NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN DẦU HẠT BỤP GIẤM BẰNG ENZYME LIPASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG……………………………………………...………………...X
DANH MỤC HÌNH……………………………..…………………………………XI
CHƯƠNG 1
1.1

TỔNG QUAN ..................................................................................4

BỤP GIẤM ....................................................................................................4

1.1.1

Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm ........................................................4

1.1.2

Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm .....................................................5

1.1.3

Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm ..............................................8

1.2

Enzyme lipase ..............................................................................................10

1.2.1

Định nghĩa.............................................................................................10

1.2.2

Nguồn thu nhận .....................................................................................10

1.2.3

Cấu trúc hóa học của enzyme lipase .....................................................12

1.2.4

Tính chất của enzyme lipase .................................................................12

1.2.5

Cơ chế hoạt động của enzyme lipase ....................................................13

1.2.6

Ứng dụng của enzyme lipase ................................................................14

1.3

Enzyme porcine pancreas lipase ..................................................................15

1.3.1

Định nghĩa.............................................................................................15

1.3.2

Cấu trúc của porcine pancreas lipase ....................................................15

1.3.3

Ứng dụng của enzym porcine pancreas lipase ......................................23

CHƯƠNG 2
2.1

. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............27

Nguyên liệu và hóa chất ..............................................................................27

2.1.1

Hạt Bụp Giấm .......................................................................................27

2.1.2

Chế phẩm enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) ...............................27

2.1.3

Hóa chất khác........................................................................................27

2.1.4

Hexane (www.binhtri.com) ..................................................................28

2.2

Dụng cụ và thiết bị.......................................................................................29

2.2.1

Dụng cụ .................................................................................................29

2.2.2

Thiết bị ..................................................................................................29

2.3

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................29
1


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

2.3.1

Xác định giá trị vận tốc ban đầu của enzyme PPL ...............................29

2.3.2

Xác định mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase .......30

2.3.3 Xác định acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC/FID)(Phạm Hùng
Việt, 2003) ..........................................................................................................31
2.4

Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................33

2.4.1

Khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase .......................33

2.4.2

Trích ly dầu hạt Bụp Giấm: ..................................................................34

2.4.3 Khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme
porcine pancreas lipase. ......................................................................................35
2.4.4
CHƯƠNG 3

Khảo sát tính chất sản phẩm thủy phân ................................................37
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..........................................................41

3.1

Kết quả phân tích chỉ tiêu trong hạt Bụp Giấm ...........................................41

3.2

Kết quả khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase .................42

3.3

Khảo sát tìm điều kiện thủy phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme PPL....42

3.3.1

Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm ................................................................42

3.3.2

Ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ enzyme/gam cơ chất ...........................43

3.3.3

Ảnh hưởng của pH ................................................................................44

3.3.4

Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................46

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân của enzyme
porcine pancreas lipase .......................................................................................47
3.4

Khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân ................................................48

3.4.1

Kết quả tách phân đoạn .........................................................................48

3.4.2

Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của dầu hạt Bụp Giấm ................49

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................51

4.1

Kết luận........................................................................................................51

4.2

Kiến nghị .....................................................................................................51

2


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

LỜI MỞ ĐẦU

Cây Bụp Giấm (Hibiscus sabdariffa L) là một loại cây dễ trồng, có thể chịu hạn.
Theo báo Nông nghiệp Việt Nam thì từ đầu thập niên 90 đến nay, Bụp Giấm (giống
lấy từ Đức) được Công ty Dược liệu Trung ương II trồng nhiều ở Bà Rịa, Đồng Nai,

Sông Bé, Bình Thuận (với diện tích khoảng 400ha để xuất khẩu). Năng suất đài khô
khoảng 400 – 800kg/ha và năng suất hạt 500 – 600kg/ha. 1ha cây Bụp Giấm thu
được tối đa 600kg hạt, như vậy với diện tích 400ha thì thu được 240.000kg. Đối với
các tỉnh Nam Trung bộ thì được canh tác 2 vụ/năm, nên hạt Bụp Giấm thụ được là
480.000kg (gần 500 tấn). Ngoài ra, số liệu từ trạm Khuyến Nông Cư Jut, tỉnh Đắc
Nông cho thấy Công ty Gấc Tây Nguyên trồng cây Bụp Giấm tại huyện Cư Jut,
diện tích trồng năm 2014 là 4.5ha. Năng suất đạt từ 30 – 40 tấn quả tươi/ha, năng
suất hạt là 5 đến 6 tấn/ha (ẩm độ khoảng 10%). Bộ phận có giá trị kinh tế cao của
cây là đài hoa. Đài hoa được xuất khẩu như dược liệu thô. Phần hạt (gần 510 tấn)
thường bị thải bỏ như một loại rác thải. Trong khi đó hạt Bụp Giấm là một nguồn
nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, khoảng 18.8 – 22.3% protein, 39.5 –
42.6% chất xơ, 19.1 – 22.8% chất béo, đặc biệt hàm lượng acid béo không bão hòa
chiếm đến 70%, trong đó acid linoleic chiếm tỷ lệ 44%. Ngoài ra, hạt còn chứa
khoảng 7% chất khoáng gồm Mg, Ca, K, Zn,… (Gummadi S.N và cs, 2009). Việc
thải bỏ hạt Bụp Giấm với số lượng lớn hàng năm như thế đã gây lãng phí nguồn
dinh dưỡng và làm cho môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng. Chính vì vậy,
để tận dụng nguồn dinh dưỡng quý của hạt Bụp Giấm và giúp người dân hiểu được
lợi ích quan trọng của loại hạt này chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy
phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme lipase để thu nhận sản phẩm có hoạt
tính kháng oxi hóa”.

