DSpace at VNU: Một số đặc điểm cấu trúc phân tử của lectin hạt chay (Artocarpus tonkinensis A. Chev)

T Ạ T C H Í K H O A HỌC' N o 4 - 1993

MỘT SỐ DẶC DIỂM CẤU TRl' C PHÂN T Ử CỦA
LECTIN HẠT CHAY (Artocarpus tonkinensis À. Chev)
DỖ Ngọc Liên
Dại hoc Tổng kơp Hà N ó I

Michèle Bnllard, Johan Hoebeke
Đại học T outs (Pháp)

Lecíin ch ửa t rong h ạ t của một số loài thuộc giống Artocarpus của họ dâu t ằ m (Moraceae) là
một d ạ ng glycoprotein đang được nghiền cứu rất m ạnh mẽ hiện nay trên thế giới vì nó là p hư ơ ng
tiện r ẩt qúi trong nghiền cứu hóa học miễn dịch, miên dịch tế bào và đặc biệt dùng để chẩn đoán
lâm sàng các bệnh do vi rút và ký sinh trùng (A ucouturier và cộng sự, 1989 [6])- Mói đây Pineau
và các cộng sự Ị11 ] đã t hấ y lectin của một vài loài thuộc giống A r tocarpus có khả năng kích thích
chọn lọc các lymphoxit T-CD4, qua đó đang được t h ử nghiệm làm chấ t đánh giá hoạt động ly mph o
hào (V các bệnh nhân n^ắc bệnh SIDA, một căn bệnh rất nguy hiểm hiện nay
Th e o Jarrett [9j và Darrau [7] trên th ế gicri hiện nay tồn tại 50 loài và dircri loài khác nhau
thuộc giống Artocarpus, còn òr Việt Nam, theo các điều t ra của nhiều nhà phân loại trong và ngoài
nước có ít nhất t ừ 10 đến 12 loài thuộc giống A rtocarpus [3Ị.
Các tài liệu nghiên cứu về lectin của một số loài như mít (Artocarpus integriíolia, hoặc tên
đong nghĩa là A. heterophillus), cây bánh mì (A altilis) và Sake (A incisa) đả đira ra nhiều đặc
điểm giống nhau và khác nhau về đặc tính cấu tạo phân t ứ và miên dịch của chúng. Tuy nhiên,
hiện tại số loài thuộc giống này còn chưa được nghiên cứu nhiều và điều rất quan trọng là cần
hiểu b iết t h ấ u đáo đặc tính phân t ứ v à miễn dịch của các loại lectin thuộc các loài khác n h a u để
cổ thể s ử dụng chính xác và cố hiệu quÀ trong nghiên cứu y học, miễn dịch và lâm sàng.
Trước đây, chúng tôi đả có một số kết quả th òn g báo về lectin hạt chay [2]. Bài này tiếp tục
trì nh bày một số kết quả mới nhận đ ược về đặc tính phân t ử của lectin hạt chay. Công trình này
đ ả v à đang được t hưc hiện (V khoa Y, tnròĩig đại học Tours, nước Cộng hòa í ^ á p .

N G U Y Ê N LIỆU VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P

Hạ t chay đượ c th u hái A Fỉhú Thọ, xấy khô 50"C sau đó được nghiền nhổ t h à n h hột mịn.
Việc chiết x u ấ t lectin và kết t ủ a dịch chiết hằng 60% sunphat amôn bâo hòa đ ả đ ư ợ c m ô tả trước
dây Ị1, 2|. Các chế p h ẩm lectin thô đ ư ạ c dùng để tinh chế tiếp theo trên cột Sepharose 4B - muxin
theo kỷ t hu ật của Freier, Gleishmann và Riidiger (1985) [8] nhưng đả đirợc cải tiến và hoàn thiện
trong phòn g t h í nghiệm Protein, Khoa Y, đại học Tour3.
- Q u á trì nh sắc ký ái lực được theo dõi bằng máy p h á t hiện nồng độ protein, có bộ ph ậ n vê
t ư động đo thị (Dectector Monitor - ƯV. 1 LKB. T h ụ y Điền). Hoạt động lectin đirợc đ á n h giá
n h ư dà mô t ả trư ớ c dầy Ị1, 2|.
- Kiếm t ra độ tinh khiết cứa chế phẩm lectin bằng điện di trên geỉ polyacrilamit 15%, có mặt
55


