KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
******************

PHẠM CÔNG THÀNH

KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
( Ngành nuôi trồng thủy Sản )

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05 /2010

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
******************

PHẠM CÔNG THÀNH

KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy Sản
Mã số: 60.62.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05 /2010

2


KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri

PHẠM CÔNG THÀNH

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS. TS. LÊ THANH HÙNG
Trường đại học Nông Lâm Tp. HCM

2. Thư ký:

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
Trường đại học Nông Lâm Tp. HCM

3. Phản biện 1:

TS. LÊ HỒNG PHƯỚC
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

4. Phản biện 2:

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN
Trường đại học Nông Lâm Tp. HCM

5. Ủy viên:

TS. NGUYỄN HỮU THỊNH
Trường đại học Nông Lâm Tp. HCM
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

3


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên: Phạm Công Thành, sinh ngày 24 tháng 11 năm 1969 tại Đà Nẵng
Tên cha: Phạm Văn Toàn và mẹ Nguyễn Thị Tý
Tốt nghiệp tú tài: Tại trường phổ thông trung học Hàm Tân, tỉnh Bình Thuận.
Tốt nghiệp Đại học: Ngành Sinh Học, hệ tập trung tại trường Đại học Khoa học Tự
Nhiên, Tp. Hồ Chí Minh, năm 1994.
Quá trình công tác:
+ Từ 1994 – 2001: Làm việc tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (tại Tp.
HCM) – Bộ Thủy Sản. Chức vụ: nghiên cứu viên.
+ Từ 2001 – 2008: Làm việc tại công ty Bayer Việt Nam (CHLB Đức). Chức vụ:
Giám đốc sản phẩm thủy sản và bộ phận R & D.
+ Từ 2008 - đến nay: Làm việc tại công ty PHARMAQ AS (Nauy). Chức vụ: Giám

đốc kỹ thuật và marketing.
Tháng 09 năm 2006 theo học lớp cao học chuyên ngành nuôi trồng thủy sản tại
trường đại học Nông Lâm, Tp. HCM.
Tình trạng gia đình:
+Vợ : Phạm Thị Hồng Ngọc, kết hôn năm 1996
+Con trai Phạm Công Danh, sinh năm 1998
+Con gái Phạm Thị Xuân Thanh, sinh năm 2000
Địa chỉ liên lạc: 101- đường số 8, khu phố 7, phường Bình Hưng Hòa, quận Bình
Tân, Tp. Hồ Chí Minh. Điện thọai: 0913808030
Email: ;

4


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Phạm Công Thành

5


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
và động viên tôi trong suốt thời gian học tập ở trường và thực hiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến quí thầy cô trong khoa Thủy sản, đại học

Nông Lâm và quí thầy cô từ các viện nghiên cứu, trường đại học khác đã dày công
chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian qua.
Tôi chân thành cám ơn TS. Jan Koesling; TS. Gravningen Kjersti đã động viên và
tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình này. Cám ơn các đồng nghiệp, bạn
bè và lớp cao học thủy sản 2006 đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học này.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, vợ và 2 con cùng anh chị em trong gia
đình đã dành rất nhiều thời gian giúp đỡ, động viên, khuyến khích và chia sẻ với tôi
trong những năm tháng qua, giúp tôi có thêm nghị lực trong suốt khóa học này.
Chân thành cám ơn
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20/05/2010

Phạm Công Thành

6


TÓM TẮT
Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon. hypophthalmus)
nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được tiến hành nghiên cứu trong phòng thí
nghiệm và tại ao. Cá thí nghiệm có trọng lượng 10 - 17g/con và hoàn toàn không bị
nhiễm E. ictaluri trước khi gây nhiễm.
Có tổng cộng 5 đợt gây nhiễm được thực hiện trong phòng thí nghiệm để
đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá. Liều gây nhiễm dao động từ 0,5–1x 106CFU/ml.
Trong đợt gây nhiễm đầu tiên, cá thí nghiệm được ngâm 60 phút với mật độ vi
khuẩn E. ictaluri là 0,58 x 106CFU/ml. Tất cả cá còn sống sót được giữ trong một
bể cho thí nghiệm gây nhiễm lần 2. Trong thí nghiệm đợt 2, 3, 4 và 5, cá lần lượt
được gây nhiễm lần 2 tại các thời điểm 14, 35, 50 và 70 ngày sau đợt gây nhiễm
đầu. Cá gây nhiễm một lần được dùng làm nhóm đối chứng trong 4 đợt gây nhiễm
sau. Qua các đợt thí nghiệm ghi nhận cá bắt đầu chết sau 2 ngày gây nhiễm và thời
gian chết kéo dài đến ngày thứ 10 sau gây nhiễm. Tỉ lệ chết tỉ lệ chết trung bình của

