Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình tự gen phân loại cây sói rừng (sarcandra glabra (thunb ) nakai)

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
----------

MAI HOÀNG OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC
ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI
CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên – 2016


ii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
----------

MAI HOÀNG OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC
ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI
CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên - 2016


iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu,
các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công
bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016
Tác giả luận văn

Mai Hoàng Oanh


iv

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị
Hải Yến - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và ThS. Hồ
Mạnh Tường cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ ADN ứng
dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo các nhà khoa học đã trực

tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu.
Cảm ơn các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện
tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp
đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo
thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn

Mai Hoàng Oanh


v

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. Tổng quan về cây sói rừng .......................................................................3
1.1.1. Phân loại học ......................................................................................... 3
1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng ................................................. 4
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng .................................................... 4
1.2. Tổng quan về mã vạch DNA....................................................................7
1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode ................................................................ 7
1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode .......................................... 8
1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode
ở thực vật .......................................................................................................... 9
1.2.3.1. Trình tự gen nhân.................................................................................. 9

1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome ............................................................... 10
1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp............................................................................. 10
1.3. Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu ..................14
Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18
2.1. Vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ...............................................18
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................. 18
2.1.2. Chủng vi khuẩn ................................................................................... 18
2.1.3. Hóa chất............................................................................................... 18
2.1.4. Thiết bị sử dụng .................................................................................. 19
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................19
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái.................................... 19
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................... 20
2.2.2.2. Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết...................................... 21
2.2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR ....................... 22
2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................... 24


vi
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector ..................................... 25
2.2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc
nhiệt....... ............................................................................................................ 26
2.2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) ............... 26
2.2.2.8. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli .................................................. 28
2.2.2.9. Phương pháp xác định trình tự của gen ............................................. 29
2.2.2.10.

Phương pháp phân tích số liệu .................................................... 29

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 30

3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn ...................30
3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng ..........................................................32
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số..................................................................... 32
3.2.2. Khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phản ứng PCR ................... 33
3.2.3. Kết quả ghép nối gen vào vector tách dòng ...................................... 35
3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp ................................ 36
3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ................................................ 37
3.3. Kết quả xác định trình tự đoạn các đoạn gen nghiên cứu.....................38
3.3.1. Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1 ..................................................... 39
3.3.2. Phân tích vùng ITS ............................................................................. 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48


vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh

bp

Base pair

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleostide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

IPTG

Isopropylthio-beta-D-galactoside

UV

Ultraviolet

LB

Luria Bertani

ITS-rDNA

Internal Transcribed Spacer-rDNA

Kb

Kilobase

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rDNA

Ribosome deoxyribonucleic acid

Rnase

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sol

Solution

STS

Sequence-Tagged Site

TAE

Tris - Acetic acid - EDTA

Taq polymerase

Thermus aquaticus polymerase

TE

Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid

X-gal

X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase


viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục
lạp .................................................................................................................. 111
Bảng 2.1. Các máy móc và các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ..................... 19
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa ...................................................... 200
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách ................................................... 200
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 22
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen ITS.............................. 23
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ......................... 23
Bảng 2.7. Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR ........................................... 23
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng .... 25
Bảng 2.9.Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang ................. 26
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................ 27
Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR................................... 27
Bảng 2.12. Thành phần hóa chất tách plasmid ............................................... 28
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 ... 41
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen
rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ............................................ 41
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của gen ITS của mẫu sói rừng nghiên cứu với
một số trình tự trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ....................................... 44
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen ITS ........ 46
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen
ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ................................................ 46


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh cây sói rừng trong tự nhiên ............................................... 3
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT ............................................................................ 25

Hình 3.1. Mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng sơn ......................................... 30
Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng............................................................ 31
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số cây Sói rừng trên gel agarose 1% ....... 32
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 và sản phẩm nhân gen
ITS từ các cặp mồi đặc hiệu ........................................................................... 34
Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................. 35
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony các khuẩn lạc sử dụng mồi
rpoC1 và mồi ITS ........................................................................................... 37
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid.................................. 38
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng và
hai trình tự mang mã số EF380352 và KP256024 trên Genbank ................... 40
Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của
mẫu sói rừng với mẫu EF380352 và KP256024 trên Genbank. ..................... 42
Hình 3.10. Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR và
4 trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên ngân
hàng gen quốc tế............................................................................................... 45
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS của
mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601
trên ngân hàng gen quốc tế …………………………………………………..46


1
MỞ ĐẦU
Theo đánh giá của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh ung thư hiện nay luôn
là gánh nặng của nền kinh tế - xã hội đối với mọi quốc gia, trung bình mỗi
năm có thêm 10 - 16 triệu người mắc bệnh. Đây là một căn bệnh nguy hiểm,
có tỷ lệ tử vong cao. Mặc dù hiện nay đã có rất nhiều phương pháp điều trị
hiện đại nhằm loại bỏ khối u như phương pháp xạ trị, hóa trị, liệu pháp
hormon, liệu pháp sinh học, điều trị trúng đích và ghép tế bào gốc để ức chế
và tiêu diệt tế bào ung thư. Ngoài ra, người bệnh còn phải sử dụng các thuốc

nhằm nâng cao thể trạng, khắc phục hậu quả do khối u gây ra, kéo dài thời
gian sống cho người bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này rất tốn kém về mặt
kinh tế [3], [9].
Ngày nay việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền
hay các hợp chất được tổng hợp từ các chất có nguồn gốc thiên nhiên có xu
hướng ngày càng tăng và chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học, bởi
chúng có khả năng chữa trị bệnh cao, an toàn và ít tác dụng phụ. Ở Việt Nam
tính đến 2005 đã xác định được 3948 loài thực vật và nấm, 52 loài tảo biển,
408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Đa số các cây
thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10 %
trong số đó là cây thuốc trồng [1]. Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dược
liệu ở nước ta rất phong phú đa dạng về chủng loại.
Các nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy cây Sói rừng (Sarcandra
Glabra (Thunb.) Nakai) là dược liệu có khả năng chữa trị các bệnh cảm mạo,
viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lưng và một số bệnh ung thư như ung thư tụy,
ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư cuống họng… [2],
[12], [21]. Tuy nhiên việc nghiên cứu sử dụng cây thuốc còn chưa được quan
tâm đúng mức đã và đang làm cho khu vực phân bố của loài bị thu hẹp và trữ
lượng của loài suy giảm một cách nghiêm trọng.


2
Hiện nay thị trường về các nguồn nguyên liệu thảo dược dùng trong sản
xuất dược phẩm có tiềm năng lớn và đang tiếp tục phát triển. Tuy nhiên cùng
với sự phát triển đó, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở
thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược có thể được thay thế bằng
các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi.
DNA barcode là một trong những phương pháp phục vụ định danh loài
chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA
chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc

xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài
thực vật.
Xuất phát từ những nguyên nhân và lý do trên, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình
tự gen phân loại cây sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)”.
 Mục tiêu nghiên cứu
- Mô tả được một số đặc điểm hình thái của cây sói rừng (Sarcandra
Glabra (Thunb.) Nakai
- Xác định được một số trình tự gen phân loại cây sói rừng Sarcandra
Glabra (Thunb.) Nakai.
 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây sói rừng
- Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và ITS. Nhân bản và tách
dòng hai đoạn gen rpoC1 và ITS .
- Xác định, phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1
và ITS được phân lập từ mẫu sói rừng thu được từ Lạng Sơn.


3
Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây sói rừng
1.1.1. Phân loại học
Tên khoa học: Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai.
Phân loại:
Giới: Plantae
Bộ: Chloranthales
Họ: Chloranthaceae
Chi: Sarcandra

Loài: S. glabra.
Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum,
Chlorathus glaber (Thunb.) Makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc
họ Hoa sói Chloranthaceae.
Ở Việt Nam cây sói rừng còn
có một số tên gọi khác như sói lãng,
sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu
tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà,
tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt
mộc [5].
Cây Sói rừng phân bố ở nhiều
nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật
Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia.
Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở vùng

Hình 1.1. Hình ảnh cấy Sói rừng

núi đất, ở bìa rừng và ven đồi ẩm

trong tự nhiên

nhiều nơi như: Cao Bằng, Lạng Sơn,
Hòa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng. Thu hái toàn cây vào mùa hạ, dùng tươi


