Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba loài hopea đang bị đe dọa ở việt nam sao hải nam (hopea hainanensis merr chun), sao hòn gai (hopea hongayensis tardieu) và sao mặt quỷ (hopea mollissima c y wu)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Tên đề tài:
Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố ba loài Hopea
đang bị đe dọa ở Việt Nam
Sao Hải Nam (Hopea hainanensis Merr. & Chun),
Sao Hòn Gai (Hopea hongayensis Tardieu)
và Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu)

Họ tên học viên

: Trần Thu Hƣơng

Ngƣời hƣớng dẫn

: TS.Nguyễn Thị Phƣơng

Trang
Chuyên ngành
Mã số

: Sinh học thực nghiệm

: 60420114

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1


Hà Nội, 2014

Mở đầu
Hiện nay, ở Việt Nam, họ Dầu được biết có sáu chi
(Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea),
hầu hết là loài bản địa và đặc hữu. Các loài họ Dầu hiện chỉ còn
gặp trong các khu bảo tồn đã được quy hoạch vì trong những năm
qua, do chiến tranh tàn phá, do giá trị thương mại và nhu cầu của
người dân địa phương khai thác quá mức mà diện tích rừng nói
chung và rừng hỗn giao cây họ Dầu nói riêng đã bị suy giảm
nghiêm trọng.
Trong các loài họ Dầu, Sao hải nam, Sao hòn gai và Sao
mặt quỷ là những loài phân bố hẹp, chỉ có ở Việt Nam và Trung
Quốc, Đây là loài có nhiều giá trị cả về mặt khoa học, giá trị kinh
kinh tế cũng như giá trị y học. Tuy nhiên hiê ̣n nay ba loài này
đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng do mức độ suy giảm nơi
sống và viê ̣c khai thác không hợp lý. Mă ̣c dù vâ ̣y , cho đế n nay
chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu riêng về các loài này ở
Việt Nam. Cho đến nay, chúng ta chưa có các số liệu cụ thể, thông
tin về di truyền, các yếu tố ảnh hưởng xấu đến sự tồn tại của ba
loài này liên quan đến tác động của con người cũng chưa được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

nghiên cứu, vì thế rất khó để nâng cao hiệu quả của công tác bảo
tồn và phát triển bền vững chúng.
Chính vì v ậy, chúng tôi đề xuất thực hiện nghiên cứu về
“Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba
loài Hopea đang bị đe dọa ở Việt Nam: Sao hải nam (Hopea
hainanensis Merr. & Chun), Sao hòn gai (Hopea hongayensis
Tardieu) và Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu)”như một
bước nghiên cứu đầu tiên nhằm cung cấp thông tin cần thiết cho
về di truyền, bổ sung cơ sở dữ liệu về di truyền của ba loài này ở
Việt Nam, đồng thời góp phần phục vụ công tác bảo tồn và sử
dụng bền vững loài của cộng đồng dân cư địa phương.
Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng cơ sở dữ liệu về di truyền của ba loài Hopea
quý của Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể
của ba loài Sao Hòn gai (Hopea hongayensis Tardieu) tại hai đảo
Ba Mùn và đảo Cái Lim, VQG Bái Tử Long, tỉnh Quảng Ninh,
Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu) tại phân khu Khe Rỗ,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3


khu BTTN Tây Yên Tử, tỉnh Bắc Giang và Sao Hải nam (Hopea
hainanensis Merr. & Chun) tại VQG Bến En, tỉnh Thanh Hóa.
 Xác định các đặc điểm di truyền ba vùng gen lục lạp bao

gồm matK, psbA – trnH và rbcL bằng phân tích trình tự gen.
 Xác định mối quan hệ di truyền của ba loài này với một số
loài họ Dầu khác ở Việt Nam trên cơ sở trình tự ba vùng gen lục
lạp nêu trên.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về di
truyền cho danh lục các loài thực vật quý hiếm đang bị đe dọa
tuyệt chủng ở Việt Nam, góp phần cho công tác bảo tồn nguồn
gen, làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền
vững ba loài gỗ quý này của Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

4


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về cây họ Dầu và ba loài nghiên cứu
Họ Dầu (Dipterocarpaceae) bao gồm 17 chi và khoảng 680
loài chia thành ba phân họ: Dipterocarpoideae gồm 13 chi và
khoảng 600 loài ở vùng nhiệt đới châu Á và Malesia;
Pakaraimoideae là đặc hữu vùng cao Guaianan – vùng nhiệt đới
Nam Mỹ và Monotoideae với 3 chi và 30 loài ở vùng nhiệt đới
Châu Phi và Nam Mỹ. Các chi lớn nhất trong họ Dầu là Shorea
(khoảng 250 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và
Vatica (65 loài). Các loài cây họ Dầu đã tạo nên một họ thực vật
độc đáo và nổi tiếng nhất của vùng nhiệt đới. Hiện nay gỗ của các
loài cây họ Dầu đang chiếm thị phần lớn trên thị trường gỗ thế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

5


giới nên rõ ràng chúng đang đóng một vai trò quan trọng đối với
nhiều nước, nhất là các nước Châu Á mà đặc biệt là các nước
Đông Nam Á. Tuy nhiên, do khai thác quá mức và chuyển đổi
mục đích sử dụng đất mà diện tích rừng nói chung và cây họ Dầu
nói riêng đã bị suy giảm nghiệm trọng.
Có khoảng 45 loài cây họ Dầu với 6 chi được tìm thấy ở
Việt Nam, chúng là những cây rừng phổ biến và đóng vai trò quan
trọng về giá trị sinh thái và kinh tế. Phần lớn các cây họ Dầu ở
Việt Nam là bản địa và đặc hữu. Do giá trị thương mại và nhu cầu
của người dân địa phương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá
mức. Hơn nữa, trong nhiều năm, dưới áp lực tăng trưởng kinh tế
nhanh là hậu quả của sự suy giảm diện tích rừng và tăng mức độ
phân cắt của các mảnh rừng còn lại. Kết quả này làm ảnh hưởng
đến nơi sống của cây họ Dầu.
Sao hải nam(Hopea hainanensis Merr. et Chun), Sao hòn
gai (Hopea hongayensis Tardieu), Sao mặt quỷ (Hopea mollissima
C.Y.Wu) đều là những loài đặc hữu, có đặc điểm hình thái gần
giống nhau, phân bố rải rác trên khắp Việt Nam. Ba loài đều nằm
trong Sách đỏ Việt Nam và được tổ chức IUCN xếptrong các mức
phân hạng khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

6


Tổng quan về ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong
nghiên cứu phân loại và di truyền thực vật

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự
sai kháctrong cấu trúc phân tử để có được các thông tin về sự sai
khác di truyền giữa các loài.Phân loại học phân tử dựa trên
nguyên lý mỗi sinh vật sống đều mang vật chất di truyền là các
phân tử DNA(ở một số virus là RNA),các sinh vật có họ hàng gần
gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu trúc phân tử, ngược lại
những sinh vật có họ hàng xa nhau sẽ cho thấy những đặc điểm
cấu trúc khác nhau.Kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng
rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa
dạng di truyền, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu
trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết mối nghi ngờ về phân
loại. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần
đánh giá đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn
và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế
giới cũng như ở Việt Nam.
Tổng quan về hệ gen lục lạp sử dụng trong nghiên cứu
Trong số các gen lục lạp thì matK là 1 trong những gen tiến
hóa nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550bp và mã hóa cho
enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các in-tron loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

7


hai trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hóa nhanh và có
mặt trong hầu hết các loài thực vật nên được sử dụng như một chỉ
thị trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài và phát
sinh loài ở thực vật. CBOL (Consortium for the Barcode of Life)
đã thử nghiệm matK trên 550 loài thực vật và thấy rằng hơn 90%
mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử

dụng 1 cặp mồi đơn và kiến nghị sử dụng matK là một trong
những chỉ thị chuẩn cho việc phân loại thực vật. Ngoài ra,vùng
gen lục lạp rbcL, vùng psbA-trnH gần đây đã trở thành một công
cụ phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài phân tử thực vật ở
cấp độ phân loại thấp và phù hợp cho nghiên cứu DNA. Vùng này
có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao
(100% các loài đã được nghiên cứu).
CHƢƠNG II. NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
TT

Tên khoa học

Tên Việt Nam

Địa điểm thu
mẫu

Tọa độ thu mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Hopea
hongayensis