nhóm đối chứng (gây nhiễm 1 lần) là 30,75% và nhóm thí nghiệm (gây nhiễm 2 lần)
là 14,25%. Tỉ lệ chết giữa hai nhóm có sự khác biệt thống kê (P < 0,05).
Mẫu máu được thu để đo hiệu giá kháng thể trước và sau mỗi đợt gây nhiễm.
Cá hình thành đáp ứng miễn dịch đặc hiệu nguyên phát sau 7 ngày gây nhiễm,
kháng thể đạt đỉnh 5,1 sau 35 ngày, duy trì ở mức > 4 (log24 =16) trong 30 ngày,
sau đó giảm bằng 0 sau 90 ngày gây nhiễm. Kết quả phòng thí nghiệm chứng tỏ đáp
ứng miễn dịch thứ phát luôn cao hơn miễn dịch nguyên phát, tỉ lệ kháng thể của đáp
ứng miễn dịch thứ phát/nguyên phát qua các đợt gây nhiễm là 1,25 – 4 lần.
Trong ao nuôi, theo dõi kháng thể đặc hiệu của cá dựa vào những đợt cá bị
nhiễm bệnh tự nhiên và kết quả thu mẫu định kỳ mỗi tháng. Kết quả ghi nhận cá bị
nhiễm E. ictaluri liên tục 3 lần trong vòng 50 ngày. Hiệu giá kháng thể đo được
trong lần đầu là 3,4 tăng lên 4,5 trong lần nhiễm thứ hai và đạt đỉnh điểm 4,8 tại lần
nhiễm thứ 3, cuối cùng suy tàn sau 110 ngày kể từ lần nhiễm E. ictaluri đầu tiên.

7


Kết quả phòng thí nghiệm và trong ao cùng cho thấy tỉ lệ chết có mối tương
quan chặt chẽ theo chiều nghịch với kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cá, với r
tương ứng là - 0,93 và - 0,98.

ABSTRACT
The specific immune response of Pangasianodon hypophthalmus to Edwardsiella
ictaluri was studied both in the laboratory and on farm trials. The experimental fish,
body weight from 10-17g/fish, were tested for free of above pathogenic bacteria
prior to challenge.
Five challenged experiments were conducted in the laboratory to evaluate the
immune response of fish. The challenged dose ranged from 0.5 x 10 6 to 1.0 x 106
CFUml-1. In the first experiment, fish were first immersion-challenged with 0.58 x
105CFUml-1 of E. ictaluri for 60 minutes. All survivors were kept together in the

tank for the second immersion challenged. In the experiment 2,3,4, and 5, fish were
second immersion-challenged at day 14, 35, 50, and 70 after the first challenge
respectively. One time challenged fish were used as the control in the last four
experiments. It was found in all experiments that the mortality started at the second
day after exposure to the phathogen and the last mortality was recored at day 10
after the challenge. In the control group, one time challenged, the average mortality
was 30.75% while 14.25% mortality was recored in the experimental group, two
times challenged. In each experiment, there was the significant difference in
cumulative mortalities between the control and treated groups (P < 0.05).
The blood samples were collected before and after each challenge for determining
of antibody titer,. The initial specific immune response was observed at day 7 after
exposure to E. ictaluri. The antibody titer reached the peak of 5.1 after 35 days
challenged and maintained at > 4 (log24 = 16) within 30 days, and then decline to
zero at day 90. It was demonstrated that the secondary respond is always higher
than the initial one. The ratio of antibody in the second response to the initial
antibody ranging from 1.25 to 4 in all challenged experiments.
In the earthen pond, specific antibody titer of fish was observed base on the natural
infection and the results of monthly sampling of the blood. There were three
infection stages caused by E. ictaluri within 50 days. The antibody of the first
infection is 3.4, increased at the second infection (4.5) and reached the peak of 4.8
at the third infection then declined to zero after 110 days infected with E. ictaluri.
The results in laboratory and on the field demonstrated a strong correlation between
mortality and specific antibody titer with r = - 0.93 and - 0.98 respectively.