SDS, vói các m ẫ u lectin có sử lý và không siV lý beta meca pto êtanol, theo kỷ t h u ậ t của Laennnli
1,2).
- Tách các tiểu đem vị củ a lectin chay bẵng kỷ t h u ậ t sắc ký thể dịch cao áp H P L C trong hệ
thống máy Applied Biosystems - 1000S Diode Array Dectecton” của Mỹ
- P h â n tích trình t ự axit aniin tận cùng N của các phân đoạn tácli đư ợ c t ừ H P L C trên
máy phân tích t ự động “Applied Biosystems 477A proteins sequencer” của Mỹ. Các dần x u ấ t
phenyltiohycỉantoin ciia các axit anũn đươc xác định và vẽ đồ thị t ự đông trên máy “Model 120A
- Analyser”
- Xác định số lưẹrng phân t ử tirozin và triptophan theo phưcmg pháp quang phổ d o Tinoco
I., Sauer K. và Wang. J. c . (1978) đả mô tả ị 13].
- Sổ lượng phân t ử xistein trong một phân tii* lectin đirạc xác định theo kỷ t h u ậ t dã được
Hirs v à Timasheff mô tả f 12].

K Ế T QUA VÀ T H Ả O LUẬN
1. T in h chế lectin h ạ t chay

§

ầ £S\

f
§

0,3
mo

I

m

0,2

C:
t' ùŨ Ố
^
4GC

0. i

2Ữ0
lĩ^ầM
Hinh 1. Đồ thị slc ký ái lực chế phẩm lectin thô (Kết tủa bằng 60% sunphat A môn bão hòa) trên
cột Sepharose-4B-muxin ( 1 , 2 x 4 cm) đircnig đồ thị (-) chl rỏ nồng độ protein đo ở 280 nm và hoạt động
lectin (- - - o -----) xuất hiện khi phdn hấp thụ bring Metyl a - D - galactozit 0,1 M
Bàng phưcmg ph áp sắc ký ái iưc trên cột Sepharose- 4B - muxin qua 10 lần lặp lại thí nghiệm
t ừ 10 gam bột hạt chay có thề thu nhận tính trung binh đirợc 330 miligam protein lectin có độ
56

11IIh khiết cao. Như vậy, h à m lượng lectin chay khá cao, trung bình bằng 3,3% so với trọng lưựng
bôt hạt khô có ẩm đô 8%.
Hình ành à dồ thi 1 (hình 1) cho thấy rõ, khi sử dụng Methyl a - D galactozit 0,1 M để phản
hấ p t h ụ lectin tír côị Sepharose-4B-muxin thì có một đỉnh protein cổ hoạ t động lectin khá cao.
Điều này không có
ý nói rằng chỉ có một kieu phân t ử lectin b&i vì các nghiền cửu trirứí (lây
[2Ị đà cho t hấ y ít n h ấ t có 2 dạng izolectin chay.
Đe kiểm tra n u n độ tinh khiết của chế phẩm lectin chay, chúng tôi đà s ử dụ ng phircrng pháp
điện (li trên geỉ po lyacrylamit 15%, có m ặ t SDS. Kết quẢ cho t h ấy rằng chế p hẩ m lectin đả tinh
chế chỉ cho hai bang r ấ t đậ m Ằ vị trí khoảng 14 và 17 kD và một băng rất m ờ ỈJ vị trí khoảng
18kD
Các kết qu ả nghiên cứu này phù hcrp với thôn g báo trirớc đây [2] nhưng khác so vói các kết
q u ả ciia Ahnied và Chat ter jee (1986) khi họ nghiên cứu lectin của hạt m ít của An độ [5j. Chún g
tôi cho rằng trong lectin chay tồn tại ít nhất hai tiểu đơn vị có phân t ứ lượng khoảng 14 và 17 kD,
giống nỉnr nh ừng đieu m à Moreira và Oliveira đ ă phát hiện ra ò lectin hạt mít và hạ t Sa kê (A.
incisa) của Brezin ' 10]. Dể giii thích hiện tirợng xuất hiện các băng protein có khối lượng ph â n t ứ
rất lớn trên điện di đô thị khi không sử lý bêta m ecapto êtanol đối với lectin t rư ớ c khi cho diện
di, có thể cho rằng bản chất cấu trúc rất kị nước của lectin chay đả làm cho các chuỗi poly pep tit
rủ a chúng rất dễ kết tụ với nhau trong môi t r ư ờ n g kiềm. Hiện tư ợ n g kết tụ này (aggregation)
th'n'mg xay ra và đ ả được chứng minh ỉf các protein m àng kì nước [4Ị.

