XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGŨ cốc BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký

xin chào cô và các bạn


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO

PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG VÀ ĐỘC TỐ TRONG SẢN PHẨM
NÔNG NGHIỆP
XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ


Tình hình chung
• Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo,
ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống
loài người.
• Độc tố aflatoxin là độc tố nguy hiểm và thường nhiễm trên nông sản,
gây độc cho người và gia súc.
• Việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương
thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con
người và các động vật kinh tế


ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus, là một
loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillu flavus vàAspergillus parasiticus.
Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư.
Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến,

gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (
ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,
dừa…
Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn
nhiễm aflatoxin.


Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus


PHÂN LOẠI AFLATOXIN
• Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên.
• Aflatoxin B1 là dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus.
• Aflatoxin B1 & B2 : được sinh ra bởi Aspergillus flavus và A.
parasiticus.
• Aflatoxin G1 & G2 : được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus.
• Aflatoxin M1 : chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động
vật.
• Aflatoxin M2 : chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò
được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin.


Giới hạn tối đa (ML) Aflatoxin theo quy định
của Bộ Y tế Việt Nam
 
 

ML (microgam/kg)

5

 
 

 
 

Tiêu chí
Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung

 
0,5

Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa

15

 
Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung

Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người
lượng Aflatoxin không vượt quá 10ppb.


Phương pháp xác định aflatoxin
Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng,
sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
2 nhóm chính

 
Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn
dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA)
và cột sắc kí ái lực miễn dịch.


Sắc ký bản mỏng
Khái niệm

Cấu tạo

Ứng dụng

là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các
chất trong hỗn hợp
 Pha tĩnh:một lớp mỏng các chất hấp phụ: silica gel, aluminium oxide, hoặc
cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ.
 Pha động: dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi
thích hợp
•
•
•
•
•

Định độ tinh khiết của chất phóng xạ trong dược khoa
Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng.
Nhận biết những hóa chất trong một hỗn hợp
Giám sát các phản ứng hữu cơ

Xác định Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng
Nguyên tắc
 Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách
bền vững nhưng không mất hoạt tính.
 Các gel này được gắn vào những cột nhỏ.
 Khi cho dịch chiết dẫn mẩu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại.
 Sau khi toàn bộ mẫu đã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để
loại bỏ tất cả những thành phần không đặc hiệu bám lại.
 Aflatoxinsex được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol.


ĐỊNH TÍNH
Chuẩn bị mẫu
 Xay 1kg mẫu đủ lọc sàng 1mm. Trộn đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl
và 125ml dung dịch chiết mẫu Methanol 75% cho vào bình định
mức. Lắc đều trong 30 phút.
 Để lắng trong vòng 10- 15 phút .
 Lọc dịch chiết qua giấy lọc .
 Lấy 15 ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15
ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu).


Phân tích mẫu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch

• Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực
miễn dịch cho đầy nước vào trong ống.
• Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột .
• Cho 15 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh.

• Dịch lỏng chảy qua cột với tốt độ khoảng 1 giọt/giây.
• Khi dịch mẫu tới đầu cột ,cho 10ml nước cất vào xiranh
để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất.
• Để cột ráo nước.
• Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, để
methanol chảy từ từ qua cột.


ĐỊNH LƯỢNG
• Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-45 độ C. Hoà tan cặn lại trong 200l Benzen-Acetonitrit
(98:2).
• Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ cách nhau 1cm trở lên.
• Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen –Acetonitril(98:2)
• Dùng Microsyringe chấm lên bản silicagel từ trái sang phải theo thứ tự :3 chấm mẫu: 2, 5, 10l, 1 nội
chuẩn: 10l mẫu và 10l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1), 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2l chuẩn (0,5ppm
Aflatoxin B1)
• Dung dịch triển khai: Chloroform- Aceton (9:10). Cho khoảng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai.
Cho bản silicagel vào bình, đậy kín .Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản
khoảng 0,5cm .
• Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng .
• So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Alatoxin B1 thì Rf của các
chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu.
• Tính toán nồng độ Alatoxin B1 có trong mẫu .


TÍNH TOÁN
Nồng độ Afatoxin B1 có trong mẫu :

S.Y.V
Trong đó

X.W
S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu ()
Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5g/ml hoặc 0,5ppm)
V : thể tích hoà cặn (200 l)
X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn
W : số gam mẫu đi qua cột (1g)


KHUYẾN CÁO
• Đeo găng tay khi làm thí nghiệm .
• Các vết Aflatoxin phải dược lau sạch bằng nước javen 10%
• Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải dược
ngâm trong nước javen 10% tói thiểu là 30 phút trước khi rửa.


KẾT LUẬN
• Aspergillus là một loại nấm gây bệnh cơ hội, có thể tồn tại khắp nơi trong mọi điều
kiện.
• Aflatoxin là một sản phẩm thứ cấp được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát
tiển của một số loài nấm Aspergillus, thường thấy nhất là Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus và Aspergillus fumigatus.
• Cách dự phòng có thể thực hiện là giữ cho cơ thể không bị suy giảm sức đề kháng,
nâng cao thể trạng, tập luyện thể dục thể thao, có chế độ ăn uống nghỉ ngơi phù
hợp...
• Đối với người có cơ địa thuận lợi cho sự nhiễm nấm, nên đi khám định kỳ và chụp
phim X-quang sớm khi thấy có triệu chứng bất thường để có thể phát hiện và điều trị
kịp thời.


xin cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe