HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU
TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV
(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU
TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV
(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành: Kỹ thuật Trồng trọt
Mã số:

60.62.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn Khoa học:
1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
2. TS. BÙI MINH TRÍ

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2010


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Hà Thị Tuyết Phượng, sinh năm 1981 tại huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang.
Con Ông Hà Văn Xua và Bà Nguyễn Thị Hữu.
Tốt nghiệp trung học phổ thông tại Trường Trung học phổ thông An Hữu, tỉnh Tiền
Giang năm 2000.
Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học, hệ Chính quy tại trường Đại học Nông Lâm,
thành phố Hồ Chí Minh năm 2005.
Từ năm 2006 đến nay, công tác tại Khoa Nông nghiệp Trường Đại học Tiền Giang.
Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Kỹ thuật Trồng trọt tại Trường Đại học
Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ liên lạc: Nhà số 342, tổ 13, ấp 4, xã Tân Thanh, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền
Giang.
Điện thoại: 0982.137.800
E-mail:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và

chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Thị Tuyết Phượng

iii


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông học,
Phòng Sau đại học Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện trong thời gian học tập. Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp
Trường Đại học Tiền Giang đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí trong quá trình
học tập. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Nghiên cứu Công nghệ
Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện trong quá trình làm đề tài. Quý Thầy Cô
trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập tại trường.
Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS.TS. Dương Tấn Nhựt, TS. Bùi Minh
Trí, những người Thầy luôn tận tụy và giàu lòng hy sinh cho sự nghiệp trồng người.
Một tấm gương lao động cần mẫn và hết lòng đam mê khoa học. Cám ơn Quý Thầy
đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ kinh phí cho em trong
quá trình làm đề tài. Cám ơn Quý Thầy đã cho em có cơ hội tiếp xúc với môi trường
nghiên cứu khoa học mà em từng mơ ước được một lần đến. Cám ơn Quý Thầy đã
là điểm tựa và chấp cánh cho em để ngày càng được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cám ơn PGS.TS. Lê Quang Hưng, TS. Võ Thái Dân đã tận
tình chỉ dẫn giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Con xin cám ơn Ba Mẹ, các Chị đã hết lòng thương yêu, đùm bọc, dìu dắt con
trong cuộc đời. Cám ơn các Anh Chị Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống
cây trồng, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ trong quá trình làm đề
tài. Em xin cám ơn thầy Phạm S, thầy Tuấn, chú Tới, chú Xuân Tùng, cô Toản, cô
Hương, cô Lan, chị Hằng; anh Nam, Công, Hùng, Dũng, Tâm, Sơn; bạn Trang,
Tâm, Công; em Thùy, Sương, Bá Nam, Tuấn, Thái, Dung, Chương, Nam, Diệu

Hiền, Thanh, Hiền, Nhiên, Giáp, Hằng, Trực, Nhật, Tùng, Thưởng, Loan, Thương,
Thu, Hương, Chiến, Nguyễn, Anh, Kha, My, Hà, Thái Hiền, Nhân, Quỳnh, Huy,
Phúc Huy, Thuận, Vương đã giúp đỡ trong quá trình làm đề tài. Con xin cám ơn gia
đình bác Hai, gia đình chú Yên đã thương yêu, đùm bọc trong thời gian làm đề tài.

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống cây dâu tây (Fragaria spp.) sạch
virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực
hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng của Viện Sinh học
Tây Nguyên, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật của Viện Nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Môi trường từ 10/2008 - 10/2009. Các thí nghiệm được bố trí theo
kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy
giống dâu tây Mỹ Hương có khả năng phát sinh chồi từ mô lá cao hơn so với giống
Mỹ Đá và dâu Pháp. Môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh chồi từ mô lá cây
dâu tây in vitro là môi trường MS được bổ sung 1 mg/l TDZ, 0,1 mg/l NAA, 30 g/l
sucrose và 8 g/l agar. Mô lá cây dâu tây in vitro thuộc giống Mỹ Hương được nuôi
cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l TDZ, 0,1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 8
g/l agar có khả năng phát sinh chồi cao nhất. Áp dụng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết
thương ở đỉnh ngọn chồi” cho khả năng nhân chồi của cây dâu tây cao hơn so với
kỹ thuật “Để nguyên chồi” và kỹ thuật “Cắt lá của chồi”. Giống dâu Mỹ Hương có
khả năng nhân chồi cao hơn so với giống Mỹ Đá và dâu Pháp. Chồi dâu tây thuộc
giống Mỹ Hương được xử lý bằng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn
chồi” có khả năng nhân chồi cao nhất. Môi trường ½ MS được bổ sung 30 g/l
sucrose, 0,2 mg/l IBA, 0,75 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar thích hợp nhất cho sự
sinh trưởng của cây dâu tây trong giai đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm so với
các nồng độ sucrose còn lại (0; 10; 20; 40 g/l). Cây dâu tây thuộc giống Mỹ Hương
kết hợp với nuôi cấy trên môi trường ½ MS được bổ sung 30 g/l sucrose, 0,2 mg/l