4
hay phơi khô trong râm. Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch cắt đoạn, phơi khô
trong râm hoặc dùng tươi [5].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng
Trong thành phần cây Sói rừng có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh

học cao như: flavonoid, coumarin , sesquiterpen, saponin,… . Các este, phenol,
đường, flavon, cyanogens, axit fumaric, …[7].
Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật khi nghiên cứu về cây thuốc
cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là sesquiterpen lactose,
curmarin, flavonoid [17], [19], [46].
Những nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học đã xác định Sói rừng
có chứa một số các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như chloranoside A;
Tertorigenin 7-glucoside có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương
khớp và tiêu hóa, hợp chất isofraxidin, một vị thuốc trong bài thuốc trị bệnh
vảy nến tại Trung Quốc [4], [6]. Bên cạnh đó, bột cây Sói rừng còn có hoạt
tính kháng gốc tự do, có tác dụng ức chế sự phát triển của các khối u, hỗ trợ
trong điều trị bệnh ung thư. Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy dịch
chiết sói rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư
người Hep-A549, HCT-29, BGC-823 [2], [12].
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng
Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng cay, tính hơi ấm, có tác dụng
hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian,
rễ cây được ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống trị bệnh
lao, hoặc giã đắp chữa rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp chữa vết thương, mụn
nhọt, phong thấp, đau nhức xương khớp [4], [6].
Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư
tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo,
kinh nguyệt không đều, hoa được dùng để ướp trà [4], [7].


5
Ngoài ra dịch chiết từ cây sói rừng có tác dụng chống viêm đạt hiệu quả
97,6% mà không gây tác dụng phụ, đặc biệt phần lá cây có tác dụng kháng
khuẩn mạnh nhất. Các nhà y học cổ truyền Trung Quốc đã bào chế Sói rừng
thành dạng thuốc tiêm bắp để trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp một cách hiệu

quả [6], [12].
Theo các tài liệu thu thập được, các nhà khoa học còn tìm hiểu tác dụng
lên hệ miễn dịch của cây sói rừng.
Nghiên cứu về tác dụng kháng u, Zhong L. và cộng sự nghiên cứu ảnh
hưởng của Sói rừng trên phòng và chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu. Kết
quả thí nghiệm đã chứng minh S.glabra có tác dụng rõ rệt trong điều trị giảm
tiểu cầu và có thể ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây ra bởi 5-FU.
Wen J. và cộng sự (2003) đã sử dụng dịch chiết Sarcandra glabra
(Thunb.) Nakai tiêm cho chuột được cấy ghép tế bào ung thư gan Hep-A22
đồng thời cũng quan sát tác dụng của dịch chiết trên sự phát triển in vitro của
dòng tế bào này. Kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm sự phát triển của tế
bào ung thư Hep-A22 cả trên in vitro và in vivo [47].
Trong một nghiên cứu khác của Zhenzhen Z., chất SGP-2, một
polysaccharide chiết xuất từ Sacandra glabra đã ức chế sự tăng sinh và di căn
của tế bào ung thư MG-63 in vitro [55]. Các kết quả nghiên cứu trên đã tạo tiền
đề xây dựng cơ sở khoa học cho những nghiên cứu chống ung thư tiếp theo của
các thành phần có hoạt tính sinh học trong cây sói rừng [29].
Kang và cộng sự [28] nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S.
glabra và gây chết tế bào theo chương trình của dòng tế bào gây ung thư biểu
mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát
triển khối u invivo.
Yuan K., Zhu J.X. và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch
chiết n - butanol của Sói rừng. Kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn theo


6
mm của các hợp chất kaempferol-3-O-beta-D-glucoronid, isofraxidin-7-O-betaD-glucopyranosid, kaempferol được ghi lại có thứ tự là 14,67±0,08; 11,14±1,06;
8,26 ±1,26 [52].
Xu X.D., Hu X.R. và cộng sự [49] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của
Sói rừng. Kết quả thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform và EtOAc của