3


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 BỤP GIẤM
1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm
Cây Bụp Giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L, còn gọi là cây Giấm
hay Bụp Giấm, thuộc họ bông Malvaceae, cùng họ với cây bông bụp. Tên tiếng anh
phổ biến của loại cây này là Roselle, ngoài ra một số tên địa phương khác cũng
được sử dụng như: Karkade, Mesta, Sorrel,… Bụp Giấm là một loại cây đa dụng,
được xem là nguồn nguyên liệu sử dụng trong thực phẩm, thức ăn gia súc cũng như
trong dược phẩm. Cây Bụp Giấm là loại cây thân thảo hóa gỗ họ Cẩm quỳ. Cây là
một loại thảo dược ưa chuộng tại Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Cây sống
một năm, cao 1.5 - 2m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt. Lá hình trứng, mép có
răng. Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống. Tràng hoa màu vàng
hồng hay tía, có khi trắng. Quả nang hình trứng, có lông thô, mang đài mầu đỏ sáng
tồn tại bao quanh quả. Cây ra hoa từ tháng 9 đến tháng 10.
Cây Bụp Giấm được trồng khá rộng rãi ở nước ta và được đánh giá như là
cây thuốc của Châu Á, hầu như các thành phần của cây được tận dụng khá triệt để.
Lá ngoài của quả (hay còn gọi là đài hoa) có màu đỏ rực rỡ và hương vị độc đáo đã
trở thành một sản phẩm thực phẩm có giá trị (Tsai và Ou, 1996). Chúng được sử
dụng trong sản xuất thạch, mứt, nước trái cây, rượu, xi-rô, gelatin, bánh pudding và
hương liệu (Ageless và cs, 1999). Trên thế giới, các sản phẩm sản xuất từ nguyên
liệu Bụp Giấm đã được biết đến và thương mại hóa rộng rãi. Ngoài giá trị dinh
dưỡng, Bụp Giấm là loại thuốc quý trong dân gian, có giá trị dược liệu cao. Bụp
Giấm có giá trị lợi tiểu, giảm huyết áp, lợi mật, kháng khuẩn, nhuận tràng, làm giảm
mỡ máu, bảo vệ tế bào gan… Trong nghiên cứu, cây Bụp Giấm là một nguồn quan
trọng cung cấp vitamin như C; E; khoáng chất và các hợp chất có hoạt tính sinh học
như acid hữu cơ, phytosterol và polyphenol. Hàm lượng phenolic bao gồm chủ yếu
là anthocyanins, flavonoid, acid protocatechuic, eugenol và sterol (Azza và cs,
2011; Trần Thị Ngọc Yên và cs, 2012). Tuy nhiên hạt Bụp Giấm chứa dầu béo với
hàm lượng khá cao vẫn chưa được chú trọng nhiều. Nguồn dầu béo này chứa nhiều

4


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có tính kháng khuẩn, là nguồn nguyên liệu tiềm
năng cho thực phẩm. (Juana Sanchez M và cs, 2008)

Hình 1.1. Cây và hạt Bụp Giấm
1.1.2 Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm
Hạt Bụp Giấm là phế phẩm sau khi thu hoạch đài hoa. Nó là một nguồn
nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, bao gồm các thành phần protein, chất
béo, carbohydrate và chất xơ.
Theo nghiên cứu ở Ấn Độ, hạt Bụp Giấm có độ ẩm từ 6 – 8%, có chứa 18 –
22% protein, 19 – 22% chất béo, tổng chất xơ là 39 – 42% và một số thành phần
khoáng như: K, Ca, Zn, Cu, Mg … (Rao và cs, 1996). Một nghiên cứu gần đây hơn
của Hainida và cs (2008) cho biết thành phần hóa học của hạt như sau: protein
35.5%, lipid 22.1%, carbohydrate 13%, chất xơ 18.3% và khoáng 7.5%. Dựa vào
kết quả phân tích thành phần hạt Bụp Giấm cho thấy hạt giàu chất dinh dưỡng, đặc
biệt là protein, lipid và chất xơ. Trong đó, thành phần protein bao gồm các acid
amin không thay thế như: lysine, leusine, isoleusine và tryptophan, dầu bao gồm
chủ yếu là các acid béo không no và có chứa các chất chống oxi hóa với hàm lượng
cao.
1.1.2.1

Đặc điểm dầu hạt Bụp Giấm
Acid béo không bão hòa của dầu hạt Bụp Giấm chiếm tỷ lệ cao, hơn 70%

trong đó chủ yếu là acid béo linoleic chiếm tới 45.9%, acid oleic chiếm 29.2%

5


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

(Amin và cs, 2008). Gần đây, Rashmi Gadwal và cs (2015) cũng cho biết về thành
phần acid béo của hạt Bụp Giấm như sau: linoleic acid là 44.72%, oleic acid là
25.15% và stearic acid 4.31%, palmitic acid 18.52%. Dầu hạt Bụp Giấm còn có các
chất chống oxy tan trong lipid, đặc biệt là  -tocopherol. Tổng tocopherol trung bình
là 2000mg/kg. Trong đó,  - tocopherol chiếm 25%,  - tocopherol 74.5% và  tocopherol 0.5% bên cạnh các đặc trưng hóa lý của dầu (H. Padmaja và cs, 2014; E.
Betikul và cs, 2013), tính kháng vi sinh vật (BH. Ali và cs, 2005) là cơ sở khoa học
để khai thác dầu hạt Bụp Giấm sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm.
1.1.2.2

Thành phần acid béo trong dầu hạt Bụp Giấm
Theo nghiên cứu dầu hạt Bụp Giấm của Fatoumata Tounkara và cs (2011)

cho biết hạt Bụp Giấm (đã luộc ở 500C, thời gian 12 giờ) là nguồn nguyên liệu giàu
hàm lượng các acid béo, đặc biệt hàm lượng các acid béo không no chiếm tỷ lệ khá
cao (74.33%) với các acid béo quan trọng như acid linoleic (35.55%), acid oleic
(36.64%), acid palmitic (19.34%), acid stearic (4.86%).
Bảng 1.1. Thành phần các acid béo có trong dầu hạt Bụp Giấm. (Fatoumata
Tounkara và cs, 2011)
Hạt Bụp Giấm

Hạt Bụp Giấm đã luộc

Myristoleic acid (C14:0)

0.21

0.23

Palmetic acid (C16:0)

19.21

19.34

Stearic acid (C18:0)

5.13

4.86

Arachidic acid (C20:0)

0.67

0.64

Tổng cộng

25.22

25.07

Palmitoleic acid (C16:1)

0.36

0.36

Oleic acid (C18:1)

36.9

36.64

Linoleic acid (C18:2)

35.02

35.55

Alpha-linolenic acid (C18:3)

1.85

1.78

Hàm lượng acid béo (%)
Acid béo no

Acid béo không no

6


LUẬN VĂN THẠC SĨ
Tổng cộng

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA
74.13

74.33

Chất béo có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các loại vitamin
tan trong dầu mỡ như: Vitamin A, D, E, K, các acid béo không no có vai trò quan
trọng trong sự phát triển bình thường của cơ thể, tăng sức đề kháng và có hoạt tính
sinh học cao. Acid oleic là thành phần chính của chất myelin bao quanh sợi trục tế
bào thần kinh, giúp dẫn truyền tín hiệu thần kinh. Acid linoleic (omega - 6) là tiền
chất của ARA thành phần quan trọng của màng tế bào (kể cả tế bào não), là tiền
chất của nhiều chất kháng viêm giúp tăng cường sức đề kháng. Hàm lượng linoleic
là tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá giá trị sinh học của chất béo, có khả năng hỗ
trợ giảm thiểu triệu chứng viêm khớp tự miễn, làm giảm tính viêm sưng. Omega-6
cũng rất có ích trong việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch bằng cách làm giảm
cholesterol và triglyceride trong máu. Acid linolenic (omega - 3) là tiền chất của
DHA, là acid béo quan trọng trong việc phát triển não bộ, mắt và hệ thần kinh
(DHA chiếm 1/4 não bộ người lớn) có tác dụng chống các bệnh tim mạch, làm giảm
áp lực lên thành động mạch ở những người bị bệnh huyết áp cao, giảm nhồi máu cơ
tim, kìm hãm sự lão hóa não, ngăn ngừa sự suy giảm trí nhớ. Các acid béo chưa no
kết hợp với các cholesterol tạo thành các ester cơ động, không bền vững và dễ bài
tiết ra khỏi cơ thể, giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch và có tác dụng cao trong quá
trình điều hòa thành mạch máu, nâng cao tính đàn hồi và hạ thấp khả năng thẩm
thấu của thành mạch máu, giúp hạn chế nghẽn động mạch vành tim.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của α-linolenic acid

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của linoleic acid

7


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.1.3 Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm
1.1.3.1

Phương pháp ép

Sử dụng máy ép trục vít để ép dầu. Cớ chế ép tách bằng trục vít này dựa trên
việc thiết kế cấu tạo thể tích giảm dần của vít Archimede trong lòng ống. Nhờ thiết
kế đặc biệt của vít tải, dầu được giải phóng ra khỏi bột nghiền do sự tạo thành áp
lực trong máy ép – do sự nén nguyên liệu và sức phản kháng của nguyên liệu: Bột
chưng sấy sau khi đã được chuẩn bị có cấu trúc đàn hồi và cơ lý nhất định, phần
protein của bột có tính dẻo rất cao, dễ dàng biến dạng không phục hồi về trạng thái
cũ. Dầu phân bố trong các khe vách và trên mặt các hạt bột là chất lỏng, độ nhớt
nhỏ ở nhiệt độ cao. Khi bột bị ép trong lòng máy, áp lực hình thành giúp dầu từ các
khe vách thoát ra (Trần Thanh Trúc, 2005)
Hạt Bụp
Giấm

Làm sạch,

sấy khô
Nghiền
Chưng sấy
bột nghiền
Ép sơ bộ

Bánh dầu

Dầu thô

Ép kiệt
Bánh dầu
Hình 1.4. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp ép

8


LUẬN VĂN THẠC SĨ
1.1.3.2

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Phương pháp trích ly

Trích ly dầu được thực hiện dựa trên đặc tính hòa tan tốt của dầu thực vật
trong các dung môi hữu cơ không phân cực như: hexane; dicloetan… Chủ yếu là
hexane. Việc chuyển dầu phân bố bên trong cũng như mặt ngoài các cấu trúc vật thể
rắn như hạt, bột chưng sấy, khô dầu vào pha lỏng của dung môi là một quá trình
truyền khối xảy ra trong lớp chuyển động, dựa vào sự chênh lệch nồng độ dầu trong
nguyên liệu và dòng chảy bên ngoài (Trần Thanh Trúc, 2005)

Hạt Bụp
Giấm

Loại bỏ tạp chất

Đất, đá, hạt mốc
Độ ẩm cuối cùng dưới 10%.