8


MỤC LỤC
Trang

Trang chuẩn y.............................................................................................................. i
Lý lịch cá nhân ........................................................................................................... ii
Lời cam đoan............................................................................................................. iii
Lời cám ơn ................................................................................................................ iv
Tóm tắt....................................................................................................................... v
Mục lục .................................................................................................................... vii
Danh sách các bảng, hình, đồ thị, sơ đồ ...................................................................... x
Chương 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
Chương 2. TỔNG QUAN........................................................................................... 3
2.1. Đáp ứng miễn dịch của cá.................................................................................... 3
2.1.1. Các cơ chế bảo vệ không đặc hiệu .................................................................... 3
2.1.1.1. Miễn dịch thể dịch không đặc hiệu................................................................. 3
2.1.1.2. Các yếu tố miễn dịch tế bào không đặc hiệu................................................... 4
2.1.1.3. Viêm.............................................................................................................. 5
2.1.2. Các cơ chế miễn dịch đặc hiệu .......................................................................... 5
2.1.2.1. Các tế bào lympho ......................................................................................... 6
2.1.2.2. Các cơ quan lympho ...................................................................................... 7
2.1.2.3. Globulin miễn dịch (Ig).................................................................................. 7
2.1.3. Đáp ứng miễn dịch dịch nhầy ........................................................................... 9
2.1.4. Ký ức miễn dịch ............................................................................................... 9
2.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch.......................................................10
2.2. Tổng quan về tác nhân gây bệnh – vi khuẩn Edwardsiella ictaluri......................11

9


2.2.1. Đặc tính của vi khuẩn E. ictaluri......................................................................11
2..2.2. Những nghiên cứu về E. ictaluri ở nước ngoài................................................13
2.2.3. Những nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch và độ dài bảo hộ ..............................14
2.2.4. Những điều tra, nghiên cứu bệnh cá tra ở Việt Nam.........................................16

2.2.5. Độc lực của vi khuẩn E. ictaluri.......................................................................17
2.3. Tình hình nghiêu cứu và ứng dụng vaccine trong nuôi thủy sản..........................19
2.3.1. Trong nước ......................................................................................................19
2.3.2. Nước ngoài ......................................................................................................20
2.4.3. Các loại vaccine...............................................................................................20
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................22
3.1. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................22
3.2. Thời gian và địa điểm thí nghiệm........................................................................22
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...................................................................23
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................23
3.3.1.1. Nguồn cá giống cho thí nghiệm 1(trong phòng) ............................................23
3.3.1.2. Nguồn cá cho thí nghiệm 2(tại ao) ...............................................................24
3.3.2. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................25
3.3.2.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................................25
3.3.2.2. Bố trí thí nghiệm 2 ........................................................................................28
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................29
3.3.3.1. Chủng vi khuẩn E. ictaluri ............................................................................29
3.3.3.2. Bất hoạt vi khuẩn bằng formaline (FKC) ......................................................29
3.3.3.3. Phản ứng vi ngưng kết và xác định hiệu giá kháng thể ..................................29
3.3.3.4. Phương pháp gây nhiễm................................................................................32

10


3.3.3.5. Phương pháp tính mật độ vi khuẩn................................................................32
3.3.3.6. Phương pháp lấy máu cá ...............................................................................33
3.3.3.7. Phương pháp định danh vi khuẩn ..................................................................33
3.3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................35
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................36
4.1. Các chỉ tiêu môi trường nước..............................................................................36

4.2. Kết quả gây bệnh thực nghiệm............................................................................37
4.2.1. Tỉ lệ cá chết .....................................................................................................37
4.2.1.1. Tỉ lệ cá chết trong đợt gây nhiễm lần 1 của nhóm TN ...................................37
4.2.1.2. Tỉ lệ chết của nhóm TN qua 5 đợt gây nhiễm ................................................38
4.2.1.3. Tỉ lệ chết của nhóm đối chứng qua 4 đợt gây nhiễm .....................................40
4.3. Kháng thể trong máu cá ......................................................................................45
4.3.1. Hàm lượng KT của nhóm cá TN sau khi GN lần 1 theo thời gian ....................45
4.3.2. Hiệu giá KT đặc hiệu nguyên phát của nhóm ĐC sau mỗi đợt GN ...................47
4.3.3. Hiệu giá KT đặc hiệu nguyên phát, thứ phát của nhóm TN sau mỗi đợt GN ....48
4.3.4. Tổng hợp hiệu giá KT của 2 nhóm cá TN và ĐC .............................................50
4.4. Tương quan giữa tỉ lệ chết và hàm lượng kháng thể của cá ở thí nghiệm 1..........52
4.5. Kết quả khảo sát KT trong máu cá tại ao giống và ao nuôi thương phẩm ............53
4.6. Tương quan giữa tỉ lệ chết và hàm lượng kháng thể của cá ở thí nghiệm 2..........55
4.7. So sánh diễn biến hàm lượng KT của cá trong thí nghiệm 1 và 2 ........................57
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................59
5.1. Kết luận ..............................................................................................................59
5.2. Kiến nghị............................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61