dịch chiết EtOH toàn cây Sói rừng, có tác dụng kháng khuẩn mạnh.
Đồng thời với nghiên cứu ức chế sự phát triển các tế bào u, các nhà khoa
học còn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch của cây sói rừng. Theo các tác giả
He R. (2009) và Sun W. (2015) về tác dụng của dịch chiết Sarcandra Glabra
(Thunb.) Nakai lên hệ miễn dịch của chuột thì dịch chiết có liên quan tới sự cân
bằng của tế bào T, làm tăng phần trăm diệt tự nhiên và hiệu quả bảo vệ theo kiểu
miễn dịch ở chuột bị ung thư thông qua sự cải thiện tỉ lệ và số lượng tế bào miễn
dịch, tăng trọng lượng lách, tuyến ức và tăng số lượng bạch cầu [23], [38].
Trong một thí nghiệm của tác giả Từ Quốc Lượng và cộng sự (2005), dịch
chiết phân đoạn cây sói rừng làm tăng trọng lượng lách, tuyến ức và số lượng
tiểu cầu trên chuột xuất huyết giảm tiểu cầu. Nghiên cứu ảnh hưởng của cây sói
rừng trên điều trị giảm tiểu cầu do hóa trị liệu [39].
Trên các bệnh nhân ung thư biểu mô mũi họng, điều trị tia xạ kết hợp
uống cao Sói rừng đã làm giảm được một số tác dụng phụ do tia xạ so với chỉ
tia xạ đơn thuần [20].
Có rất nhiều bài thuốc dân gian sử dụng cây Sói rừng làm thuốc trong
điều trị viêm khớp, phong thấp. Ngoài ra Sói rừng còn có mặt trong thành phần
của một số thực phẩm chức năng như Flamasol, Hoàng Thấp Linh,viên Gout
Tâm Bình, Tiêu Khiết Thanh, hỗ trợ điều trị cho người bị viêm đau khớp, thấp
khớp, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, giúp phòng ngừa và giảm các triệu
cứng viêm đường hô hấp.


7

1.2. Tổng quan về mã vạch DNA
1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode
Để phân loại và xác định loài ở động, thực vật hiện nay có rất nhiều
phương pháp nghiên cứu khác nhau, hầu hết các phương pháp đều dựa trên
các nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống

nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Trong đó phương
pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một
hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ
và toàn diện. Tuy nhiên phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác
biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan
sinh sản (hoa) nên cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu
vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu thực vật có đặc
điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường hoặc khó nhận
biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài
[24], các mẫu thực vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái
bên ngoài. Ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện
được bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại tốn nhiều thời gian và
công sức [22]. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh
nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử hiện đại.
Năm 2003, khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu
tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên, nhằm giúp nhận diện các mẫu
thực vật [31]. Mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng
một đoạn DNA chuẩn ngắn (400 - 800 bp) nằm trong bộ genome của sinh vật
đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào.
Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân
loại và xác định loài. Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự
đa dạng sinh học. Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng
dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y
dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm. Phương pháp này vô cùng


8
có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã
được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua

chế biến…
Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn
sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được
thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với
mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất
cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ
mẫu DNA nào. Với sự hỗ trợ của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển
và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới [33].
Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động
đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng
phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực
này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lưu ý
rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích
để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ
thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà
khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến
thực phẩm…
1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode
Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc
hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen
được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có
sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc
biến đổi không đáng kể. Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có
trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để
dễ dàng khuếch đại bằng PCR.
Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc
độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều


9

khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu
tìm ra nguồn gốc các loài.
Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp
nhiều khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối
với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi
ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị
trong một số nghiên cứu [15], [35], [41]. Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng
gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [16], [27],
[41]. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học
thực vật hoàn toàn chấp nhận [16], [30], [34]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên
cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà
nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [16], [27], [39].
Theo Taberlet P. và cộng sự (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng
phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:
- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa
các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong
cùng loài.
- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với
cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.
- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có
thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…).
- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi
nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc
trình tự DNA [39].
1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở
thực vật
1.2.3.1. Trình tự gen nhân
Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến
sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định. Tuy nhiên khó khăn
trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc

10
có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và
khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do
tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài
bằng phương pháp DNA barcode [43], [50].
1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen DNA ribosome (rDNA) là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của
ribosome. Các gen rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa
dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp
xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome
18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba
gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA
được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm
sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị
trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị
tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong
loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những
công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó
phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức
năng [13]. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản
vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và
ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao
và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên
cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực
vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu
năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [43], [50], [51].