IBA, 0,75 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong giai
đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm. Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi
được trồng ra vườn ươm 45 ngày của ba giống dâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu
Pháp bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu được kiểm tra đều
không bị nhiễm virus SCV.

v


SUMMARY
The thesis “Improving SCV-free strawberry (Fragaria spp.) propagation
protocol through tissue culture method”, was carried out at Department of Plant
Molecular Biology and Plant Breeding, Tay Nguyen Institute of Biology;
Department of Plant Bioteachnology, Research Institute for Biotechnology and
Environment from 10/2008 to 10/2009. Experiments were arranged in Completely
Randomized Design with three replications. The shoot regeneration from leaf
tissues of in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da,
My Huong and Phap, depended on different genotypes and supplemented TDZ
concentrations. My Huong showed the highest regeneration rate among the three
strawberry cultivars. The highest shoot regeneration rate from leaf tissues of in vitro
strawberry plantlets was noticed after leaf tissues had been cultivated on MS
medium containing 1 mgl-1 TDZ, 0.1 mgl-1 NAA, 30 gl-1 sucrose and 8 gl-1 agar.
“Leaves cutting and shoot tip wounding” treatment performed significantly higher
shoot regeneration rate compared with “No cutting” and “Leaves cutting”
treatments. By supplementing sucrose to growing medium, the growth of in vitro
strawberry plantlets were improved and the concentration of 30 gl-1 sucrose showed
the optimal growth for in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars. ½
MS medium supplemented with 30 gl-1 sucrose, 0.2 mgl-1 IBA, 0.75 gl-1 activated
charcoal and 8 gl-1 agar was the most suitable for the development of in vitro
strawberry plantlets. After 45 days in nethouse condition, strawberry plantlets of

three strawberry cultivars, namely My Da, My Huong and Phap, were screened
from SCV (Strawberry Crinkle Virus) by using RT-PCR technique and no virus was
detected. The results of this study confirm the potential of using tissue culture
technique in virus-free strawberry propagation.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang chuẩn y .............................................................................................................. i
LÝ LỊCH CÁ NHÂN ................................................................................................. ii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv
TÓM TẮT ...................................................................................................................v
SUMMARY .............................................................................................................. vi
MỤC LỤC ................................................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................xv
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... xvii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ .................................................................................xx
1.ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................1
1.1 Giới thiệu...............................................................................................................1
1.2 Mục đích - mục tiêu và yêu cầu của đề tài ............................................................2
1.2.1 Mục đích của đề tài ............................................................................................2
1.2.2 Mục tiêu của đề tài .............................................................................................3

1.2.3 Yêu cầu của đề tài ..............................................................................................3
1.3 Giới hạn của đề tài ................................................................................................3
1.3.1 Thời gian nghiên cứu .........................................................................................3
1.3.2 Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................................4
2.1 Sơ lược về cây dâu tây ..........................................................................................4
2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây ...................................................................4
2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây dâu tây ................................................................5
2.1.2.1 Nguồn gốc .......................................................................................................5

vii


2.1.2.2 Phân bố ............................................................................................................5
2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây dâu tây................................................................5
2.1.4 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây .........................................................6
2.1.5 Thành phần các chất có trong quả dâu tây .........................................................6
2.1.6 Công dụng của cây dâu tây ................................................................................7
2.1.7 Điều kiện canh tác của cây dâu tây ....................................................................7
2.1.7.1 Đất trồng..........................................................................................................7
2.1.7.2 Khí hậu ............................................................................................................7
2.1.8 Tình hình canh tác cây dâu tây...........................................................................7
2.1.8.1 Trên thế giới ....................................................................................................7
2.1.8.2 Ở Việt Nam .....................................................................................................8
2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật .........................................................................13
2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật ...........................................................................13
2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........................................................13
2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .............................................................................13
2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo ............................................................................................14
2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn ......................................................................................14