Sấy

Nghiền thô

Hexan

Trích ly

Bã

Cô quay

Sử dụng máy cô quay chân
không 500C, 70 vòng/phút

Ly tâm

Tách cặn, 3000v/phút, 10 phút

Dầu Bụp Giấm

Hình 1.5. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp trích ly

9


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.2 Enzyme lipase
1.2.1 Định nghĩa
Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác thủy
phân và tổng hợp các este được hình thành từ triglycerol và các acid béo. Chúng có
bản chất là protein. Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu –
nước.
Lipase được tìm thấy trong động vật, thực vật, nấm và vi khuẩn, có ý nghĩa sinh lý
và tiềm năng trong công nghiệp. Chức năng sinh học của lipase là xúc tác quá trình
thủy phân của triacylglycerol giải phóng acid béo tự do, diacylglycerols,
monoacylglycerols và glycerol. Lipase thủy phân chất béo thành acid béo và
glycerol tại bề mặt phân pha dầu - nước và đảo chiều các phản ứng trong môi
trường không có nước: tổng hợp các este từ glycerol và acid béo chuỗi dài. Sản
phẩm thu được bằng cách sử dụng lipase tinh khiết hơn so với sử dụng các chất xúc
tác hóa học vì sử dụng chất xúc tác hóa học sinh ra nhiều sản phẩm không mong
muốn và tạp chất, nhiệt độ, áp suất cao và không tái sử dụng được. Như các xúc tác
khác, lipase chỉ làm tăng tốc độ phản ứng nhưng không tham gia trực tiếp vào phản
ứng. Tuy nhiên, do khả năng xúc tác chọn lọc, các enzyme có thể xúc tác phản ứng
xảy ra ở một số liên kết nhất định. Vì vậy, mỗi loại enzyme khác nhau có thể xúc
tác cho các phản ứng xảy ra theo chiều hình thành một số sản phẩm nhất định. Điều
này khiến cho sản phẩm của các phản ứng có xúc tác enzyme thuần nhất hơn.
1.2.2 Nguồn thu nhận
Lipase được phân bố ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu

nhận lipase lớn nhất trong công nghiệp là vi sinh vật. Lipase phân lập ở các nguồn
khác nhau sẽ khác nhau về cấu trúc protein và cơ chế xúc tác, khác nhau về các acid
béo đặc trưng, khả năng chịu nhiệt, pH tối ưu.
Ở người và động vật có xương sống, lipase kiểm soát sự thủy phân, hấp phụ, tổng
hợp chất béo và chuyển hóa lipoprotein. Hầu hết lipase trích ly từ cơ thể động vật
đều có nhiệt độ tối thích là 370C. Ở động vật, lipase được lấy từ tuyến tụy và dạ
dày.
10


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Lipase động vật ưu tiên xúc tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo mạch dài
có hơn 12 nguyên tử carbon. Tốc độ phản ứng giảm đáng kể theo thứ tự tri, di và
monoglycerides. Một số loại lipase chiết xuất từ dê, cừu và bê. Các enzyme này xúc
tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo ngắn mạch có tác dụng tạo hương vị
cho sản phẩm phomat.
Lipase được tìm thấy tại mô dự trữ của các loại hạt có dầu, ngũ cốc trong quá trình
nảy mầm. Chế phẩm lipase thô được lấy từ mầm của cây cải dầu (Brassica napus),
mù tạt, cây thầu dầu và một số loại đậu. Tuy nhiên, lipase thu nhận từ thực vật chưa
được đưa vào ứng dụng nhiều vì quá trình tinh sạch khó khăn và hiệu quả kinh tế
không cao.
Lipase được thu nhận trong quá trình lên men của nấm và vi khuẩn: Staphylococcus
spp., Pseudomonas spp., Chromobacterium spp., Candida Rugosa…
- Lipase từ Aspergillus niger và Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử từ 25KDa
đến 200KDa và pH tối ưu từ 4.5 đến 6.5. Chúng hoạt động trên dầu dừa, dầu hạt
lanh và dầu olive với hiệu suất thủy phân từ 48 - 93% và được sử dụng trong quá
trình chín pho mát.

- Lipase từ Candida Rugosa: khối lượng phân tử 120KDa, điểm đẳng điện ở pH 4.5
và pH tối ưu 6.5–7.5 (Petersen et al., 2001). Chúng thủy phân dầu olive với hiệu
suất 95 – 97%.
- Lipase từ Rhizopus: R. arrhizus, R. javanicus, R. niveus, R. delemar. R. arrhizus
lipase có khối lượng phân tử 43KDa và điểm đẳng điện ở pH 6.3, hoạt động ở pH
tối ưu 5 – 7 và nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C.
- Lipase từ Pseudomonas: khối lượng phân tử 29KDa và điểm đẳng điện ở pH 5.8
và pH tối ưu là 6.5 – 8.5. Chúng hoạt động và ổn định ở pH kiềm, được sử dụng
trong chất tẩy rửa.
Enzyme lipase Porcine Pancreas được tách ra từ tuyến tụy của lợn, đây là
nguồn quan trọng để thu nhận enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân
lập đầu tiên từ nguồn này.