Hopea
hongayensis
Hopea
hainamensis
Hopea
mollissima

Hopea odorata
Dipterocarpus
intricatus

Sao Hòn gai

Sao Hải nam

VQG Bến
Thanh Hóa

21o09’N-21o13’E,

Sao Mặt quỷ

Phân khu Khe Rỗ,
khu BTTN Tây
Yên Tử, Bắc
Giang

Sao Đen

VQG Bến
Thanh Hóa

En,

19°35’N105°30’E, 100m

Dầu Lông

Khu BTTN Bình
Châu-Phước Bửu,
Bà Rịa-Vũng Tàu

10°28’N107°35’E, 100m

dyeri

Nàng

Dipterocarpus
tuberculatus
Parashorea

120m

Sao Hòn gai

Dầu Song

costatus

21°02’N107°35’E,

Đảo Cái Lim,
VQG Bái Tử
Long,
Quảng
Ninh

Dipterocarpus

Dipterocarpus

Đảo Ba Mùn,
VQG Bái Tử
Long,
Quảng
Ninh

En,

Tân Cửu, Vĩnh
Cửu, Đồng Nai

21°06’N107°33’E, 150m

19°35’N105°30’E, 100m

130m

11°12’N107°09’E, 129m
10°56’N106°59’E, 130m

Dầu Mít

VQG Bù Gia
Mập, Bình Phước

Dầu Đồng

VQG York Đôn,
Buôn Đôn, Đắk

Lắk

12°47’N107°35’E, 150m

VQG
Phương,

20°19’N-

Chò Chỉ

Cúc
Ninh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9


Bình

chinensis

105°36’E, 150m

Trình tự mồi sử dụng
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Vùng
gene

Mồi xuôi

Mồi ngƣợc

Nhiệt độ
bắt cặp
mồi(0C)

Độ dài
sản
phẩm
PCR

50

900

56

700

CGA TCT ATT CAT TCA
ATA TTT C

TCT AGC ACA CGA AAG
TCG AAG T

rbcLa

TCT AGC ACA CGA AAG

TCG AAG T

CTT-CGG-CAC-AAA ATA
CGA AAC GAT CTC TCC
A

rbcLc

TGA AAA CGT GAA TTC
CCA ACC GTT TAT GCG

GCA GCA GCT AGT TCC
GGG CTC CA

56

700

GTT ATG CAT GAA CGT
AAT GCT C

CGC GCA TGG TGG ATT
CAC AAT CC

48

300

matK

trnHpsbA

Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát thu mẫu
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Phương pháp PCR với mồi nghiên cứu
Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Đọc trình tự
Phân tích số liệu
Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng cây phát sinh chủng
loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

10


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiện trạng phân bố và đặc điểm hình thái của ba loài Sao
(Hopea) nghiên cứu
3.1.1. Loài Sao hải nam (Hopea hainanensis Merr. et Chun) tại
VQG Bến En-Thanh Hóa
Loài Sao hải nam (hay còn gọi là Sao lá to) ở đây đang bị
khai thác mạnh, chỉ còn gặp rải rác. Tại khu vực này, chúng tôi đã
tìm thấy và thu được mẫu của 19 cá thể Sao hải nam. Các cây Sao
hải nam có kích thước lớn hầu như đã không còn, chỉ còn lại các
cây có kích thước trung bình và nhỏ cùng cây tái sinh
3.1.2. Loài Sao hòn gai (H.hongayensis Tardieu) (synonym
H. chinensis (Merr.) Hand.-Mazz.) tại đảo Ba Mùn và đảo Cái
Lim-VQG Bái Tử Long-Quảng Ninh
Quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba Mùn ngoài vùng phân

bố rất tập trung, trong một khu đất rộng khoảng hai hecta có trên
hơn 100 cá thể, các cá thể Sao hòn gai ở đây tái sinh rất tốt.
Trong khu quần thể Sao hòn gai hầu như ngoài các cây bụi nhỏ
thì không có loài cây vượt tán nào khác ngoài Sao hòn gai.
Chúng tôi tìm thấy hai quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba mùn,
cách nhau khoảng 5km, mỗi quần thể phân bố tập trung trong
khu đất rộng khoảng 2 -3 ha với khoảng hơn 100 cá thể. Ngoài ra
trên đường đi vẫn bắt gặp một vài cá thể Sao hòn gai nằm rải rác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

11


tách biệt với nhóm quần thể trung tâm.
3.1.3 Loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu.) tại Khu
BTTN Tây Yên Tử-Bắc Giang
Tổng số 16 cá thể Sao mặt quỷ đã được chúng tôi tìm thấy
và thu mẫu, tất cả các cá thể Sao mặt quỷ được tìm thấy đều là
những cá thể trưởng thành,cao từ 30-40m, mọc ở nơi có độ ẩm
cao (gần suối hoặc vùng có tầng đất thịt dày nhưng thoát nước),
chủ yếu ở độ cao khoảng 300, không nhìn thấy có cây con xung
quanh. Giả thiết có thể là đã có các cây con nhưng sau đó cây
con đã bị chết do thiếu ánh sáng, bởi những nơi có cây Sao mặt
quỷ xuất hiện đều là những nơi đất ẩm, mật độ cây dày đặc, rất ít
ánh sánh tự nhiên, hoặc cũng có thể do rễ cây con không bám
được tới đất do lớp lá rụng ở đây khá dày
Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái sai khác giữa loài Sao mặt quỷ
và Sao hòn gai
TT