2.2.2.4 Nuôi cấy protoplast .......................................................................................14
2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn..........................................................................................14
2.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô .......................................15
2.2.4 Các bước trong nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô ................................15
2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy ......................................................................................15
2.2.4.2 Nhân chồi ......................................................................................................15
2.2.4.3 Tạo rễ từ chồi ................................................................................................16
2.2.4.4 Trồng cây cấy mô ra đất ................................................................................16
2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống bằng nuôi cấy mô.............................17
2.2.5.1 Sự lựa chọn mẫu cấy .....................................................................................17
2.2.5.2 Môi trường nuôi cấy ......................................................................................17
2.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................17

viii


2.2.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật .............................................18
2.2.6.1 Auxin .............................................................................................................18
2.2.6.2 Cytokinin .......................................................................................................19
2.3 Một số nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy mô .....20
2.3.1 Trên thế giới .....................................................................................................20
2.3.2 Ở Việt Nam ......................................................................................................21
2.4 Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hại thực vật .................................................23
2.4.1 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào triệu chứng .........................................................23
2.4.2 Kỹ thuật chẩn đoán bằng cây chỉ thị ................................................................24
2.4.3 Kỹ thuật chẩn đoán bằng kính hiển vi..............................................................24
2.4.3.1 Chẩn đoán bằng kính hiển vi quang học .......................................................24
2.4.3.2 Chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................................................24
2.4.4 Kỹ thuật chẩn đoán bằng phản ứng huyết thanh ..............................................24
2.4.5 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào nucleic acid.........................................................25

2.4.5.1 Kỹ thuật lai phân tử (Molecular hybridization) ............................................25
2.4.5.2 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ............................................................................25
2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR .............................................................25
2.5.1 Kỹ thuật PCR ...................................................................................................25
2.5.2 Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................................26
2.6 Sơ lược về virus SCV gây hại trên cây dâu tây ..................................................27
2.6.1 Phân loại ...........................................................................................................27
2.6.2 Nguồn gốc - phân bố ........................................................................................27
2.6.3 Hình dạng - kích thước.....................................................................................27
2.6.4 Genome ............................................................................................................27
2.6.5 Protein ..............................................................................................................27
2.6.6 Phạm vi ký chủ .................................................................................................27
2.6.7 Phương thức lan truyền ....................................................................................27
2.6.8 Triệu chứng và tác hại của virus SCV trên cây dâu tây ...................................28
2.6.8.1 Triệu chứng ...................................................................................................28

ix


2.6.8.2 Tác hại của virus SCV...................................................................................28
2.6.9 Biện pháp quản lý virus SCV ...........................................................................28
2.6.10 Một số nghiên cứu về virus SCV ...................................................................28
2.6.10.1 Trên thế giới ................................................................................................28
2.6.10.2 Ở Việt Nam .................................................................................................29
2.7 Một số thành tựu trong việc tạo cây sạch bệnh virus bằng phương pháp nuôi cấy
mô ..............................................................................................................................33
2.7.1 Trên thế giới .....................................................................................................33
2.7.2 Ở Việt Nam ......................................................................................................33
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................34
3.1 Thời gian nghiên cứu ..........................................................................................34

3.2 Nội dung và địa điểm nghiên cứu .......................................................................34
3.3 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................34
3.3.1 Giống cây dâu tây.............................................................................................34
3.3.2 Hóa chất ...........................................................................................................34
3.3.2.1 Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô cây dâu tây ..............................................34
3.3.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra virus ...............................................................36
3.3.3 Thiết bị và dụng cụ...........................................................................................37
3.3.3.1 Thiết bị ..........................................................................................................37
3.3.3.2 Dụng cụ .........................................................................................................38
3.4 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................38
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp
với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro.........................38
3.4.1.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................38
3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................39
3.4.1.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................39
3. 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi ...........................................................................................40
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy
lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro ..............................41

x


3.4.2.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................42
3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................42
3.4.2.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................42
3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................43
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự
sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro.................................................43
3.4.3.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................43
3.4.3.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................44