11


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 3.1(a) Sản xuất cá bột......................................................................................24
Hình 3.1(b) Ương cá bột trong ao đất tại Hồng Ngự ...............................................24
Hình 3.1(c) Ương cá hương trong bể bạt...................................................................24
Hình 3.1(d) Thuần cá trong bể xi măng trước gây nhiễm .........................................24
Hình 3.2(a) Ao cá tra giống thực nghiệm ..................................................................24

Hình 3.2(b) ao nuôi thương phẩm thực nghiệm ........................................................24
Hình 3.3(a) Khuẩn lạc E. ictaluri . ............................................................................29
Hình 3.3(b) Vi khuẩn đã bất hoạt bằng formalin ......................................................29
Hình 3.4 Phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên – kháng thể trên đĩa 96 giếng...........31
Hình 3.5(a) Lấy máu cá ...........................................................................................31
Hình 3.5(b) Ống huyết thanh ly tâm từ máu cá ........................................................31
Hình 3.5(c) Trộn kháng nguyên và huyết thanh trong đĩa 96 giếng ..........................31
Hình 3.5(d) kết quả ngưng kết kháng nguyên – kháng thể ........................................31
Hình 3.6(a) Chuẩn bị vi khuẩn GN; (b) Cá sau khi được GN ..................................32
Hình 3.7(a) Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh thỏ ....................................34
Hình 3.7(b) Test sinh hóa của công ty Nam Khoa.....................................................34
Hình 4.1 Cá thí nghiệm bị đốm trắng trên gan, thận do nhiễm E. ictaluri .................42

12


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thị 4.1 Tỉ lệ chết tích lũy của nhóm TN sau GN đợt 1 .........................................37
Đồ thị 4.2 Tỉ lệ chết tích lũy của nhóm đối chứng và thí nghiệm qua 4 đợt GN ......38
Đồ thị 4.3 Tỉ lệ chết của nhóm thí nghiệm qua 5 đợt gây nhiễm khác nhau ............40
Đồ thị 4.4 Tỉ lệ chết tích lũy qua 4 đợt gây nhiễm khác nhau của nhóm ĐC ............40
Đồ thị 4.5 Tỉ lệ chết của nhóm ĐC qua 4 đợt gây nhiễm khác nhau ........................41
Đồ thị 4.6 Tỉ lệ chết tích lũy của cá bị nhiễm E. ictaluri lần thứ nhất (GN1) và bị
nhiễm lần thứ hai (GN 2) ..........................................................................................43
Đồ thị 4.7 So sánh tỉ lệ chết giữa nhóm ĐC và nhóm TN qua mỗi lần GN ..............44
Đồ thị 4.8 Kháng thể cá nhóm TN sau khi được gây nhiễm lần 1 theo thời gian .......45
Đồ thị 4.9 Kháng thể cá ở thời điểm trước và sau mỗi đợt GN của nhóm ĐC ...........47
Đồ thị 4.10 So sánh nồng độ KT trước và sau khi GN lần 2 trong nhóm TN ............48
Đồ thị 4.11 Kháng thể của nhóm TN và nhóm ĐC theo thời gian .............................50

Đồ thị 4.12 Kháng thể của cá trước và sau gây nhiễm của nhóm TN và ĐC ............51
Đồ thị 4.13 Tương quan giữa tỉ lệ chết và KT cá trước các đợt GN 2 của nhóm
TN..52
Đồ thị 4.14 Nồng độ KT của cá trong ao nuôi thương phẩm theo thời gian nuôi .....53
Đồ thị 4.15 Mối tương quan giữa tỉ lệ chết và kháng thể của cá nuôi ao ...................55
Đồ thị 4.16 So sánh kháng thể cá trong bể thí nghiệm và tại ao ................................57