*ij/j h ú 1
ữ

7/X

rvị

r

ũ, 2 h

1

1

1

i
*
X1
>

/ỉ 7

PK

24.2

0

1

0.1*■ ị
X
y

c ,i:\
Ịr

Á tỵ
A

í
VX'
Ị

C.C51 ụ

I//
íA

ỉ
£>4
Evnĩpgm

36

30
ôetup

ÕtQỈus

42

Pstproc

M o n ito r

48

Thơ! g io n

phut

Hình 2 Đồ thỊ sắc ký của quá trình tách các phân đoạn lectin chay trên máy 3 ắc ký thế dịch cao áp
(HPLC). Các phân đoạn đirọrc tách ra ở các nồng độ axetônitril đirạc máy t ự động ghi rõ trên đồ thị.

2. T á c h riêng các tiểu dơn vị lectin và phân tích trìn h t ự axit arnin
Để hiểu rỏ sâu sắc đặc tính phân t ử của ỉectin chay, chúng tôi đã sử dụng kỹ h t u ậ t sắc ký
thể dịch cao áp ( H P L C ) tách riêng các tiểu đlectin chay được s ử lý bằng beta mecaptoêtanol và 4-vinylpyridin. Kết quả cho t h ấ y rằn*?, tron e
57


q u á t r ìn h b iế n đ ổ i g ra d ie n t n ồ n g độ a x e t o n it r il t ừ 0 đến 8 5 %

đ à tá c h đ ư ợ c 3 đ in h protein

CẮC

nồng độ khác nh au. Đó là các phân đoạn 57%, 77% và 83% (gọi t ắt là phân đoạn 57, p h â n đoạn
77 v à ph â n đoạn 83).
Các ph â n đoạn protein được thu lại, cô trong chân không v à sau đố điện di trên gel polyacriỉamit 15% cổ m ặ t SDS và b e ta mecaptoêtanol. Kết q u ầ điện di cho t h ấy phân đoạn 77 chỉ cho
một băng protein duy n hấ t tưcmg ứng vói vị trí c ủ a tiểu đơn vị 14kD, phân đoạn 83 cho hai băng
protein t ư ơ n g ứng với vị trí cúa 2 tiểu đơn vị 14 v à 17 kD, còn phân đoạn 57 không cho kh ầ năng
p h á t hiện th êm một loại protein trên gei polyacrilamit 15%.
N h ư vậy, n h ờ phân tích H P L C đ ã cho thấy có 3 dạng chuỗi poly pep tit có m ặ t ờ lectin hạt
chay. Đó là 2 chuỗi poly pep tit lón hay hai tiểu đơ n vị 14 và 17 kD đã được phát hiện dễ dàng
trong điện di trên gel polyacrilamit 15%, chuỗi pol ypeptit t h ứ ba rất nhổ có khối lượng p h â n t ử

chl vài ngàn dalton. Khi nghiên cứu phổ h ấp thụ của các phân đoạn 57 và 83, chúng tôi p h á t hiện
t h ấ y s ự sai khác đá ng kể trong cấu tạo phổ của chúng. Hình dạ n g phổ c hứng tổ phân đo ạ n 57 có
c h ứ a d ẫ n x u ấ t pyridin c ủa xistein và phenylalanin. Còn phân đoạn 83 c hứa nhiều axit a m in vòng
n h ư tirozin và t r i p to p h a n (hình 5).
3

t

\
- .4 .X^=JB3B»k.

«3»

o

N
«\rf

o

V.

CJ

Q

(■T

Ịr>

<\l

Coc bươc scng /I

o

X.
W-I

CQC bươc 5CPỌ

4

Hình 5. Phổ hấp thụ của các phân đoạn polypeptit 57 và 83 cho thấy sụ* khác nhau giừa phân đoạn
57 chứa dẫn xuất của xistem vái pyridim và phênyìaianin (mũi tên, A), và phân đoạn 83 chứa nhiều axit
amin vòng (firozin và trỉptôphan) * (mũi tên, B)
TVình t ự x i p xếp các axit aniin tận cùng N của các phân đoạn polypept.it 57, 77 và 83 đ â
đượ c phân tích trên m áy “ Applied Biosystems 477A proteins Sequecer” . Kết quẰ phân tích cho
t h ẩ y rằng phân đoạn 77, tức ìà tiểu đơn vị 14 kD bao gom một trình tụ* của '27 axit amin đâ đirợc
p h á t hiện, còn ph â n đoạn 57 có trình t ự của 22 axit amin, được trì nh vày dướ i đây:

58


p h â n đoạn 77 (14 kD):
20

10

G K A F D D G A F T G I R E I N L S Y N K E T A I G D

P h â n đoạn 57:
10

20

K Q R S G E S Q N I I V G S W G A K V S R Q
Khi phân tích trình t ự phân đoạn 83, chúng tôi cũng thu đươc m ột trình t ự axit amin tư ơ n g
t ự n h ư phân đoạn 77. Két qu ả này chứng minh r ất rn một đặc điểm quan trọng trong cấu trúc
ph â n t ử củ a lectin chay và rất có thể là của một số loài tronggiống A r to car pu s là: trì nh t ự axit
amin của các tiểu đcm vị 14 và 17 kD hoàn toàn giống nhau ít nhấ t ỈJ 27 axit am in đầu tiên, t ận
cùng N c ủ a chuỗi polypeptit.
Có th ể giải thích rõ th ềm kết quả v ừ a thu được ịr trên nh ư sau: vì hai tiểu đ ơ n vị cùng có
m ặ t trong phâ n đoạn 83, khi ph â n tích trình t ự chi cho một kết qu ả duy n h ấ t thì cả hai tiểu đơn
vị này phải có trình t ự axit amin tận cùng N giống nhau.
Các nghiên cứu của M. Young và cộng sự (1989) [14] cũng cho biết rằng trì n h t ự axit amin
t ận cùng N củ a chuỗi pol ypeptit lớn của lectin hạt mít (A. integrifolia) (Họ gọi là chuỗi a ) bao
gồn 33 axit amin trong đó có 27 gốc axit amin t ận cùng N đầu tiên giống hệt n h ư các kết q u ả m à
chúng tôi nhận đượ c ỉr chuỗi 14 và 17 kD của lectin hạt chay.
Tuy nhiên, M. Young và cộng sự đã sứ dụng các mẫu lectin hạt mít sử dụng lý hóa học
trước khi phân tích HPLC khác vói phương pháp của chúng tôi nên họ đã thu được ngoài chuẫi
pol yp ept it lớn, còn có tói 3 chuỗi polypeptit nhổ, nên kết quả trình t ự của các chuỗi nhỏ khác vói
chúng tôi. Trong s ự khác biệt ấy, r ất có thể là do bản chất loài của giống A r t o c a r p u s qui định.
Dù sao chăng nửa, các tiểu đcm vị 14 và 17 kD của hai loại lectin chay và mít có đặc tính bảo th ủ
cấu trúc r ất cao. Đặc tính này đ ã qui đinh sự giống nhau về chức năng tircnig tác với loại đưòrng
và một số đặc điểm miễn dịch khác của hai loại lectin chay và mít.
Một đặc điểnuquan trọng trong cấu trúc phân tử của lectin chay, cũng giống như mít, đã
đượ c chúng tôi p h á t hiện là s ự liên kết với nhau giữa hai tiểu đơn vị 14 v à 17 kD để hình t h à n h
các dime là sự liên kct không cộng hóa trị và không có cầu disulphit giữa hai tiểu đ ơ n vị, cũng
như trong 1 chuỗi polypeptit, bổri vì cả hai loại lectin này chì có một gốc xistein được phát hiện
(being 1). Bằng ch ứng n ử a chứng tổ điều trên là, không cần x ử lý b e ta m eca p to ê ta n o l, các tiểu

đơn vị của lectin vẫn được tách biệt ra trong điện di trên gel polyacrilamit có m ặt SDS.

Bảng 1. Số lượng các gốc axit amin xistein tr i p to p h a n và tirozin
có m ặt trong một phân t ử lectin chay và lectin mít
Lectin
ciia hạt

Số gốc xistein
trong phân t ử

Số gốc t r ip to ph a n
trong phân t ử

Số gốc từo z in
trong p h â n t ử

A. tonkinensis

1

4,4

18

A. integrifolia

1

4,0

15

Đặc điểm tiếp theo trong cẩu trúc phân tứ lectin chay là số lượng các gốc triptophan, từozin
gần £Ìổng như lectin hạt mít. Đặc điểm cuối còng đã được phát hiện trong cấu t r ú c ph â n t ử
59


lectin h ạ t chay là chứng minh được s ự tồn tại ciìa một chuôi pol ype ptit có p hâ n t ứ lượn g khá
nhồ bên cạnh các chuỗi polypeptit low, là điều hiếm th ấy trong cấu trúc các phân t ứ protein. Để
giải thích hiện t ư ợ n g này, chúng tôi cho rằng rất có thể sự xuất hiện của chuỗi p o l y p e p t it n h ổ là
do q u á trì nh proteolyse nội sinh của chuỗi polypeptit 17kD xẩy ra sau khi phiền dịch (protéolyse
post-traductionelle). M uốn chứng minh được điều này cũng nh ư muốn tìm hiểu sâu t h ê m sự khác
biệt cấu trú c phâ n t ử của các lectin hạt chay và các loài thuộc giổng Artocarpus, cần phải p hâ n
tích đầy đủ trình t ự axit ami n cứa các tiểu đơn vị 14 và 17 kD để t ì m ra trình t ự m à t ừ đó p h â n
đoạn 57 đ ả được tách ra.