3.4.3.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................44
3.4.3.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................44
3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong
giai đoạn nuôi cấy in vitro sự lên sinh trưởng của cây dâu tây sau khi đượctrồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................45
3.4.4.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................45
3.4.4.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................45
3.4.4.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................46
3. 4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi ...........................................................................................46
3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................47
3.4.5.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................47
3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................48
3.4.5.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................48
3.4.5.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................54
3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................................54
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................58
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp
với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro.........................58
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy
lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro ..............................67

xi


4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự
sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro.................................................76
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong
giai đoạn nuôi cấy in vitro lên sự sinh trưởng của cây dâu tây sau khi được trồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................83

4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn
ươm ...........................................................................................................................91
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................97
5.1 Kết luận ...............................................................................................................97
5.2 Đề nghị ................................................................................................................97
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................99
Phụ lục ....................................................................................................................109

xii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AmpliDet RNA: Amplification and detection of RNA
BA:

6-bezylaminopurine

bp:

base pair

CC:

Chiều cao

CDR:

Chiều dài rễ

cDNA:

Complementary deoxyribonucleic acid

DNA:

Deoxyribonucleic acid

DAS-ELISA:

Direct double antibody sandwich ELISA

DEPC:

Diethyl pyrocarbonate

dNTP:

Deoxyribo nucleic acid triphosphate

EDTA:

Disodium ethylenedia minetera acetate

ELISA:

Enzyme linked immunosorbent assay

EL:

Elution

IBA:

Indole-3-butyric acid

KTL:

Kích thước lá

LC:

Leaves cutting (Cắt lá của chồi)

LC-STW:

Leaves cutting and shoot tip wounding
(Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi)

MĐ:

Mỹ Đá

MH:

Mỹ Hương

mRNA:

Messenger RNA

MS:

Murashige and Skoog

N:

Negative (Đối chứng âm)

NC

No cutting

ns:

Non signification

NSC:

Ngày sau cấy

xiii


NT:

Nghiệm thức

P:

dâu Pháp

Po:

Positive (Đối chứng dương)

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR:

Reverse transcription-polymerase chain reaction

SCV:

Strawberry Crinkle Virus

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SR:

Số rễ

Taq:

Thermus aquaticus

TB

Trung bình

TBE:

Tris base, Boric acid, EDTA

Tm:

Melting temperature

TGPSC:

Thời gian phát sinh chồi

TLPSC:

Tỷ lệ phát sinh chồi

TLS:

Tỷ lệ sống

TLT:

Trọng lượng tươi

TLK:

Trọng lượng khô

TLCK:

Tỷ lệ chất khô

U:

Unit

VNĐ:

Việt Nam đồng

cm:

centimet

mm:

milimet

g (mg):

gram (miligram)

l (ml):

lit (mililit)

µl:

microlit

mM

miliMol

µM:

microMol

pmol:

picromol

Ø:

Đường kính

xiv


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Cây dâu tây (Fragaria spp.) .................................................................. 4
Hình 2.2 Hình dạng trái dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở
Đà Lạt ...................................................................................................... 10

Hình 2.3 Hình dạng cây dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở
Đà Lạt....................................................................................................... 11
Hình 2.4 Một số vườn trồng cây dâu tây ở Đà Lạt ............................................... 12
Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR .............................................................. 26
Hình 2.6 Hình dạng của Strawberry Crinkle Virus .............................................. 29
Hình 2.7 Trình tự genome của Strawberry Crinkle Virus .................................... 29
Hình 2.8 Trình tự base của vùng bảo tồn mã hóa cho Large (L) protein ............. 30
Hình 2.9 Rệp gây hại và lan truyền virus SCV trên cây dâu tây .......................... 31
Hình 2.10 Triệu chứng bệnh virus SCV trên cây dâu tây .................................... 31
Hình 2.11 Vườn cây dâu tây Mỹ Đá bị bệnh virus SCV ở Đà Lạt....................... 32
Hình 2.12 Vườn cây dâu tây Mỹ Hương bị bệnh virus SCV ở Đà Lạt ................ 32
Hình 3.1 Nguồn mẫu cây dâu tây in vitro sạch virus SCV .................................. 55
Hình 3.2 Một số hóa chất được dùng trong kiểm tra virus SCV .......................... 55
Hình 3.3 Một số thiết bị và dụng cụ được dùng trong kiểm tra virus .................. 56
Hình 3.4 Kỹ thuật xếp túi nylon chứa môi trường ............................................... 57
Hình 4.1 Cách đặt mô lá cây dâu tây in vitro trên môi trường nuôi cấy .............. 65
Hình 4.2 Mô lá cây dâu tây được nuôi cấy trên môi trường có nồng độ TDZ
khác nhau kết hợp với NAA (0,1 mg/l) trong điều kiện in vitro ............. 65
Hình 4.3 Chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày ........................................ 66
Hình 4.4 Mẫu cấy cây dâu tây ứng với các kỹ thuật xử lý khác nhau ................. 74
Hình 4.5 Mẫu cấy cây dâu tây .............................................................................. 74
Hình 4.6 Chồi dâu tây Mỹ Hương được phát ....................................................... 74
Hình 4.7 Chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày trong điều kiện .............. 75