13


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Đặc tính của vi khuẩn E. ictaluri ...............................................................11
Bảng 3.1 Các đợt gây nhiễm trên 2 nhóm cá thí nghiệm và đối chứng ......................27
Bảng 3.2 Lịch thu mẫu máu định kỳ và lúc cá bệnh trong ao thí nghiệm .................28
Bảng 3.3 Sơ đồ các bước tiến hành đo hàm lượng kháng thể trong huyết thanh ........30
Bảng 3.4 Kết quả của các phản ứng sinh hóa ............................................................34
Bảng 4.1 Chỉ tiêu môi trường nước trong bể và ao nuôi trong thời gian thí nghiệm .37
Bảng 4.2 Số lượng cá chết sau mỗi lần bệnh trong ao giống và ao nuôi thịt .............56
Bảng 4.3 Tổng hợp các giá trị hiệu giá kháng thể ở các tháng nuôi thương phẩm......56

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1 Gây nhiễm và thu mẫu máu cá trước và sau mỗi lần gây nhiễm ................26

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
KT: Kháng thể

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

ĐC: Đối chứng

KTĐHNP: Kháng thể đặc hiệu nguyên phát

TN: Thí nghiệm

GN2: Gây nhiễm lần 2/ Gây nhiễm lần thứ hai

HT: Huyết thanh

CFU: Colony Forming Unit

HGKT: Hiệu giá kháng thể

TSA: Tryptic Soy Agar

KTNP: Kháng thể nguyên phát

E. ictaluri: Edwardsiella ictaluri

FKC: Formol Killed Cell

GN1: Gây nhiễm lần 1/ Gây nhiễm lần thứ nhất

14


Chương 1
MỞ ĐẦU
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) hiện nay được nuôi chủ yếu trong ao
đất ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), là loài cá nước ngọt có sản lượng nuôi

lớn nhất nước. Năm 2009, phi lê cá tra và nhiều sản phẩm chế biến khác từ cá tra đã
xuất khẩu đến 132 nước trên thế giới, với sản lượng 608.000 tấn đông lạnh và giá trị
xuất khẩu 1,342 tỉ đô la. Trong đó thị trường EU chiếm gần 40,1%, Mỹ 10%,
ASEAN 6,6%, Mexico 5,4%, Russia 4,8%, Ukraine 4,6% và các nước khác 28,5%
(VASEP, 2010). Nghề nuôi cá tra đã mang lại nhiều lợi nhuận cho người dân, các
nhà chế biến và các ngành nghề liên quan, giải quyết được hàng trăm ngàn lao động
ở ĐBSCL. Vì vậy, cá tra được xem là đối tượng nuôi chiến lược và có tầm quan
trọng đối với ngành thủy sản ở nước ta.
Trong quá trình ương nuôi cá tra, các trang trại gặp không ít những khó khăn
và dịch bệnh thường xuyên đã gây thiệt hại rất lớn. Đặc biệt bệnh do vi khuẩn gây
ra trên đối tượng này, đáng kể là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận
mủ.
Tìm hiểu nguyên nhân, tác nhân gây bệnh để có biện pháp phòng trị hiệu quả
là việc làm hết sức quan trọng và cần thiết nhằm giúp nghề nuôi cá tra nói riêng và
các đối tượng nuôi khác phát triển bền vững. Mặc dù có nhiều dự án nghiên cứu,
phát triển vaccine phòng bệnh cho cá tra đã và đang được tiến hành, tuy nhiên vẫn
còn rất ít những công trình nghiên cứu cơ bản về miễn dịch của đối tượng nuôi này
được công bố.
Thông thường người nuôi sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh gan thận mủ.
Ước tính hàng năm người nuôi cá tra sử dụng không dưới 500 tấn kháng sinh để trị
bệnh nhiễm khuẩn cho cá, trong đó chủ yếu là bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra.

15


Người nuôi thường gọi là bệnh gan thận mủ vì khi nhiễm khuẩn này gan, thận, lách
của cá sẽ bị hoại tử, tạo ra những đốm mủ trắng có đường kính 1 – 2mm. Trên thực
tế người nuôi sử dụng từ 500 – 1.000 đồng tiền kháng sinh để sản xuất 1 kg cá tra
thương phẩm, và có thể ước tính người nuôi cá tra sử dụng khoảng 1kg kháng sinh
để sản xuất 1 tấn cá tra thương phẩm hiện nay (theo kết quả điều tra từ một số hô

nuôi cá tra của tác giả).
Dựa trên hiện trạng, nhu cầu của nghề nuôi thủy sản ở ĐBSCL và định
hướng phát triển lâu dài, toàn diện, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu
và đánh giá “khả năng đáp ứng miễn dịch của cá tra đối với vi khuẩn E. ictaluri”.
Kết quả của nghiên cứu này hy vọng sẽ là một phần cơ sở khoa học phục vụ
cho nghiên cứu bệnh trên cá tra và sản xuất vaccine sau này.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá tra nhiễm vi khuẩn E.
ictaluri.

16


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Đáp ứng miễn dịch của cá (Trích lược và có bổ sung, từ Đỗ Thị Hòa và ctv,
2004. Chương 4 – Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 125 – 163)
2.1.1. Các cơ chế bảo vệ không đặc hiệu
2.1.1.1. Miễn dịch thể dịch không đặc hiệu
- Các nhân tố ức chế sinh trưởng
+ Transferrin
Transferrin có trong huyết thanh của mọi động vật có xương sống kể cả cá.
Đây là một protein có khả năng kết hợp rất chặt chẽ với ion sắt, là nhân tố sinh
trưởng thiết yếu đối với mọi sinh vật. Transferrin tạo nên hiệu quả ức chế vi khuẩn
và nấm. Transferrin rất đa dạng về mặt di truyền.
+ Interferon
Interferon xuất hiện trong cơ thể cá sau khi bị cảm nhiễm vi rút, mức độ sản
sinh interferon phụ thuộc vào nhiệt độ. Interferon có khối lượng phân tử khoảng
26.000 và điểm đẳng điện là 5,3 (Dorson và ctv, 1992). Renault và ctv (1991) đã
thiết lập phương pháp xác định interferon trong huyết thanh cá.

- Các nhân tố ức chế các enzyme
Huyết thanh và các dịch nội mô của động vật có xương sống chứa các chất
ức chế enzyme nhằm bảo vệ cơ thể kháng lại quá trình tự hủy của chính cơ thể
nhưng đồng thời cũng có thể có vai trò quan trọng trong việc trung hòa các enzyme
do tác nhân gây bệnh sản sinh ra.

17


- Các chất dung giải
+ Bổ thể là một hệ thống các enzyme hiệu ứng có trong huyết thanh và dịch
nội mô, bao gồm khoảng 12 protein thành phần.
Bổ thể có lẽ là nhân tố bảo vệ quan trọng nhất do vai trò đa năng của chúng
liên quan đến sự loại bỏ các yếu tố ngoại lai bằng việc xúc tác phản ứng viêm, tăng
tính thấm thành mạch, hóa ứng động bạch cầu và tăng cường hoạt động thực bào
của các tế bào thực bào. Bổ thể còn có vai trò trong cơ chế tiêu diệt vi khuẩn.
Ở cá, bổ thể tồn tại chủ yếu trong huyết thanh, tuy nhiên cũng có thể tìm thấy
bổ thể trong dịch nhày (Harrell và ctv, 1976).
- Các chất tủa và kết dính
+ Protein phản ứng C (CRP: C - reactive protein)
Các protein này kết hợp với phosphoryl cholin có trong vách tế bào của
nhiều loài vi sinh vật. CRP được phát hiện trong huyết thanh và trứng của nhiều loài
cá xương bằng phản ứng tạo kết tủa với chất chiết xuất từ vi khuẩn, nấm và giun
tròn. CRP có khả năng hoạt hóa hệ bổ thể (Nakanishi và ctv, 1991). Ở cá vai trò
miễn dịch của CRP vẫn chưa được làm sáng tỏ, mặc dù cho thấy chúng tham gia
xúc tác phản ứng viêm và đề kháng sự cảm nhiễm (Szalai và cvt, 1991).
+ Lectin
Là các protein, lectin có trong huyết thanh, dịch nhầy và trứng của nhiều loài
cá. Các protein này có chức năng gây kết tủa hoặc ngưng kết nhiều loài vi khuẩn,
hồng cầu và polysacchiride.