11


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.2.3 Cấu trúc hóa học của enzyme lipase
Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định:
- Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn
amino acid 1 – 336. Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid
153, 177 và 264.
- Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này
tương tác với colipase. Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử
khoảng 10kDa.
Cấu trúc tinh thể của enzyme lipase có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác. Vị
trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác. Vùng võng rộng

nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và
Cys262. Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng
N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt
động. Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase. Khi nắp
này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động.
1.2.4 Tính chất của enzyme lipase
Enzyme lipase là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của 449 amino
acid, với khối lượng phân tử khoảng 50 – 52kDa. Tính chất vật lý của lipase chủ
yếu phụ thuộc vào các yếu tố như vị trí của các acid béo trong mạch glycerol, chiều
dài chuỗi các acid béo và mức độ bão hòa của acid béo. Những tính chất này cũng
ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của một triglyceride nhất định.
Nhiều lipase hoạt động trong các dung môi hữu cơ, xúc tác cho phản ứng este hóa.
Hoạt động lipase thường phụ thuộc vào diện tích bề mặt và điều kiện phản ứng nhẹ
nhàng. Một cuộc khảo sát bởi Linko và Wo trên lipase thương mại cho kết quả
lipase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus có tính chọn lọc cao đối với các acid béo
chuỗi ngắn và rượu, đối với C.rugosa lipase là acid propionic, acid butyric, butanol,
pentanol và hexanol. Đối với M. Miehei và R. arrhizus, lipase là các acid béo chuỗi
dài và acetate.

12


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

So với các loại enzyme lipase khác, enzyme lipase có hoạt tính tương đối thấp.
Hoạt tính của enzyme lipase được xác định thông qua hoạt độ của enzyme, bằng
cách xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong
phản ứng.

Có rất nhiều định nghĩa về hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độ
của enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng
enzyme chuyển hóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành
sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định. (Kí hiệu: U).
pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng
đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme.
Enzyme lipase thể hiện hoạt tính cao nhất tại môi trường pH kiềm, trong giới
hạn 7.3 – 9.0. Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của lipase nằm trong
giới hạn là 7.5– 9.0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7.5.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn
xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền, chưa bị biến tính. Nhiệt độ tối ưu
cho hoạt động của enzyme lipase là 35 – 450C. Với cơ chất là triacylglycerol, lipase
thể hiện hoạt tính cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng 35 – 450C, pH dao động
từ 6.7 – 7.5.
1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme lipase
Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước), nó đi vào
tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser153, His264 và Asp177. Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ
thực hiện phản ứng thủy phân. Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên
tử oxy ở phần cuối của Asp177 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin
bằng liên kết hydro, giúp cho His264 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó
tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser153. Liên kết hydro thứ hai này kéo
hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị
này thì enzyme sẵn sàng để hoạt động.
Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của
cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser153. Tác nhân ái nhân là nhóm

13


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

OH- của serin mang điện tích âm tấn công vào trung tâm tích điện dương của
cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa cacbon glycerol thứ nhất và oxy của
este yếu đi. Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động và nó được thêm một
proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser153 để trung hòa điện tích âm của nó. Khi oxy
nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toàn tự
do.
Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser153, tuy nhiên
liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó.
Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của
diglyceride từ nửa đang chứa glycerol. Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một
nhóm hydroxyl để liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol và một ion H+ để thêm
một proton trở lại vào oxy của Ser153. Một phân tử nước ở môi trường ngoài cung
cấp các thành phần cần thiết này. Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân
ly thành H+ và OH-. Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân
tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành. Ion hydronium có một
momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon
glycerol đầu tiên. Thời điểm này, oxy của Ser153 rời khỏi nhóm. Chuỗi bên cạnh
tích điện âm của Ser153 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước. Lúc
này, sản phẩm diglyceride được hình thành. Liên kết hydro giữa nitơ thơm của
His264 và nhóm hydroxyl trên Ser153 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban
đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác.
1.2.6 Ứng dụng của enzyme lipase
Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm,
dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy... Lipase được sử
dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để làm nước
hoa thông qua phản ứng este hóa.
Do khả năng thủy phân chất béo của lipase nên ngày nay lipase được dùng trong bột

giặt để thủy phân các vết dầu mỡ trên quần áo, chăn nệm trong điều kiện nhiệt độ
thấp và pH cao với những chất hóa học có hoạt tính bề mặt. Trong công nghiệp

14


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

giấy, sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất. Do vậy, việc loại
bỏ các chất này là rất cần thiết. Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái
để loại bỏ các tạp chất trên.
Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi
trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như:
metoprolol, 1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy]propan-2-ol được
sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa
đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm.
1.3 Enzyme porcine pancreas lipase
1.3.1 Định nghĩa
Các enzyme porcine pancreas lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC
3.1.1.3) được định nghĩa như là các enzyme xúc tác thủy phân các liên kết ester
giữa các acid béo mạch dài và glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu –
nước. Các enzyme porcine pancreas lipase thủy phân triacylglycerol (TAG) không
tan trong nước thành các diacylglycerol, các monoacylglycerol phân cực hơn cũng
như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá trình hấp thu và chuyển hóa qua màng.
Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động tối thích cho hầu hết các porcine
pancreas lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các porcine pancreas lipase hoạt động
trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 650C, nhưng thông dụng nhất là từ 30 –
450C. Nhiều chuỗi acid amin của porcine pancreas lipase đã được tìm ra như: lipase

tụy của người, bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris),
lợn (Cavia orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus). (Varger
R, 1984)
1.3.2 Cấu trúc của porcine pancreas lipase
Trong những porcine pancreas lipase đã biết, không có trình tự acid amin đặc
trưng nào cho mọi lipase. Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt. Điểm giống nhau
của tất cả các porcine pancreas lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly – X –
Ser – X – Gly (trong rất hiếm trường hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin
khác). Trình tự này nằm gần trung tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã
15