xv


Hình 4.8 Chồi dâu tây được cấy vào túi nylon chứa môi trường nuôi cấy .......... 81
Hình 4.9 Các túi nylon chứa chồi dâu tây được bố trí lên kệ nuôi cấy ................ 81
Hình 4.10 Cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày trên môi trường

½ MS với các nồng độ sucrose khác nhau ............................................... 82
Hình 4.11 Giải phẫu mô lá cây dâu tây in vitro (xem dưới kính hiển vi điện tử
40X) ......................................................................................................... 82
Hình 4.12 Hình dạng khí khổng của lá cây dâu tây in vitro Mỹ Hương
sau khi được nuôi cấy 45 ngày trên môi trường không có sucrose
(xem dưới kính hiển vi điện tử 40X) ....................................................... 89
Hình 4.13 Cây dâu tây cấy mô của ba giống dâu tây ứng với các nồng độ sucrose
khác nhau trong giai đoạn nuôi cấy in vitro được trồng ra vườn ươm .... 89
Hình 4.14 Cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày........... 90
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩn PCR trong kiểm tra virus SCV trên cây
dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày ................................... 92
Hình 4.16 Cây dâu tây Mỹ Hương được nuôi cấy trên môi trường có các nồng
độ sucrose khác nhau trong giai đoạn ra rễ in vitro sau khi được trồng
ra vườn ươm 45 ngày ............................................................................... 93
Hình 4.17 Cây dâu tây được dùng để kiểm tra virus SCV ................................... 93
Hình 4.18 Lá cây dâu tây được dùng để ly trích RNA ......................................... 93
Hình 4.19 Các bước thực hiện trong kiểm tra virus SCV bằng kỹ thuật RT-PCR 94
Hình 4.20 Cây dâu tây sạch virus SCV được tiếp tục chăm sóc ở vườn ươm ..... 94
Hình 5.1 Quy trình nhân giống cây dâu tây sạch virus SCV bằng phương pháp
nuôi cấy mô ............................................................................................... 96

xvi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Thành phần các chất có trong quả dâu tây ..................................................6

Bảng 2.2 Năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống cây dâu tây được trồng tại
Đà Lạt.............................................................................................................9
Bảng 2.3 Đặc điểm của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật .........................20
Bảng 3.1 Các nguyên tố đa lượng của môi trường MS ............................................35
Bảng 3.2 Các nguyên tố vi lượng của môi trường MS .............................................35
Bảng 3.3 Các vitamin của môi trường MS ...............................................................35
Bảng 3.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1 .........................................................40
Bảng 3.5 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2 .........................................................43
Bảng 3.6 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 .........................................................45
Bảng 3.7 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 4 .........................................................47
Bảng 3.8 Thành phần hóa chất để thực hiện phản ứng PCR ....................................52
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ...........................................................52
Bảng 3.10 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 5 .......................................................54
Bảng 4.1 Thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi, số chồi dâu tây in vitro
sau khi được phát sinh 45 ngày từ mô lá .....................................................58
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên thời gian phát sinh
chồi, tỷ lệ phát sinh chồi, số chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh
45 ngày từ mô lá ..........................................................................................59
Bảng 4.3 Chiều cao chồi, số lá, kích thước lá, trọng lượng tươi, trọng lượng khô
và tỷ lệ chất khô của chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh 45 ngày
từ mô lá ........................................................................................................61
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên chiều cao chồi, số lá,
kích thước lá của chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh 45 ngày từ
mô lá.............................................................................................................62

xvii


Bảng 4.5 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên trọng lượng tươi,
trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô chồi dâu tây in vitro sau khi được