2.1.1.2. Các yếu tố miễn dịch tế bào không đặc hiệu
- Thực bào

18


Theo Secombe (1996), hai dạng thực bào chuyên hóa là bạch cầu đơn nhân
(monocyte), đại thực bào (macrophage) và bạch cầu hạt trung tính (neutrophil
granulocyte).
+ Đại thực bào (macrophage): Ở cá xương, đại thực bào phân bố rộng rãi ở
các mô, bao gồm cả mang (Lin và ctv, 1998) và xoang cơ thể (Afonso và ctv, 1998),
nhưng chủ yếu được tìm thấy dưới dạng các tế bào thuộc mạng lưới nội mô của
thận, lách.
+ Bạch cầu đơn nhân có mặt ở thận và phân bố với số lượng nhỏ trong máu,
chúng có thể di chuyển từ máu vào các ổ viêm. Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào
có thể bắt và tiêu hóa nhiều dạng mảnh nhỏ, kể cả các hạt carbon, vi khuẩn và nấm.
+ Bạch cầu hạt trung tính (Neutrophil): Phân bố ở thận, lách, máu, các ổ
viêm loét (Afonso và ctv, 1998). Chúng có khả năng thực bào, hóa ứng động và tiêu
diệt vi khuẩn (Secombes, 1996).
2.1.1.3. Viêm
Đặc điểm căn bản của phản ứng viêm cấp tính là tăng tính thấm thành mạch,
hóa ứng động bạch cầu từ máu đến ổ viêm. Đáp ứng tế bào trong phản ứng viêm
trải qua hai giai đoạn: thoạt đầu là sự gia tăng số lượng bạch cầu trung tính từ máu
chuyển đến, tiếp sau là sự xuất hiện của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào tại ổ
viêm. Bạch cầu trung tính tập trung khoảng 1 giờ sau khi tiêm tác nhân gây viêm và
đạt số lượng cực đại sau 48 giờ (Afonso và ctv, 1998).
2.1.2. Các cơ chế miễn dịch đặc hiệu
Trung tâm của các cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là tế bào lympho. Các
lympho bào có chức năng hoạt hóa và điều hòa 3 khía cạnh của tính miễn dịch đặc
hiệu: miễn dịch thể dịch, miễn dịch qua trung gian tế bào (Cell Mediate Immunity –

CMI) và ký ức miễn dịch. Miễn dịch thể dịch có liên quan đến việc sản sinh các
kháng thể hòa tan (globulin miễn dịch), trong khi CMI liên quan đến các đáp ứng

19


miễn dịch qua trung gian của nhiều loại tế bào bao gồm các tế bào lympho và các
dạng tế bào khác, đặc biệt là các đại thực bào. Các tế bào này được huy động và
điều hòa bởi các sản phẩm của lympho bào.
Một khía cạnh quan trọng của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là tính nhớ, hình
thành bởi những biến đổi thích ứng của các quần thể tế bào lympho, nhờ đó mà khi
tiếp xúc lại với cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên đáp ứng miễn dịch
thứ cấp đặc trưng bởi thời gian phản ứng nhanh với cường độ mãnh liệt hơn.
2.1.2.1 Các tế bào lympho
Tế bào lympho phân bố trong hệ thống tuần hoàn, các cơ quan lympho và
các mô khác, đặc biệt trong phản ứng viêm. Có hai quần thể tế bào lympho: các tế
bào lympho T biệt hóa từ tuyến ức (thymus) và các tế bào lympho B biệt hóa ở tủy
xương. Các tế bào lympho T đảm trách đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và
hỗ trợ tế bào lympho sản sinh kháng thể. Các tiểu quần thể tế bào lympho B và
lympho T còn đảm trách chức năng nhớ (tế bào nhớ) và dung thứ miễn dịch (tế bào
ức chế).
Nhờ kết hợp kỹ thuật phân lập, các phương pháp xét nghiệm in vitro, các nhà
khoa học đã cung cấp được bằng chứng về sự tồn tại các tế bào lympho B và
lympho T ở cá.
Lympho bào có mặt trong tuần hoàn máu, bạch huyết và trong các cơ quan
lympho chủ yếu của cá: tuyến ức, thận và lách. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng có
sự tham gia về số lượng lympho bào tại mang, da và ruột cá, đặc biệt trong các
trường hợp phản ứng lại với sự nhiễm trùng hoặc các chất kích thích.
2.1.2.2. Các cơ quan lympho
- Tuyến ức (thymus)

Những bằng chứng hiện có cho thấy rằng tuyến ức tham gia vào việc sản
xuất vô số tế bào lympho để chuyển đến các mô khác, nhưng lại ít tham gia vào việc