1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích
thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large singlecopy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao được


11
phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20
- 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao),
các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp
trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng [8].
Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho
hệ gen lục lạp [14], [26], [ 44]
Trình tự 5’→3’

Mồi
a-f
a-r
matK 1F
matK 1R
matK
matK 2F
matK 2R
rpoB 1
rpoB 2
rpoB
rpoB 3
rpoB 4
rpoC1 1
rpoC1 2
rpoC1

rpoC1 3
rpoC1 4
ycf5 1
ycf5
ycf5 2
(ccsA)
ycf5 3
ycf5 4
trnH2
trnH psbAF
psbA trnH(GUG)
psb A
trnL-c
trnL-d
trnL-e
trnL-F
trnL-f
trnL-g
trnL-h
Kí hiệu: → mồi xuôi; ←
rbcL

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC
GAACTCGTCGGATGGAGTG
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
TAAACGATCCTCTCATTCACGA
AAGTGCATTGTTGGAACTGG
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC

CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
GATCCCAGCATCACAATTCC
GTGGATACACTTCTTGATAATGG
GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

→
←
→
←
→
←
→
→
←
←
→
→
←
←

GGATTATTAGTCACTCGTTGG
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ACTTACGTGCATCATTAACCA
CCCAATACCATCATACTTAC

→
→
←

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
CGAAGCTCCATCTACAAATGG

→
←
→
←
→
←
→
←
→
←

CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC
ATTTGAACTGGTGACACGAG3’
GGGCAATCCTGAGCCAA
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

mồi ngược


12

a. Trình tự gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các
tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase
(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật. rbcL đã được sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn
10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại
PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong
những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực
vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều
cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ
như matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [43], [45], [50].
b. Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh
nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan
đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK
tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ
thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL
đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt
kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử
dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [42], [50].
c. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và cộng sự
(1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện
nay, rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác
định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần
gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để


13
xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị

barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác.
rpoC1 có cấu trúc vòng kép, bền vững. Chiều dài trung bình khoảng
520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – Tiểu đơn vị.
Trong nghiên cứu Liu và cộng sự (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị
rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes. Do vậy cần có
các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và
rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định loài [41], [45].
d. Trình tự gen ycf5
Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino axit. Gen này
được bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù
hợp với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chưa được công
nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [42], [43].
e. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay
đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định
loài cao. Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật
hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có
kích thước rất ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có
mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và
psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA
như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy
rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7
locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung.
trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống
barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [37], [43].


14

f. Trình tự hai gen trnL (UAA)-trnF (GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và
vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet và đtg là nhóm
nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật.
Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự
biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với
vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các
nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và
sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong
nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng
DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng
trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một
barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [39], [43], [51].
1.3. Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu
Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và
phong phú với nhiều loài động vật, thực vật, nấm có giá trị kinh tế cao. Trong
đó, thực vật là giới sinh vật có tính đa dạng rất cao về loài. Đến nay, có
khoảng 350.000 loài thực vật đã được nhận dạng. Vậy bằng cách nào để phân
biệt được sự khác nhau hay giống nhau và mối quan hệ giữa các loài, các cá
thể sinh vật. Từ thời thượng cổ, các Nhà khoa học đã biết cách sắp xếp cây cỏ
theo những trật tự nhất định để có thể nhận biết chúng một cách dễ dàng. Con
người đã cố gắng tìm những đặc điểm giống nhau để sắp xếp cây cỏ vào từng
nhóm, nhưng lại dựa vào những đặc điểm sai khác để phân biệt nhóm này với
nhóm kia. Như vậy, theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám
định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý
sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp
phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và
hạn chế, như: nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất


15

khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau), ngược lại nhiều
sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân
loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống
dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các
biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị
biến đổi về hình thái, như những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở
các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không thể xác định được bằng
chỉ thị hình thái. Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói
chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh
chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật,
thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có thể định danh
được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần
thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử
DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh
vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem
là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật.
Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật
và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài.
Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là hướng nghiên cứu mới. Nhận
thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch
DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý cũng đã bắt đầu
tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một
ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (Động vật, thực
vật, vi sinh vật, virut,...) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn
và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.
Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ
loài, vì vậy xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về
chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính

16
của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như
bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trường
thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề
toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại
thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả
mạo. Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do:
- Vật liệu không phân biệt được bằng các đặc điểm hình thái
- Những vật liệu có tên tương tự nhau
- Việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng các nguyên
liệu khác rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm
thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương
pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có
nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,
phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến
hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch
DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc
giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Dưới đây trình bày một số mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng
trong các cây dược liệu.
Vùng ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng
xử lý tốt nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã được sử
dụng thành công để phân biệt 14 loài Hedyotis L, bao gồm cả loài chính
thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ
H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H. corymbosa (L.) Lam.
Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại
thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc

từ Rheum palmatum L