Hoàn thiện quy trình nhân giống lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ
BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ
BÀO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:
TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến
TS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đã
tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận
tình của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xin
chân thành cảm ơn.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành
khóa luận.
Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độ
chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi
rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thể
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình
nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt
Hồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và
chưa được ai công bố.
Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Nhung


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

TDZ:

Thidiazuron


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 3
4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................... 3
NỘI DUNG ..................................................................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến........................................................... 4
1.1.1. Phân loại ........................................................................................ 4

1.1.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................... 4
1.1.3. Sinh học và sinh thái ...................................................................... 5
1.1.4. Phân bố ........................................................................................... 5
1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ........................................................ 5
1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến
ở Việt Nam ................................................................................................ 8
1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ........................................... 8
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến ........ 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................... 10
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................. 12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 15
2.1. Vật liệu thực vật ................................................................................. 15
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 15
2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................ 15
2.2.2. Thiết bị .......................................................................................... 15
2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 15


2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................. 15
2.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 16
2.5.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 16
2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 19
3.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ......................... 19
3.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitro
hoàn chỉnh.................................................................................................. 22
3.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiện
tự nhiên ...................................................................................................... 24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 27

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi
cây lan Kim tuyến ........................................................................17
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α - NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyến
in vitro..........................................................................................17
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyến
in vitro..........................................................................................18
Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) ....................19
Bảng 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến
Bảng 3.3. Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên

....................23

....................................24


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ............................ 4
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................... 16
Hình 3.1. Cụm chồi lan Kim tuyến ............................................................... 21
Hình 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến............... 23
Hình 3.3. Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở các
giá thể khác nhau ........................................................................... 25


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan

(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam [1]. Ở nước ta, cây
lan Kim tuyến mọc rải rác ở trong rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe
suối, ở độ cao 300-1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Tam
Đảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến được cấp báo thuộc
nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích
thương mại [3] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong
sách đỏ Việt Nam [4].
Trong y học, lan Kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho do
phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dày
mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng
cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24].
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những
ưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh
trưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt di
truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần của
các cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản và
lưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanh
nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt
nảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống
mới vào sản xuất đại trà [2].
Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp
không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Theo

Phạm Thị Nhung

1


Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối

với cây khoai tây bằng phương pháp này [11].
Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiều
giai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)
ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên.
Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng. Trong đó giai đoạn quan trọng nhất
quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanh
chồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên [21].
Tại Việt Nam cũng đã có một số công bố về nhân giống và bảo tồn lan
Kim tuyến như: Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã tìm ra môi
trường nhân nhanh thích hợp nhất cho thể chồi và mắt đốt ngang thân là
Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20 g/l
sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l đạt hệ số nhân chồi là 6,55
chồi/mẫu [13]. Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ra
môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và
0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt
[14], tác giả Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm
(Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro [5]… Tuy nhiên, việc
nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiện
được quy trình nhân giống cây lan này. Do vậy, tôi quyết định nghiên cứu
đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện một
số giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảo
tồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống có
chất lượng cho thị trường.

Phạm Thị Nhung

2

2. Mục đích nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo
tồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu
cây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.
3. Nội dung nghiên cứu
Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.
Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.
4. Phạm vi nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro
cây lan Kim tuyến.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấp
cho thị trường.
Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.

Phạm Thị Nhung

3


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến
1.1.1. Phân loại
Giới: Plantea (Thực vật)
Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae
Phân họ: Orchidoideae
Chi: Anoectochilus
Loài: A. setaceus
Tên khoa học: Anoectochilus
setaceus Blume
Tên Việt Nam: Lan Kim tuyến

Hình 1.1. Lan Kim tuyến
Anoectochilus setaceus Blume

Tên gọi khác: Lan Gấm

[24]

1.1.2. Đặc điểm thực vật học
Cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều
mùn, tơi xốp, thoáng khí. Cây bò trên mặt đất cao 10 - 20 cm, thân màu
tím, mọng nước, phần cây non có nhiều lông mềm, mang 2 - 6 lá mọc
cách, xòe trên mặt đất [24].
Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4
x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm

Phạm Thị Nhung

4


với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu - đỏ với mạng gân màu vàng - lục
hay hồng); cuống lá dài 2 - 3 cm [3].
Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình
trứng, chóp thót nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài
2,5 - 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi
bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài
7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [3].
1.1.3. Sinh học và sinh thái
Mùa hoa tháng 2 - 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh
trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,
rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,
riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây
trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [3].
1.1.4. Phân bố
Trong nước: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà
Tĩnh (Hương Sơn: Rào Àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh,
Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh),
Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp) [3].
Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,
Campuchia, Malaixia, Inđônêxia [3].
1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến
Theo các tài liệu của Đài Loan thì lan Kim tuyến là một loại cây thuốc
vô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc và được sử dụng phổ biến
trong nhân dân. Cây lan Kim tuyến có các tác dụng như: tăng cường sức
khỏe, làm khí huyết lưu thông; có tác dụng kháng khuẩn, chữa các bệnh
viêm khí quản, viêm gan mãn tính; chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,

