn vẫn chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong ngành nông
nghiệp, cụ thể: đứng thứ 4 sau cây lúa, cà phê và cây điều về sản lượng và kim
ngạch xuất khẩu (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Danh mục 5 loại cây chiếm im ngạch xuất hẩu cao trong ng nh nông
nghiệp 2015 (Nguồn: Hiệp hội sắn Việt Nam, 2016)
STT

Loại cây

Sản lƣợng (nghìn tấn)

Kim ngạch xuất khẩu (tỷ USD)

1
2
3
4
5

Lúa
Cà phê
Điều
Sắn
Tiêu

6.590
1.340

328,8
4.110
132,6

2,8
2,67
2,4
1,32
1,26


8
1.1.3. Tình hình phát triển cây sắn
Theo báo cáo của Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên Hiệp quốc FAO, cây
sắn được đánh giá là loại cây lương thực có tiềm năng phát triển to lớn, được dự
đoán là cây trồng của thế kỷ XXI. Cây sắn hiện nay đã chuyển đổi vai trò từ cây
lương thực, thực phẩm thành cây công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao.
Toàn thế giới có trên 100 nước trồng sắn với tổng diện tích đạt 20,82 triệu ha,
tổng sản lượng đạt 269,12 triệu tấn và năng suất củ tươi bình quân đạt 12,92 tấn ha.
Khu vực Châu Phi có diện tích trồng và sản lượng sắn lớn nhất, tuy nhiên, khu vực
Châu Á lại là nơi tạo ra sản lượng cao nhất (FAOSTART, 2015). Các giống sắn
được trồng tại Việt Nam chủ yếu là: KM94, KM140, KM98-5. Hiện nay, ở Việt
Nam, giống sắn KM94 được trồng nhiều nhất chiếm 75,5% tổng diện tích trồng sắn
cả nước, tiếp đó là giống KM140 chiếm 5,4% còn lại là giống khác (Hiệp hội sắn
Việt Nam, 2016).
Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của các vùng sinh
thái nông nghiệp. Các vùng trồng sắn chính của Việt Nam được tập trung chủ yếu là
Bắc Trung bộ, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam bộ và Trung du
miền núi phía Bắc. Tổng diện tích sắn của 5 vùng sinh thái này chiếm khoảng 97%
diện tích sắn cả nước. Bắc Trung bộ và Duyên hải miền Trung là vùng sản xuất sắn

nhiều nhất cả nước, Tây Nguyên là vùng thứ 2, tập trung chủ yếu ở bốn tỉnh Kon
Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.
ĐB Sông Cửu Long
Đông Nam Bộ
Tây Nguyên

DH Nam Trung Bộ
Bắc Trung Bộ
TD và MN phía Bắc
ĐB Sông Hồng
ha

Hình 1.1. Diện tích (ha) trồng sắn phân theo vùng

inh tế

(Nguồn: Bộ NN và

PTNT) tính đến ngày 15 6 2016.
ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long, DH: Duyên hải, TD và MN: Trung du và
miền núi, ĐB: Đồng bằng


9
Diện tích trồng sắn có xu hướng tăng dần theo các năm, trong năm 2016, diện
tích trồng sắn trên cả nước đạt 570,4 nghìn ha, trong đó khu vực miền Nam có sự
mở rộng khá mạnh về diện tích trồng sắn, còn miền Bắc có sự thu hẹp (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lƣợng sắn năm 2016 (Nguồn: Bộ NN và PTNT)
Diện tích (nghìn ha)
Năm

Tổng

Miền

Miền

Bắc

Nam

Năng suất (tạ/ha)
Tổng

Miền

Miền

Bắc

Nam

Sản lƣợng (nghìn tấn/ha)
Tổng

Miền

Miền

Bắc

Nam

2015

567.9

188.6

379.3

189.1

146.6

210.2

10739.9

2765.2

7974.7

2016

570.4

188.0

382.4

191.5

149.0

212.4

10925.1

2802.00

8123.10

2.5

-0.6

3.1

2.4

2.4

2.2

185.2

36.8

148.4

100.4

99.7

100.8

101.3

101.7

101.0

101.7

101.3

101.9

So sánh
2016/2015
(+/-)
So sánh
2016/2015
(%)

Dựa trên việc tính toán quy hoạch vùng trồng nguyên liệu, diện tích trồng sắn
năm 2016 / 2017 tiếp tục có sự mở rộng, mặc dù vậy, diện tích trồng sắn cũng sẽ
khó tăng mạnh như năm 2015 do vấp phải một số rào cản như (i) diện tích trồng mía
và cây ăn quả có xu hướng mở rộng, (ii) đầu ra cho sản xuất tinh bột sắn và sắn lát

từ đầu năm 2016 trở lại đây gặp khó khăn khiến cho giá sắn củ nguyên liệu duy trì ở
mức thấp (AgroMonitor, 2016).
Năng suất sắn của Việt Nam hiện nay đứng khoảng thứ 10 trong số các quốc
gia năng suất cao. Tuy nhiên, năng suất bình quân tăng từ 17 tấn ha lên 19,1 tấn ha
nhưng vẫn chỉ tương đương 50% so với năng suất sắn tại Ấn Độ, thấp hơn so với
một số nước Đông Nam Á như Lào (25,17 tấn ha), Indonesia (22,86 tấn ha), Thái
Lan (21,82 tấn ha) (AgroMonitor, 2016).
Cơ cấu sử dụng sắn Việt Nam hàng năm được chia thành 03 nhóm chính gồm:
37% cho sản xuất tinh bột, 33% cho xuất khẩu và 30% cho sản xuất thức ăn chăn
nuôi (Nguyễn Hữu Hỷ, 2016).