phát sinh 45 ngày từ mô lá ...........................................................................63
Bảng 4.6 Thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi
được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ..........................................67
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên thời gian
phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi được phát
sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ...........................................................68
Bảng 4.8 Chiều cao, số lá, kích thước lá, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ
lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày trong điều
kiện in vitro ..................................................................................................69
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên chiều cao
chồi, số lá, kích thước lá của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45
ngày trong điều kiện in vitro ........................................................................71
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên trọng
lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi
được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ..........................................71
Bảng 4.11 Chiều cao cây, số lá, kích thước lá, số rễ và chiều dài rễ của cây dâu
tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ..................................................76
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên chiều cao cây,
số lá, kích thước lá của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45
ngày ..............................................................................................................77
Bảng 4.13 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên số rễ và chiều
dài rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ....................78
Bảng 4.14 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây
in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ........................................................79
Bảng 4.15 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên trọng lượng tươi,
trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây in vitro sau khi được
nuôi cấy 45 ngày ..........................................................................................80

xviii

Bảng 4.16 Tỷ lệ sống, chiều cao cây, số lá mới, kích thước lá, số rễ và chiều dài
rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày .........84
Bảng 4.17 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên tỷ lệ sống, chiều
cao cây, số lá mới của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn
ươm 45 ngày ................................................................................................85
Bảng 4.18 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên kích thước lá,
số rễ và chiều dài rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn
ươm 45 ngày ................................................................................................85
Bảng 4.19 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây
in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày .......................................86
Bảng 4.20 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên trọng lượng tươi,
trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây in vitro sau khi được
trồng ra vườn ươm 45 ngày .........................................................................86
Bảng 4.21 Tỷ lệ nhiễm virus SCV của cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn
ươm 45 ngày ................................................................................................92

xix


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 2.1 Các nước sản xuất dâu tây đứng đầu thế giới năm 2007 ........................8

xx

Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Cây dâu tây (Fragaria spp.) là loại cây ăn quả giàu dinh dưỡng. Quả dâu tây
cung cấp nhiều loại chất khoáng như Ca, K, P, Mg, Fe và nhiều vitamin cần thiết
cho cơ thể con người như vitamin A, vitamin B và vitamin C (Đỗ Huy Bích và ctv.,
2004). Trong quả dâu tây còn có chất fisetin, có tác dụng chống oxy hóa, giúp bảo
vệ tế bào khỏi bị lão hóa (Lê Kim Phụng, 2007). Quả dâu tây còn cung cấp ellagic
acid, một chất có khả năng hạn chế được bệnh ung thư (Kjersti và ctv., 2007).
Ở Việt Nam, cây dâu tây được trồng chủ yếu ở Đà Lạt và đã trở thành loại cây
ăn quả đặc sản của vùng này. Việc sản xuất cây dâu tây mang lại hiệu quả kinh tế
cao và ổn định. Hiệu quả kinh tế trong sản xuất cây dâu tây ở Đà Lạt có nơi đạt trên
50 triệu đồng/1.000 m2/năm (Nguyễn Thị Phúc, 2006).
Sản phẩm từ quả dâu tây rất đa dạng. Ngoài việc được sử dụng ở dạng tươi,
quả dâu tây còn được dùng làm rượu vang, mứt và các loại kem. Do đó, nhu cầu
tiêu thụ của quả dâu tây ngày càng được gia tăng.
Việc trồng cây dâu tây còn gắn liền với công nghệ chế biến, góp phần giải
quyết công ăn việc làm cho lao động tại địa phương. Vì vậy, cây dâu tây được xếp
vào danh sách những loại cây trồng được ưu tiên đầu tư theo hướng công nghệ cao
của tỉnh Lâm Đồng (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002).
Cây dâu tây thường được nhân giống truyền thống bằng cách tách thân bò và
tách cây con từ thân chính. Phương pháp nhân giống này cho hệ số nhân giống
không cao, cây con dễ bị nhiễm một số bệnh từ cây mẹ, đặc biệt là bệnh virus.
Chính vì vậy, việc sản xuất cây con giống sạch virus là khâu cơ bản nhất của ngành
trồng cây dâu tây (Trần Văn Minh, 1997).