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

sử dụng chuỗi pentapeptide này để định danh những protein là lipase. Mặc dù có sự
khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả porcine pancreas lipase đều có một
kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là nếp gấp  có liên quan đến cơ chế xúc tác của
nó. Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của
enzyme có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất. Cấu
trúc gấp nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có
chuỗi  2 ngược chiều. Các chuỗi  3 đến  8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn 
. Sự khác biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên nếp gấp  , sự hiện diện của
nhóm phụ và cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất.
Cấu trúc lập thể của porcine pancreas lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các
nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của enzyme porcine pancreas lipase bị che
chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động. Theo Winkler F.K và cộng sự, cấu
trúc di động cần di chuyển trên bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc
hoạt động của enzyme với trung tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc

tinh thể của porcine pancreas lipase hay cấu trúc dạng phức đã tạo điều kiện cho
việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase. Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất
hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di động chuyển từ đóng sang mở. Cơ chế
đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho
trung tâm hoạt động của lipase thông suốt để có thể liên kết với lipid. (Varger R,
1984)
1.3.2.1

Cấu trúc di động của porcine pancreas lipase
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề

mặt liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt
động của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó. Khi chuyển
sang dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham
gia phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm
sáng tỏ nhiều hơn. Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động.
Nắp có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng
nắp, phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi

16


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

protein; khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng
diện tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của
lipase. Ví dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo,

nhưng hai lipase lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau. Lipase tụy người chỉ có hoạt
độ cao với triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của
phospholipase và galactolipase. Điểm khác nhau chính trong cấu trúc của 2 enzyme
này là kích thước rất nhỏ của nắp trên lipase tụy heo (5 acid amin). Đột biến gen
gây ra những biến đổi trên cái nắp đã cho thấy tầm ảnh hưởng của cái nắp đến tính
chọn lọc đối với triglyceride, phospholipid và galactolipid. Đột biến trên nắp của
lipase này sẽ làm thay đổi chiều dài mạch của cơ chất mà nó tương thích. (Van
Tilbeurgh H, 1992)
1.3.2.2

Phức porcine pancreas lipase
Porcine pancreas lipase có cấu trúc phức với nhóm phụ là protein hay lipid.

Porcine pancreas lipase chứa 2 phần gắn với nhau bằng một khớp linh động, đầu N
của phần protein xúc tác có kích thước lớn và đầu C của nếp gấp  có kích thước
nhỏ hơn. Nó liên quan đến hoạt độ của lipase trong những điều kiện môi trường
sinh lý trong cơ thể. Trong ống tiêu hóa, triglyceride được hòa với phospholipid,
acid béo, protein và muối mật có tác dụng như chất nhũ hóa. Muối mật sẽ ngăn cản
sự hấp thụ của porcine pancreas lipase trên cơ chất lipid nếu không có sự hỗ trợ của
một protein được tiết ra cùng với dịch tụy, colipase. Colipase là một phân tử protein
vừa có tính ưa nước vừa có tính kỵ nước, nó có thể gắn lipase vào bề mặt phân chia
pha và ổn định hoạt độ của lipase trên đó. Khi liên kết với đầu C của lipase, colipase
sẽ làm lộ phần cấu trúc kỵ nước ở mặt đối diện và giúp enzyme tiếp xúc với bề mặt
liên pha. Liên kết với colipase không gây ra sự thay đổi về hình dạng của phân tử
lipase nhưng một cách gián tiếp, nó tác động đến cái nắp trên lipase, làm nó mở ra
và mở ra phần kỵ nước giúp tăng cường hoạt động trên bề mặt liên pha nước – lipid.
(Van Tilbeurgh H, 1999)

17

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Hình 1.6. Cấu trúc mô phỏng của enzyme PPL
1.3.2.3

Cơ chế xúc tác của porcine pancreas lipase

a) Trung tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của porcine pancreas lipase gồm 3 gốc acid amin:
serine; aspartate hay glutamate và một histidine.

Hình 1.7. Mô hình đóng nắp và mở nắp trong enzyme porcine pancreas lipase.
Sự hoạt hóa enzyme porcine pancreas lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc
giữa enzyme và cơ chất ở dạng hạt nhũ, do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp của
enzyme. Sự tác động này tương đối khác nhau tùy loại cơ chất.

18


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang
dạng enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất. Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết
gắn; (2) định hướng; (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa.
Phần còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo

ra dạng trung gian (Ea*S). Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái
nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành
oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester. Một hình tứ
diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và
nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính. Proton trên
histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester. Liên kết ester này sau đó bị
cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo
mới giải phóng với serine. Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ
phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên. Trong bước này, proton từ
nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide. Ion này sẽ gắn với nguyên
tử carbon của carbonyl trên cơ chất.
Acyl hóa Ea*S

Ea*Ac + P1 và đề acyl hóa Ea*Ac

Ea * + P 2

(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)
Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi porcine pancreas lipase được mô tả ở hình
1.9

19


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Hình 1.9. Cơ chế thủy phân dầu Bụp Giấm của enzyme porcine pancreas lipase
A: Sự kết gắn lipid, hoạt hóa nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser

tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-Carbonyl của cơ chất.
B: Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai
nhóm NH-peptid, histidine phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất.
C: Dạng trung gian đồng trị (“acyl enzyme”) được hình thành, trong đó thành phần
acid của cơ chất được ester hóa với serine của enzyme. Phân tử nước thu vào được
hoạt hóa nhờ histidine bên cạnh và ion hydroxyl tấn công ưa nhân nguyên tử C của
dạng đồng trị đó.
D: Histidine giải phóng 1 proton đến nguyên tử O của gốc serine hoạt hóa, liên kết
ester giữa serine và acyl bị bẻ gãy giải phóng gốc acyl. (Varger R, 1984)
b) Trung tâm liên kết với cơ chất
Trung tâm hoạt động của lipase bị bao phủ bên trong cấu trúc protein. Cơ
chất đi vào đó thông qua một trung tâm liên kết là một cái túi ở phần đầu của nếp
gấp  ở trung tâm phân tử enzyme. Mặc dù các lipase có cấu trúc nếp gấp tương tự
nhau, trung tâm liên kết với cơ chất lại khác nhau về kích thước, cấu trúc, và tính
chất lý hóa, đặc biệt là tính kỵ nước của những phần tử trong túi. Độ dài, hình dạng,
tính kỵ nước của túi có liên quan đến chiều dài mạch carbon của cơ chất.