10

30%

33%
Xuất khẩu

37%

Tinh bột
Thức ăn chăn nuôi

Hình 1.2. Cơ cấu sử dụng sắn ở Việt Nam (Nguồn: Nguyễn Hữu Hỷ, 2016)

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI) đã tính toán nhiều
mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến năm
2020. Năm 2020, sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,1 triệu tấn, trong đó sản xuất
sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã phát triển

khoảng 0,4 triệu tấn. Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,6
triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn. Khối lượng sản phẩm sắn
toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu tấn và
thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn. Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản
phẩmsắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98% và
0,95%. Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản
lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn. Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm
lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4%. Châu Mỹ La tinh giai
đoạn 1993 - 2020, ước tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm là 1,3%, so với
châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 - 0,96%. Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan
trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á nơi cây sắn
có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa
và mía (FAO, 2013).
1.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro v hệ thống chuyển gen ở cây sắn
1.2.1. Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống
Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT), Colombia và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế
(IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và tạo
các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô và cải


11
thiện chất lượng sắn ở châu Phi (Manyong et al., 2000; Nweke et al., 2002), châu Á
và châu Mỹ (Jennings và Iglesias, 2002).
Tại Việt Nam, nghiên cứu chọn tạo giống sắn hơn 20 năm qua, Trung tâm
Nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, ĐH Nông lâm Thái Nguyên,
Trung tâm Nghiên cứu và phát triển cây có củ (Viện CLT-CTP) đã thông qua các
chương trình quốc gia, quốc tế để thu thập, bảo quản, đánh giá và sử dụng nguồn
gen giống sắn; lai tạo, chọn lọc và chuyển giao giống sắn triển vọng ở Việt Nam đã
đạt được những thành tựu có ý nghĩa, tạo các giống mới HL20, HL23 và HL24

(Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, giai đoạn 19861993), KM60, KM94, SM937-26, KM95 và KM98-1 (mạng lưới nghiên cứu và
chuyển giao tiến bộ kỹ thuật về sắn của Việt Nam (VNCP), Trung tâm Nông nghiệp
nhiệt đới Quốc tế (CIAT), Công ty VEDAN (Đài Loan), giai đoạn 1989-2007),
KM98-7, NA1, SA06, KM21-12 (ĐH Nông lâm Thái Nguyên, Trung tâm Nghiên
cứu và phát triển Cây có củ, Viện Di truyền nông nghiệp, giai đoạn 2007- 2015),
KM98-5, KM140, HL-S10 và HL-S11 (Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm nông
nghiệp Hưng Lộc). Bộ giống sắn đang trồng đại trà tại các địa phương chưa thật sự
đáp ứng cho việc thâm canh tăng năng suất và rải vụ. Nhiều tỉnh hiện đang trồng
chủ yếu là giống KM94, KM60. Các phương pháp tạo giống sắn mới được thực
hiện chủ yếu là lai tạo kết hợp với chọn lọc và gần đây có sử dụng phương pháp
chiếu xạ gây đột biến (Phạm Thị Nhạn và Nguyễn Hữu Hỷ, 2015). Mặc dù với
thành tựu như trên, phương pháp lai hữu tính truyền thống có hạn chế là cần từ 7-8
năm mới có thể tạo ra giống mới. Do vậy, ngoài phương pháp chiếu xạ rút ngắn thời
gian chọn tạo giống, ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống phân tử giúp
tăng cường khả năng biến đổi những tính trạng mục tiêu, đó là một phương pháp tốt
để cải tiến hàm lượng tinh bột ở thực vật.
1.2.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tái sinh cây
Công nghệ chuyển gen ở sắn cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến
đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế bào toàn năng của hệ thống


12
nuôi cấy mô. Đây là mục tiêu cho chuyển gen, sau khi chọn lọc thành công tái sinh
cây chuyển gen hoàn chỉnh (Su, 2002).
Vật liệu nuôi cấy thường được dùng là chồi, hoặc thùy lá non của các giống
sắn có nguồn gốc khác nhau từ các bộ sưu tập của IITA (Hankoua et al., 2006), Ấn
Độ (Konan et al., 1997), CIAT (Zhang et al., 2001).
Quá trình tái sinh cây trải qua các bước cơ bản như sơ đồ dưới đây (hình 1.3):

Hình 1.3. Sơ đồ các bƣớc tái sinh ở cây sắn (Nguồn: Raemakers et al., 1997)

Vật liệu khởi đầu (lá, đỉnh sinh trưởng) được sử dụng để cảm ứng tạo phôi
soma qua tiền phôi sơ cấp. Phôi soma có thể chuyển hóa theo nhiều hướng:
- Phôi soma có thể cho nảy mầm trực tiếp tạo thành cây con.
- Phôi soma chuyển hóa tiếp thành phôi soma thứ cấp.
- Phôi soma được chọn lọc, nuôi cấy tạo thành mô sẹo tơi tiền phôi,
được làm trưởng thành để trở lại phôi soma.
- Từ mô sẹo tơi tiền phôi có thể tạo thành tế bào trần và ngược lại.
Bƣớc 1. Cảm ứng tạo phôi soma
Vật liệu ban đầu là mô phân sinh đỉnh (AM) 2 - 6 mm hoặc thùy lá non (ILL)
được đặt trên môi trường muối và vitamin MS (1962) bổ sung 20% sucrose và các
chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4-D hoặc picloram) với các nồng
độ khác nhau 1 - 8mg/l 2,4-D (Stamp et al., 1987), 12 mg/l picloram (Li et al., 1996;
Zhang et al., 2001) đặt trong tối ở 26◦C trong 1 - 2 tuần để cảm ứng tạo phôi soma.