Phạm Thị Nhung

5


đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làm
tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt... Và thường dùng cả cây tươi hoặc khô để sắc
uống, liều thường dùng trong ngày là khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô [25].
Ông Tả Mộc Thuấn - học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu về
Trung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong
dân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ
trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do
rắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [25].
Ông Sơn Điền Kim Trị (1932) cũng đã cho biết: Người dân tộc miền
núi thường dùng Kim tuyến liên sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao,
đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn [25].
Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thích
có viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi [25].
Trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ
A Mộc và Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dược
dụng thực vật, có nói đến Kim tuyến liên là một trong những dược thảo quý
giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan [25].
Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kim
tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc Đài
Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ
phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ
tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau
lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận [25].
Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên
cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa cho biết: Kim tuyến liên tiêu

đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêm
gan, trị mụn và thường dùng cây tươi sắc uống [25].

Phạm Thị Nhung

6


Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, các
nhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấp
các bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như
[26]:
Điều trị ung thư: “Các chất chiết xuất từ thực vật Chi Lan Kim Tuyến
A. formosanus và các thành phần có nguồn gốc từ nó được sử dụng như là
các loại thuốc thảo dược hoặc các chất bổ sung dinh dưỡng để ngăn ngừa
hóa chất (chemoprevention) hoặc điều trị bệnh lý ác tính của con người”.
Nghiên cứu này đã được cấp bằng sáng chế ở Mỹ (US 7033617 B2).
Tăng cường miễn dịch: Chi Lan Kim Tuyến có tiềm năng tăng cường
hệ miễn dịch. Các kết quả nghiên cứu cho thấy những tác dụng tăng cường
hệ miễn dịch rất quý của dịch chiết Chi Lan Kim Tuyến.
Bảo vệ gan - Giải độc rượu: tác dụng bảo vệ gan, giải độc rượu của
Chi Lan Kim Tuyến đã được chứng minh bằng nhiều công trình khoa học.
Dung dịch nước chiết xuất của Chi Lan Kim Tuyến formosanus đã cho
thấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể so với silymarin tiêu chuẩn. Các nghiên
cứu độc tính cấp đã kết luận rằng nó có thể được coi là an toàn trong một
thời gian dài.
Điều trị tiểu đường: kinsenoside là một hợp chất hoạt tính sinh học cơ
bản có trong lan Gấm. Nó thể hiện các hiệu ứng dược lý như chống mỡ
máu, chất chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, và các hoạt
động bảo vệ gan và gần đây đã được phát triển như là một ứng cử viên

thuốc trị đái tháo đường.
Chống loãng xương: chiết xuất Chi Lan Kim Tuyến formosanus
(arabinogalactan prebiotic) làm tăng hấp thu canxi và ngăn chặn sự tiêu
xương.
Bồi bổ cơ thể: rất nhiều khoáng chất hữu cơ và axit amin có trong lan
Kim tuyến giúp bồi bổ cơ thể phục hồi khí huyết.

Phạm Thị Nhung

7


1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến ở Việt Nam
Ở Việt Nam, lan Kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể
không nhiều, tái sinh chậm đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày càng
hiếm.
Theo khảo sát, nước ta có tới 15 loài lan Gấm phân bố rải rác ở rừng
nhiều tỉnh, có thể tập hợp lại, trồng, xuất khẩu thu lợi nhuận. Tuy nhiên,
cách khai thác loại dược liệu quý này mới chỉ là dạng nhỏ lẻ [27].
Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mối
Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng
/1 kg tươi. Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lá
lan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng
1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên
1,2 - 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi [27].
Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến
đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu
không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được xếp
trong nhóm IA của Nghị Định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì
mục đích thương mại [3].

Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,
công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,
chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triển
cũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nước
ngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.
1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam
Theo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chi
lan Kim tuyến gồm có những loài sau [6]:
+ Loài Anoectochilus daoensis Gagnep. Còn gọi là Giải thùy tam đảo,
phân bố ở Tam Đảo.