20


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

c) Tính đặc hiệu của porcine pancreas lipase
Khả năng sử dụng porcine pancreas lipase làm xúc tác sinh học đều dựa vào
tính chọn lọc và đặc hiệu rất tinh tế của nó. Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là
chọn lọc vị trí không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị
thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học, ví dụ như khả năng
nhận biết cơ chất và chọn lọc đồng phân lập thể. Hầu hết porcine pancreas lipase

thông dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1,3 trong mạch glycerol. Ngoài ra
cũng có lipase có tính đặc hiệu cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn
triglyceride thành acid béo và glycerol. Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có
thể chuyển ester với acid béo có độ dài mạch bên trung bình đến mạch dài (C4 đến
C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau. Porcine pancreas lipase thể
hiện hoạt độ trên các acid béo không no nhiều nối đôi. (Adel Sayaria và cs, 2000)
d) Đặc hiệu cơ chất
Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase. Tuy
nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ của enzyme cũng không giống
nhau.
Bảng 1.2. Tính đặc hiệu cơ chất của lipase (Abir Ben Bachaa và cs, 2005)
Cơ chất

Hoạt độ tương đối (%)

Dầu dừa

142

Dầu hạt bông

112

Dầu đậu phộng

34.5

Dầu olive

105

Dầu hướng dương

121

Triacetin

0

Tributirin

35.7

Triolein

100

21


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

e) Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn - 1,3)
Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình trans-ester hóa triolein
(OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase. Sự tạo thành tripalmitin
(PPP) cho thấy enzyme không có tính đặc hiệu vị trí và sự không tạo tripalmitin mà
chỉ tạo 1,3-dipalmitin 2-olein chứng tỏ enzyme có tính đặc hiệu vị trí – 1,3.
Lipase không đặc hiệu vị trí

O

P

P

P

O +

O +

P

O

P

P

P

P

O + P

O +

O + O

O

O

P

O

+ P

O
O

Lipase đặc hiệu vị trí 1,3

+P

Hình 1.10. Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme porcine pancreas
lipase
Enzyme đặc hiệu vị trí chỉ cắt các liên kết ester ở vị trí acylglycerol 1 và 3.
Trong trường hợp này, triacylglycerol sau khi bị thủy giải bởi enzyme sẽ tạo ra 1,2hoặc 2,3-diacylglycerol và 2-monoacylglycerol. Các sản phẩm này, đặc biệt là 2monoacylglycerol không bền, dễ dàng bị isomer hóa để tạo ra 1,3-diacylglycerol và
1(3)-monoacylglycerol. Nếu xử lý tiếp hỗn hợp trên bằng lipase có hoạt độ đặc hiệu
vị trí 1,3 thì sẽ thủy giải hoàn toàn triglyceride tạo ra glycerine. Tuy nhiên, enzyme
lipase cắt đặc hiệu vị trí 1,3 chỉ xúc tác sự trao đổi các gốc acid béo vị trí 1 và 3
trong phân tử triacylglycerol và như vậy các sản phẩm nhận được sẽ khác với các
sản phẩm cắt bằng hóa học. Khả năng tạo hỗn hợp triacylglycerol mới do tính đặc
hiệu của enzyme lipase nói trên đã được ứng dụng trong thực tế. (Varger R, 1984)
f) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme porcine pancreas lipase
Sự thủy phân lipid tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ,

nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của enzyme với cơ chất.

22


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase
Ion kim loại

Hoạt độ còn lại (%)

Cu2+

90

Ca2+

99.6

Mg2+

99.1

Ba2+

118.7

Zn2+

65.6

Mn2+

122.2

Hg2+

54.8

Đối chứng

100

Các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt độ của
lipase. Sự có mặt của ion Ca2+ hoàn toàn cần thiết cho việc thủy phân triglyceride
mạch dài và các acid béo tự do tạo thành có thể được tách ra ở dạng các muối canxi
không tan. Sodium taurochlate (NaTC) làm tăng hoạt độ lipase, kích thích sự phân
hủy lipid triolein trong môi trường kiềm nhẹ, nhưng ức chế trong môi trường có tính
acid yếu. Hoạt độ của lipase còn tùy thuộc rất nhiều vào diện tích bề mặt liên pha
dầu – nước. (Varger R, 1984)
1.3.3 Ứng dụng của enzym porcine pancreas lipase
Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực
phẩm, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy... Lipase
được sử dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để
làm nước hoa thông qua phản ứng este hóa. Do khả năng thủy phân chất béo của
lipase nên ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thủy phân các vết dầu mỡ
trên quần áo, chăn nệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hóa

học có hoạt tính bề mặt. Trong công nghiệp giấy, sáp và các triglyceride gây trở
ngại cho quá trình sản xuất. Do vậy, việc loại bỏ các chất này là rất cần thiết. Hiện
nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái để loại bỏ các tạp chất trên.