1

Đặc
điểm

Lá

Sao mặt quỷ
(H.mollissima
C.Y.Wu)
Có nhiều lông hình sao
trên cả 2 mặt lá, mặt
sau nhiều hơn mặt
trước

Sao hòn gai (H.hongayensis
Tardieu) (synonym H.
chinensis (Merr.) Hand.Mazz.)
Rất ít hoặc hầu như không
có lông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

12


2

Cuống
lá

Có nhiều vết nứt

Không nứt

3

Hoa

Cuống hoa màu xanh

Cuống hoa màu hồng nhạt

3.2 Đặc điểm di truyền của ba loài Hopea nghiên cứu
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% cho thấy
DNA tổng số thu được khá tốt, DNA không bị gãy (hình 3.7). Kết
quả đo OD cho chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong
khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết
cao)

Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số chín loài Dầu nghiên cứu
Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba
Mùn; 4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8Dầu lông; 9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13

3.2.1 Đặc điểm vùng gen matK
Gen matK của ba loài nghiên cứu cùng sáu loài họ Dầu
khác được thu thập trong quá trình thu mẫu đã được khuyếch đại
bằng cặp mồi đặc hiệu matK-F và matK-R. Phản ứng PCR được
thực hiện trên máy PCR system 9700. Kết quả PCR sau đó được
điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.Kết quả điện di kiểm tra cho
thấy sản phẩm PCR là một băng đậm, sắc nét có kích thước
khoảng 900bp đúng như dự kiến, chứng tỏ phản ứng PCR đã được
thực hiện tốt, mồi sử dụng có độ đặc hiệu cao. Để kiểm tra độ
chính xác của sản phẩm PCR cũng như phân tích các đặc điểm
phân tử của gen matK, sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và
tiến hành đọc trình tự trên máy ABI 3100, sử dụng kit Bigdye
terminator.Kết quả giải trình tự sau đó được kiểm tra bằng chức
năng Blast của NCBI. Kết quả kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm
PCR của chúng tôi thu được chính xác là các đoạn DNA tương
ứng với các vùng gen matK.
Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu
sau khi cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so
sánh sự sai khác bằng phần mềm Mega 5.0.Kết quả giải trình tự
sau đó được kiểm tra bằng chức năng Blast của NCBI. Kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14


kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm PCR của chúng tôi thu được
chính xác là các đoạn DNA tương ứng với các vùng gen matK.
Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu
sau khi cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so
sánh sự sai khác bằng phần mềm Mega 5.0 Bảng sai khác di

truyền giữa ba loài Hopea nghiên cứu được đưa ra trên cơ sở so
sánh trình tự Nucleotide đoạn gen matK dài 843bp, loài Dầu
Monotes madagascariensisAB246478được sử dụng làm loài
ngoài nhóm (outgroup).Kết quả cho thấy không có sự sai khác nào
được tìm thấy trên đoạn gen matK dài 843 nucleotide ở hai mẫuH.
hongayensis thu tại đảo Cái Lim và đảo Ba Mùn. Khoảng cách di
truyền giữa hai loài H. mollissima và H. hongayensis là rất nhỏ
(0,1%).Khoảng cách di truyền giữaH. hainanensis và H.
hongayensislà
0,2%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15


Hình 2. Mối quan hệ di truyền ba loài Hopea trên cơ sở so sánh
trình tự gen matK theo phƣơng pháp NJ

3.2.2 Vùng gen psbA-trnH ba loài Hopea nghiên cứu
Một đoạn gen psbA-trnH có kích thước lý thuyết là
300bpcủa ba loài Hopea và sáu loài Dầu khác ở Việt Nam được
khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu psbA-trnH-F và
psbA-trnH-R, bắt cặp mồi ở 480C, kéo dài chuỗi ở 720Ctrong 30
giây. Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%
(hình 3.12)

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng gen psbA – trnH trên
gel Agarose 1%
Ghi chú: M: DNA ladder 100bp (Fermentas)

Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba
Mùn; 4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8Dầu lông; 9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

16


Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen psbA-trnH
trên gel agarose 1% cho thấy đã xuất hiện một băng DNA rõ nét
có kích thước khoảng 300bp đúng như dự kiến, chúng tỏ việc
khuếch đại gen psbA-trnH đã thành công. Để kiểm tra tính chính
xác của sản phẩm PCR cũng như phân tích sự sai khác về
nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trên đoạn gen psbA-trnH,
chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột sepadex
G50 và đọc trình tự trên máy ABI 3100.
So sánhmức độ sai khác di truyền giữa hai loài
H.hongayensis và H.hainanensis là 0.5%. Không có nucleotide
saikhác nào được tìm thấy giữa hai mẫu Sao Hòn gai thu tại Cái
Lim và Ba mùn cũng nhưgiữa hai loài H.hongayensis
vàH.mollissima

Hình 4. Mối quan hệ di truyền của ba loàiHopea dựa trên so sánh
trình tự gen psbA-trnH theo phƣơng pháp NJ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

17


3.2.3 Trình tự gen rbcL ba loài Hopea nghiên cứu
Đoạn gen rbcLcó chiều dài 1400bp được cắt thành 2 đoạn

(rbcLa và rbcLc), mỗi đoạn có kích thước 700bp. Phản ứng PCR
khuếch đại hai vùng gen rbcLa và rbcLc của ba loài Hopea nghiên
cứu và sáu loài họ dầu khác ở Việt Namđược tiến hành trên máy
PCR system 9700, bắt cặp ở 560C, kéo dài mỗi chuỗi trong 1 phút,
phản ứng PCR được thực hiện trong tổng số 35 chu kỳ. Sản phẩm
PCR mỗi đoạn DNA sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel
Agarose 1% (hình 3.16 a, b)

Hình5a. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcLa
trên gel Agarose1%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

18


Hình5b. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcLa
trên gel Agarose1%

So sánhcho thấy mức độ sai khác di truyền giữa các
mẫuHopea thấp, không có sự sai khác giữa hai mẫu H.
Hongayensis thu tại Ba Mùn và Cái Lim

Hình 6. Mối quan hệ di truyền của ba loài Hopea dựa trên so sánh
trình tự gen rbcL theo phƣơng pháp NJ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

19

Cùng với ba loài Hopea nghiên cứu (Hopea mollissima
C.Y.Wu, Hopea hongayensis Tardieu, Hopea hainanensis Merr et
Chun), sáu loài họ Dầu khác ở Việt Nam bao gồm Parashorea
chinensis Wang Hsie, Hopea odorata Roxb., Dipterocarpus
tuberculatusRoxb., Dipterocarpus intricatus Dyer, Dipterocarpus
dyeri Pierre, Dipterocarpus costatus C.F.Gaertn. cũng đã được
tiến hành đọc trình tự cả ba vùng gen matK, psbA-trnH và rbcL.
Trình tự vùng gen matK và rbcL của chín loài họ Dầu phổ biến
này ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng Gen (bảng 2)
Bảng 2. Tên loài và số hiệu Genbank trình tự gen rbcL,
matK của chín loài họ Dầu phổ biến ở Việt Nam
STT

Tên loài

Địa điểm thu mẫu

1

Parashorea chinensis
Wang Hsie
Hopea odorata Roxb.
Hopea mollissima
C.Y.Wu
Hopea hongayensis
Tardieu
Hopea hainanensis Merr
et Chun
Dipterocarpus

tuberculatus Roxb.
Dipterocarpus
intricatus Dyer

VQG Cúc Phương, Ninh
Bình
VQG Bến En, Thanh Hóa
Khu bảo tồn thiên nhiên
Khe Rỗ, Bắc Giang
Đảo Ba Mùn, VQG Bái Tử
Long, Quảng Ninh
VQG Bến En, Thanh Hóa

2
3
4
5
6
7

VQG York Đôn, Buôn
Đôn, Đắk Lắk
Khu BTTN Bình ChâuPhước Bửu, Bà Rịa-Vũng

Số hiệu
Genbank
gen rbcL
KM267143

Số hiệu

Genbank
gen matK
KJ611235

KM267144
KM267145

KJ611238
KJ611237

KM267146

KJ611239

KM267147

KJ611240

KM267148

KJ611232

KM267150

KJ611230

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

20

8
9

Dipterocarpus dyeri
Pierre
Dipterocarpus
costatus C.F.Gaertn.