Phạm Thị Nhung

8


+ Loài Anoectochilus elwesii (Hook.f.) King & Pantl. Còn gọi là Giải
thùy Elwes, phân bố ở Lào Cai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ.
+ Loài Anoectochilus lanceolatus Lindl. Còn gọi là Giải thùy thon,
phân bố ở SaPa, Ba Vì.
+ Loài Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie. Còn gọi là Giải thùy
Lyle; phân bố ở Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Gia Lai, Kontum, Bảo Lộc, Đà Lạt.
+ Loài Anoectochilus siamensis Schltr. Còn gọi là Giải thùy Xiêm;
phân bố ở Mường Xen.
+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilus
roxburghii (Wall.) Lindl.). Còn gọi là Giải thùy Roxburgh (còn Võ Văn
Chi gọi là Sứa hồng); phân bố ở Tam Đảo, SaPa, Quảng Trị, Bình Trị
Thiên, Gia Lai, Kontun.
Theo Sách Đỏ Việt Nam (Phần II. Thực Vật), có 5 loài lan Kim tuyến
cần phải bảo vệ vì là những loài có trong “Danh mục Thực vật rừng, Động

vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1)” của nghị định số 32/2006/NĐ - CP
ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục
đích thương mại; trong đó có 4 loài thế giới chưa biết, được phát hiện ra vào
năm 1990 và 1996 và hiện chỉ có ở Việt Nam. Năm loài lan Kim tuyến đó
có tên như sau [3]:
+ Loài Anoectochilus Acalcaratus Aver; còn gọi là Kim tuyến không
cựa, mới được phát hiện năm 1996, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấy tại
Kon Tum (Ngọc Linh); thế giới chưa biết.
+ Loài Anoectochilus Calcaretus Aver; còn gọi là Kim tuyến đá vôi,
mới được phát hiện năm 1996, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Hà Giang (
Quản Bạ, Cán Tỷ), Hòa Bình (Mai Châu), Quảng Bình (Kẻ Bàng), Lâm
Đồng (Bi Đúp), Khánh Hòa (Hòn Giao); thế giới chưa biết.

Phạm Thị Nhung

9


+ Loài Anoectochilus Chapaensis Gagnep; còn gọi là Giải thùy Sa Pa,
được phát hiện năm 1931, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Lào Cai (Sa Pa),
Thừa Thiên - Huế (Bạch Mã); thế giới chưa biết.
+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilus
roxburghii (Wall.) Lindl.); còn gọi là Giải thùy tơ, Giải thùy Roxburgh,
Kim tuyến đỏ, Sứa hồng; được phát hiện năm 1825, phân bố ở Lào Cai (Sa
Pa, Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn, Rào Ân),
Quảng Trị, Kon Tum ( Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư Morm
Ray), Đắk Lắk (Krông Bông, núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương,
núi Bì Đúp).
+ Loài Anoectochilus Tridentatus Seidenf. Ex Aver; còn gọi là Giải
thùy Ba Răng, được phát hiện năm 1990, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấy

ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo); thế giới chưa biết.
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu
tìm các biện pháp nhân giống loài lan Kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bị
tuyệt chủng.
Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loài
lan A. sikkimensis và A. regalis. Hai loài lan Kim tuyến này được nuôi cấy
trên môi trường Woody Plant Medium (WPM) sau 12 tuần tỷ lệ callus được
tạo ra 4,8 - 5,6 và số chồi tương ứng 95 - 98%. Khi mẫu được cấy chuyển
sang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi đỉnh là 8,2
đối với loài A. regalis. Còn đối với loài A. sikkimensis sự bật chồi chậm hơn,
số chồi bên đạt 12,3 và chồi đỉnh là 4,3 [17].
Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giả
Huang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ
sung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triển
protocom từ hạt của A. roxburghii [18].

Phạm Thị Nhung

10


Vi nhân giống cây A. formossanus được tác giả Ket N.V và cộng sự
(2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bị
tuyệt diệt. Đã tìm ra môi trường nhân nhanh cụm chồi thích hợp nhất là môi
trường Hyponex có bổ sung 1 g dm-3 Benzyl adenin hoặc 1 - 2 mg dm-3
Thidiazuron (TDZ). Bổ sung 1 g dm-3 than hoạt tính vào môi trường có chứa
TDZ thúc phát triển chồi (11,1 chồi/mô cấy). Tuy nhiên, tốc độ chồi tái sinh
chậm và không kéo dài thân. Trên môi trường Hyponex bổ sung 2% đường

và 0,5 g dm-3 than hoạt tính thích hợp cho sự phát triển cụm chồi và tỷ lệ cây
ra rễ là 100% [19].
Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài lan Kim
tuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt in
vitro. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung
0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1 mg dm-3 (TDZ) và 1,0 mg dm-3
(NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khi
chuyển ra nhà kính [22].
Zhou YuMei và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xây dựng quy trình
nhân nhanh giống cây A. formosanus. Kết quả cho thấy: Môi trường tối ưu
cho nhân nhanh chồi là môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 5% nước
dừa và 3% đường. Môi trường thích hợp cho rễ phát triển là môi trường
MS bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,5 mg/l indol 3 – butyric acid (IBA) và 2 g/l
than hoạt tính. Giá thể ra cây trong vườn ươm tốt nhất là rêu và sử dụng
dinh dưỡng Hyponex 2 (20: 20: 20) bón tốt nhất cho cây A. formosanus
trong vườn ươm [23].
Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn
và phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự
(2012) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi

Phạm Thị Nhung

11


trường MS có bổ sung 3,0 mg/l TDZ và 3,5 mg/l KI thích hợp nhất cho nhân
nhanh cụm chồi. Tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3 g/l
than hoạt tính [16].
Từ các kết quả trên cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên
cứu đối với loài lan Kim tuyến. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong

việc giúp các nhà nghiên cứu nước ta kế thừa kinh nghiệm để đem lại hiệu quả
cao trong việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến trong điều kiện Việt Nam.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây lan Kim tuyến đang có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức.
Vì vậy, trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về loài
lan này nhằm phát triển và bảo tồn nguồn dược liệu quý.
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh
chồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Kết quả
cho thấy: môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim tuyến in
vitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ
2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổ
sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l
dịch chiết khoai tây + 20 g/l saccarozơ + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính [9].
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái,
phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở vườn quốc
gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10].
Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn
nguồn dược liệu quý. Kết quả cho thấy: cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là
thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và đưa vào các môi trường
nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Tiếp đó, các chồi và mắt đốt được
chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BAP, KI, α - NAA trong

Phạm Thị Nhung

12


4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang
thân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l

saccarozơ + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l cho hệ số nhân chồi là 6,55
chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3 - 4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro.
Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường
có bổ sung 1 mg/l α - NAA [13].
Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và sự kết hợp giữa Kinetin và 2,4 D đến quá trình hình thành protocom-like bodies ở cây lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume), tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự
(2014). Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan Kim tuyến được sử dụng
làm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành PLBs trong môi trường
Knudson C lỏng chứa 100 ml.L-1 nước dừa và bổ sung Kinetin hoặc sự kết
hợp giữa Kinetin với 2,4-D. Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhất
trên môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa
và 0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng
tốt. Trong khi đó, sự kết hợp giữa 2,4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1 với một số
nồng độ của Kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg.L-1) không có tác dụng lớn trong việc
cảm ứng hình thành PLBs ở cây lan Kim tuyến [14].
Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển
của cây lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro, tác giả
Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015). Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả cho thấy,
trên môi trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có bổ sung 1,0 mg/l BA
có sự khác biệt đáng kể về chiều cao chồi, khối lượng tươi và khối lượng
khô (6,70 cm; 1,41 g và 0,1751 g; tương ứng), đặc biệt số đốt (6,33 đốt/mẫu)
đạt cao nhất so với các nghiệm thức khác. Sau đó, các đốt thân tiếp tục được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp α-NAA ở các nồng
độ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và

Phạm Thị Nhung

13

phát triển của chồi cây lan Gấm. Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường có
bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp 1,0 mg/l α - NAA các chồi có sự sinh trưởng
và phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03 cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượng
tươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187 g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33
rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm). Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenol
trong mẫu tiết ra nhiều. Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy:
lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, các
chồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ phát
triển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa [5].
Từ các kết quả trên cho thấy ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu
về việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến. Tuy nhiên, việc nghiên cứu
này mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được kỹ thuật
trồng, chăm sóc đầy đủ. Các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất.

Phạm Thị Nhung

14


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu thực vật
Cây lan Kim tuyến in vitro do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn
vỉ xốp nuôi cấy,…
2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: cân kĩ thuật, máy đo

pH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, buồng cấy vô trùng, máy
khuấy từ ra nhiệt,…
2.3. Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng
cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [20]: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7
g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng.
pH môi trường: 5,8
Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC
trong 15 phút.
2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối.
Nhiệt độ: 25 ± 2o C.
Độ ẩm: 70 - 80%
Cường độ ánh sáng: 2000 lux.

Phạm Thị Nhung

15


2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu được tiến hành gồm 3 thí nghiệm, các thí nghiệm được bố
trí theo sơ đồ hình 2.1.
Cây lan Kim tuyến in vitro
+ BAP

+ Kinetin

Nhân nhanh lan Kim tuyến
+ NAA
Tạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh

+ Xơ dừa, đất, phân bò
Rèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần
nhắc lại.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường, 7 g/l
agar có bổ sung KI và BAP với nồng độ như sau:

Phạm Thị Nhung

16