23


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi
trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như:
metoprolol, 1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy] propan-2-ol được
sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa
đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm. (Aechle W và cs, 2004)
1.3.3.1

Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm
Trong công nghiệp chất béo và bơ thực vật, lipase được dùng làm xúc tác

trong phản ứng tổng hợp nên các chất béo có giá trị cao từ các chất béo có giá trị
thấp hơn như tổng hợp chất thay thế bơ, ca cao từ dầu cọ phân đoạn bằng phản ứng
nội chuyển hóa (Zuyi và Ward, 1993). Chúng còn được dùng làm xúc tác cho phản
ứng chuyển hóa ester trong các dung môi hữu cơ tạo ra các chất tương đương với bơ
ca cao, chất thay thế chất béo có trong sữa người có tên “Betapol”, sử dụng lipase
trong công nghiệp sản xuất ra các acid béo nhiều nối đôi quan trọng và sản xuất dầu
diesel sinh học từ dầu thực vật (Mastuao và cs, 1981). Ngoài ra, lipase còn dùng
làm xúc tác phản ứng thủy phân chất béo như mỡ bò ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn
tránh làm hỏng các acid béo sản phẩm đặc biệt là các acid béo nhiều nối đôi có giá

trị dinh dưỡng cao (Yoshitsugu Kosugi và cs, 1988). Một số tác giả đã dùng lipase
trong phản ứng thủy phân chất béo tạo ra acid béo và glycerol, acid béo được dùng
trong công nghiệp sản xuất xà phòng (Gormen & Malmos, 1991).
1.3.3.2

Các nghiên cứu thủy phân dầu mỡ bằng enzyme porcine pancreas
lipase
H.T. Khor và cs (1986) nghiên cứu thủy phân dầu cọ thu nhận acid béo bằng

enzyme lipase thu từ Candida Rugosa 2975U và porcine pancreatic lipase 38U
(Sigma) thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu 370C; pH tối ưu 7.5; tỷ lệ
dầu/hexan 1:0.5 (w/v), mức độ thủy phân đạt được sau 5h là 100%.
X. Fu và cs (1995) nghiên cứu thủy phân dầu oliu bằng enzyme lipase được
thu nhận từ Aspergillus sp (hoạt độ lipase đặc biệt cao 60.000U/g; Shenyang, Trung
Quốc) thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu 370C; pH tối ưu 6.5 – 7.0; mức độ
thủy phân đạt được sau 2h là 75%.

24


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Ngoài ra, K. Ramani và cs (2012) nghiên cứu thủy phân dầu hướng dương
bằng enzyme lipase Pseudomonas otitidis thu được kết quả như sau: nhiệt độ tối ưu
350C, pH tối ưu 7.5; mức độ thủy phân đạt được sau 3h là 92.3%.
Kriti Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân dầu cá ngừ thu nhận
acid béo chứa DHA bằng lipase từ Candida Rugosa đã tiến hành thí nghiệm tại pH=
7.0, nhiệt độ 35oC thu được kết quả tối ưu cho tỉ lệ dầu/nước là 1:10 (w/v) và tỉ lệ

dầu/dung môi là 1:1(w/v); mức độ thủy phân đạt được sau 24h là 86.5%.
Abid Ali Khaskheli và cs (2015) nghiên cứu thủy phân dầu thầu dầu (chứa
10 – 50% acid oleic) bằng enzyme lipase Rhizopus oryzae thu được kết quả tối ưu
như sau: nồng độ enzyme/cơ chất (0.01%, w/w); pH 7, nhiệt độ 370C, tỉ lệ dầu/nước
(1:4), thời gian thủy phân 12 giờ. Hiệu suất thủy phân lên đến 90%.
Maria Goretti Marianti Purwantoa và cs (2015) nghiên cứu thủy phân chất
thải dầu cá Sardine bằng enzyme lipase Mucor circinelloides thu được kết quả như
sau: pH tối ưu 5.0; nhiệt độ tối ưu 350C, hàm lượng acid béo omega – 3 đạt 35%,
gia tăng 12.56% so với dầu thô ban đầu là: 22.44%; mức độ thủy phân đạt được sau
3 ngày là hơn 80%.
Marya Aziz và cs (2015) nghiên cứu thủy phân dầu hoa Rum bằng enzyme
lipase thu nhận từ tụy heo thu lại kết quả tối ưu như sau: thời gian thủy phân đối với
enzyme lipase tụy là 3 giờ; nồng độ enzyme/cơ chất lipase tụy là 2.0mg enzyme
rắn/mL; nồng độ cơ chất dùng cho enzyme lipase tụy là 1mM; nhiệt độ dùng cho
enzyme lipase tụy là 45; pH dùng cho enzyme lipase tụy từ 7.0 – 7.5; mức độ thủy
phân đạt được sau 3h là 91.6%.
Govind V. Waghmare và cs (2016) nghiên cứu thủy phân dầu ăn bị thải đi
bằng enzyme lipase (Novozyme 435) kết hợp với sóng siêu âm với điều kiện dung
môi tự do thu lại kết quả tối ưu như sau: tỉ lệ dầu/nước 3:1; chất xúc tác 1.25%
(w/w), năng lượng siêu âm thấp hơn 100W, nhiệt độ phản ứng 500C. Hiệu suất phản
ứng đạt được sau 2h là 75.19%.
Shweta Gupta và cs (2016) nghiên cứu phản ứng thủy phân dầu oliu bằng
enzyme lipase Candida Rugosa thu được kết quả tối ưu như sau: nhiệt độ 370C; pH
8.0; Iso – octane 0.05M, mức độ thủy phân của dầu oliu đạt được sau 24h là 38.5%.
25