Tàu
Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng
Nai
VQG Bù Gia Mập, Bình
Phước

KM267151

KJ611231

KM267152

KJ611241

Các vùng gen này sau đó được kết hợp từng cặp với nhau và cùng
kết hợp thành một đoạn DNA dài 2359bp. Các đoạn DNA kết hợp
của chín loài họ Dầu sau đó được tiến hành so sánh để tìm ra vùng
gen hiệu quả nhất trong phân biệt các loài họ Dầu ở Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

21


Hình 7. Kết quả so sánh phân loại chín loài họ Dầu ở Việt Nam dựa
trên so sánh từng vùng gen (matK, rbcL, trnH-psbA) và sự kết hợp
của chúng.

Kết quả so sánh phân loại của từng vùng gen và sựa kết
hợp cặp đối của chúng cho thấy vùng gen trnH-psbA không chỉ ra
được sự sai khác nucleotide nào giữa hai loài H. hongayensis và
H. mollissima cũng như hai loài D. intricatus và D. costatus, do
vậy sự kết hợp cặp đôi giữa vùng gen trnH-psbA với các vùng gen
khác cũng cho kết quả không rõ ràng về sự phân loại giữa các loài
gần gũi. Trong khi đó, hai vùng gen matK và rbcL bộc lộ khả
năng phân loại tốt hơn. Cả hai vùng gen này đều chỉ ra được sự sai
khác nucleotide giữa các loài, tuy nhiên với kích thước 900bp và
hiệu suất PCR là 100%, vùng gen matK đã chứng tỏ là hữu hiệu
hơn so với vùng gen rbcL dài 1400bp và hiệu suất PCR là 85,7%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

22


Hình8. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài họ Dầu phổ biến
ở Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen matK (A) và trình tự
kết hợp giữa gen matK + rbcL (B)

Tuy vậy, khi xây dựng cây phát sinh chủng loại (NJ) của
chín loài họ dầu phổ biến ở Việt Nam dựa trên trình tự gen matK

(hình 3.21A) và trình tự kết hợp giữa gen matK và gen rbcL (hình
3.21B) cho thấy giá trị boostrap trong mối quan hệ di truyền dựa
trên trình tự kết hợp giữa gen matK và gen rbcL cao hơn hẳn so
với giá trị bootstrap khi chỉ sử dụng một mình gen matK để so
sánh. Do vậy trong ba chỉ thị phân tử matK, rbcL và trnH-psbA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

23


thì vùng gen matK là vùng gen hữu hiệu nhất trong phân loại các
loài họ Dầu nhưng để cho kết quả có độ tin cậy cao thì chúng tôi
khuyến khích sự kết hợp phân tích hai vùng gen matK và rbcL
Chỉ thị phân tử (DNA barcoding) là công cụ công nghệ
sinh học chính xác, đáng tin cậy và đã được sử dụng rất nhiều
trong phân loại các loài động thực vật. Việc sử dụng một hay kết
hợp nhiều chỉ thị phân tử để phân loại đã được nhiều nhà khoa học
trên thế giới quan tâm và tiến hành nghiên cứu. Kress (2007) đã
giới thiệu năm chỉ thị phân tử vùng gen lục lạp bao gồm matK,
rbcL, trnH-psbA, rpoCl và ycf5 là những chỉ thị phân tử tin cậy và
hữu hiệu trong phân loại các loài thực vật cạn. Nhóm nghiên cứu
về thực vật thế giới (plant working group) cũng đã giới thiệu ba
chỉ thị phân tử lục lạp hữu hiệu để phân loại cho nhóm thực vật
bậc cao là matK, rbcL và trnH-psbA (CBOL, 2009), đặc biệt sự
kết hợp giữa hai chỉ thị phân tử matK và rbcL được coi là hữu
hiệu cho hầu hết các loài thực vật.
Trong nghiên cứu này của chúng tôi, matK đã chứng tỏ
cũng là chỉ thị phân tử hữu hiệu cho phân loại các loài họ Dầu ở
Việt Nam ở cấp độ loài. Sự kết hơp giữa hai chỉ thị matK và rbcL

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

24


cũng đã cho một kết quả với độ tin cậy cao (boostrap >76%) ở tất
cả các gốc nhánh.
Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa chín loài họ
dầu phổ biến ở Việt Nam cho thấy chi Parashorea có quan hệ gần
gũi với chi Hopea hơn so với chi Dipterocarpus. Kết quả nghiên
cứu này cũng khẳng định lại kết quả nghiên cứu của Kamiya và cs
(1998)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

25