1

Trong các loài virus gây hại trên cây dâu tây, virus SCV (Strawberry Crinkle
Virus) là loài virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây dâu tây. Virus SCV được lan
truyền nhanh qua các môi giới truyền bệnh (Maas, 1998). Theo kết quả nghiên cứu
của Dương Tấn Nhựt và ctv. (2008), virus SCV đã xuất hiện trên các vùng canh tác
cây dâu tây ở Đà Lạt. Do đó, nghiên cứu để nhân nhanh giống cây dâu tây sạch
virus SCV, sinh trưởng tốt cung cấp cho các vùng canh tác cây dâu tây là vấn đề
thiết thực và cấp bách.
So với phương pháp nhân giống truyền thống, phương pháp nuôi cấy mô có
những ưu điểm như tiềm năng sản xuất nhanh, sử dụng rất ít nguồn mẫu ban đầu,
giúp tạo các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh thông qua chọn lọc nguồn mẫu sạch
bệnh hay làm cho nguồn mẫu trở nên sạch bệnh (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Hiện nay, quy trình nhân giống cây dâu tây nói chung và cây dâu tây sạch
virus nói riêng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được nghiên cứu trên thế giới và
ở Việt Nam. Tuy nhiên, các quy trình đã được xây dựng còn một số hạn chế như hệ
số nhân chồi thấp khi tái sinh chồi trực tiếp từ mô lá. Một số nghiên cứu đã sử dụng
TDZ kết hợp với 2,4-D (một phần của chất độc da cam) để cải thiện hệ số nhân chồi
cây dâu tây. Tỷ lệ sống của cây dâu tây ở vườn ươm thấp. Một số nghiên cứu tạo
cây dâu tây sạch bệnh virus, tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kiểm tra sự nhiễm virus
trên cây dâu tây sau khi trồng ra vườn ươm.
Xuất phát từ tình hình trên, đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống cây dâu
tây (Fragaria spp.) sạch virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) bằng phương pháp
nuôi cấy mô” được thực hiện.
1.2 Mục đích - mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm góp phần xây dựng quy trình nhân giống phù hợp
cho các giống cây dâu tây đang được canh tác tại Đà Lạt, góp phần cung cấp giống
cây dâu tây sạch bệnh virus SCV, sinh trưởng tốt cho các vùng canh tác cây dâu tây.
Đề tài được thực hiện nhằm góp phần hoàn thiện nghiên cứu về nhân giống
cây dâu tây sạch bệnh virus.

2


Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu về nhân giống, tạo
giống sạch bệnh trên cây dâu tây cũng như những nghiên cứu về bệnh virus và nhân
giống cây trồng sạch bệnh virus.
1.2.2 Mục tiêu của đề tài
Tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy giúp nâng cao khả năng tạo chồi, nhân
chồi và chất lượng cây dâu tây nuôi cấy mô.
Tạo cây dâu tây giống sạch virus SCV, có khả năng sinh trưởng tốt sau khi
được trồng ra vườn ươm.
1.2.3 Yêu cầu của đề tài
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc phát sinh chồi từ mô lá cây
dâu tây in vitro.
Xác định kỹ thuật nhân chồi thích hợp cho cây dâu tây in vitro.
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng của cây dâu tây
trong điều kiện in vitro và sau khi được trồng ra vườn ươm.
Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm.
1.3 Giới hạn của đề tài
1.3.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2008 - 10/2009.
1.3.2 Địa điểm nghiên cứu
Nhân giống cây dâu tây thông qua nuôi cấy mô lá đối với ba giống cây dâu tây
Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu Pháp được hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo
Giống cây trồng, vườn ươm của Viện Sinh học Tây Nguyên.
Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây cấy mô sau khi được trồng ra vườn ươm
bằng kỹ thuật RT-PCR, được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật
của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường.

3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về cây dâu tây
2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây
Cây dâu tây có tên khoa học
là Fragaria spp., thuộc:
Giới : Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Rosales
Họ: Rosaceae
Chi: Fragaria L.
Hình 2.1 Cây dâu tây
Hình 2.1 Cây dâu tây (Fragaria spp.)
Trên thế giới có khoảng 20 loài cây dâu tây. Chìa khóa phân loại các loài cây
dâu tây dựa vào số lượng nhiễm sắc thể. Một số loài là lưỡng bội (2n = 14). Các loài
khác là tứ bội (4n = 28), lục bội (6n = 42), bát bội (8n = 56), thập bội (10n = 70).
Lưỡng bội: Fragaria daltonniana, Fragaria iinumae, Fragaria nilgerrensi.
Tứ bội: Fragaria moupinesis, Fragaria orientalis.
Lục bội: Fragaria moschata.
Bát bội và lai ghép: Fragaria x ananassa, Fragaria chiloensis, Fragaria
iturupensis, Fragaria virginiana.
Thập bội và lai ghép: Fragaria x Potentilla, Fragaria x vescana
( />
4