TÀ I LIỆƯ T H A M KH ẢO
1

Đỗ Ngọc Liên, Nguyên Văn Đồng và Nguyên Chí Tuyển - 1987. Một số tính chất của lectin t ừ
hat đậu Dolichos bifloru? mới đircrc trồng ỏ* Viêt Nam. Tap chí Sinh hoc No.4, Tâp 9(4): 38-42.

2.

Đỗ Ngọc Liên và Trần Tuẵn Qu ỳnh - 1991. Tách, tinh chế và nghiên cứu một 80 tính chất của
lectin hạt chay (Artocarpus tonkinensis A. Chev) Tạp chí Sinh học No.2 Tập 13: 20-27

3.

Vỗ V ă n chi, Vủ Văn Chuyên - 1973. Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật Hà Nội.

4.

Do Ngoe Lien, p. P a r o u t a u d , I. Dunia, E. L. Benedetti and J. Hoebeke - 1985.

Sequence

analysis of peptide fragments from the intrinsic membrane protein of Calf lens fibers MP26 and its
natural maturation product MP22. FEBS letters 181: 74-77
5.

Ahmed. H, B. p. Cha^terjee - 1986. Purification and characterization of an a-D-galactosyl-binding
lectin from the seed of jack fruit (Artocarpus integrifolia). Lectin Vol V-1986 - Walter de Gruyter
and Co. Berlin- New York - Printed in Garmany.

6.

Aucouturier p., Pineau N., Brugier J. C; Mihaesco E.; Du arte F., Skvaril. F, and F r e u d ’
h o m m e J. L.1989. Jacalin: a new laboratory tool in immunochemistry and cellular immunology. J.
Clin. Lab Anal 3: 244-251.

7.

B ar rau J. 1976. Breadfruit and relatives Artocarpu9 sp. (Moraceae) In Evolution of Crop Plants
(Edited by Simmon N.w ) pp. 201 - 202. Longman, London.

8.

Freier. T, G. Fleish m an n, H. Riidiger 1985. Affinity chromatography on immobilized hoggastric

mucin and ovomucoil. Biol. them. Hoppe Seyler 336: 1023-1028.

9.

J a r r e t t F.R. 1959. Studies in Artocarpus and allied genera III. A revision of Artocarpus subgen us,
Artocarpus. J. Arnold. Arb 40: 113 - 368

10.

Moreira R. A. and J. T. A. Oliveira, 1983, Lectins from the genus Artocarpus. Biologia Plantarum
(Praha) 25(5): 343-348.

11.

Pineau N., p. Aucouturier, J. p. P r e u d ’ homme, K. Hagiwara and K. Kobayashi 1991. Pro
liminary communication: Structural and functional variability of jacalin. Molecular Immunology Vol.
28 No. 1/2: 185 - 187

12.

Hirs c . H. w and Tiniasheff s. N. 1972. Methods in Enzymology Vol XXV: page 462-463

13.

Tinoco. I, J. K. Sauer, J. c . Wang, 1978.
Biological Sciences.

14.

Young N. M, R A z Johns ton; A. G. Szabo, and D. c . Watson, 1989. Homology of the

D-Galactose-specific Lectins from Artocarpu? integrifolia and Maclura pomifera and the role of an
Unusual Small polypeptide Subunit. Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 270 No.2. M a y 1
pp

596 - 603.

60

Physical chemistry Principles and Applications in


SOME PROPERTIES OF MOLECULAR STR UC TUR E
O F A R T O C A R P U S T O N K I N E N S I S S E E D L EC TI N

Do Ngoc Lien
Hanoi University , Vietnam

Michele Brtllard and Johan Hoebeke
University of Tours, France
A lectin was isolated and purified from the phosphate buffered asline extract of the acha y”
seeds (A r to c a rp u s tonkinensis) using a Sepharose - 4B - mucin column. This lectin was composed
of su bu n its of molecular masses 14 and 17kD - in the SDS - polyacrylamide gel e le c tro p h o re s is .
Reverse - phase high p[erformance liquid ch rom ato gr ap hy showed the presence of three poly pep tid e
chain es of 14, 17 kD and smaller molecular masses.
T h e N. ter m in a l aminoacid sequences of three polypeptide chaines were d e ter mi ne d. The
results obt ain ed were discussed and co mpared with the lectins of some species of Art ocarpus.

61