20


thực thi các phản ứng miễn dịch. Với ý nghĩa này, tuyến ức có thể được xem là một
cơ quan lympho nguyên thủy.
- Thận
Mô tạo máu của thận rất giống với tủy xương của động vật có xương bậc cao
nhưng khác ở điểm là các mô này có thành phần các tế bào thuộc mạng lưới nội mô
sản sinh kháng thể hoạt tính cao (Press & Evensen, 1999).
Các tế bào lympho ở mọi giai đoạn phát triển (lympho bào lớn, lympho bào
bé, tế bào ưa pyronin, tương bào) đều có mặt trong mô tạo máu. Lympho bào của cá
tuần hoàn qua các mô nhất định trong thận (Ellis và de Sousa, 1974). Sự gia tăng
cực đại của hàm lượng kháng thể trong huyết thanh là cơ sở của giả thuyết cho rằng
các tế bào này có liên quan đến việc sản xuất kháng thể như ở động vật có vú.
- Lách:
Mô lympho trong lách của cá xương có cấu trúc chặt chẽ hơn ở các loài cá
tiến hóa cao nhưng kích thước không lớn và chưa đạt đến mức độ cấu trúc hoàn
chỉnh như ở động vật có vú (Press và Evenson, 1999). Dưới sự kích thích của kháng
nguyên, các tế bào sản xuất kháng thể xuất hiện với cơ chế tương tự như ở thận.
- Bắt giữ kháng nguyên
Khi tiêm kháng nguyên hòa tan vào cơ thể, khó có thể nhận biết được việc
bắt giữ kháng nguyên của mô lympho cho đến khi xuất hiện kháng thể trong máu. Ở
thời điểm này, kháng nguyên và glolulin miễn dịch bị giữ lại trong mạng lưới của
thể ellipsoid của lách và tiếp theo là trên bề mặt các đại thực bào chứa melanin.
2.1.2.3. Globulin miễn dịch (Ig)
Vai trò bảo vệ cơ thể của kháng thể bao gồm việc trung hòa virus, độc tố và
kết dính với vi khuẩn, hoạt hóa hệ thống bổ thể, opsonin hóa các tiểu thể - tế bào vi

khuẩn và virus. Kháng thể là một nhóm protein được gọi là globulin miễn dịch

21


(Immunoglobulin – Ig). Động vật có vú có 5 lớp globulin miễn dịch nhưng ở cá
xương chỉ có một lớp đồng dạng là IgM (Kaatari và Piganelli, 1996). Đơn vị cấu
trúc cơ bản của Ig bao gồm 2 chuỗi nặng (Heavy chain – H) và 2 chuỗi nhẹ (Light
chain – L).
IgM là globulin miễn dịch lớn nhất, có cấu trúc gần giống như một hình sao
do năm đơn vị hợp thành, phân tử IgM có năm mảnh Fab nằm lộ ra năm đầu phía
ngoài, tạo điều kiện thuận lợi cho phân tử IgM kết hợp dễ dàng với kháng nguyên
tạo nên phản ứng ngưng kết, kết tủa (Lê Văn Hùng, 2002).
- Chức năng của Ig ở cá
+ Trung hòa: Vai trò quan trọng của kháng thể cá trong việc trung hòa virus
đã được chứng minh rõ ràng, kháng thể cá còn có vai trò trong việc vô hiệu hóa các
tác nhân gây bệnh của vi khuẩn như các độc tố, nhân tố kết dính (Ellis, 1999).
+ Hoạt hóa bổ thể : Hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển đòi hỏi sự có
mặt của ion Ca2+ tương tự như ở động vật có vú, tuy nhiên kháng thể của cá hồi vân
còn có thể hoạt hóa bổ thể theo con đường khác.
+ Opsonin hóa tiểu thể : Ở cá, các kháng thể đặc hiệu bao quanh có thể làm
gia tăng khả năng thực bào, nhưng để đạt đến hoạt tính thực bào cao luôn đòi hỏi sự
có mặt của bổ thể (Secombes, 1996). Vì thế , IgM ở một số loài cá nhất định có thể
có vai trò opsonin một cách trực tiếp.
- Đáp ứng kháng thể
Có nhiều thông tin liên quan đến cơ chế của việc sản sinh kháng thể của cá
đã được công bố. Các thông tin này bao gồm các chứng cứ về sự tham gia của đại
thực bào trong việc xử lý và trình diện kháng nguyên cho các tế bào lympho liên
quan đến các kháng nguyên phức hợp trong pha cảm ứng của quá trình sản sinh
kháng thể (Vallejo và ctv, 1992), tương tác giữa các tế bào “B” và “T” (Miller và

22


ctv, 1987) và sự tham gia của các cytokine (Secombes và ctv, 1996). Những số liệu
này cho thấy cơ chế tương tự như quá trình sản xuất kháng thể ở động vật có vú.
Tương bào bắt đầu xuất hiện và số lượng tăng mãnh liệt trong lách và thận
khoảng 1 tuần sau khi bị kháng nguyên kích thích. Sau khi đạt cực đại, số lượng tế
bào này suy giảm nhanh chóng. Kháng thể huyết thanh xuất hiện ngay trước thời
điểm số lượng tương bào đạt cực đại (ngày thứ 10 – 15) và hàm lượng tăng lên
mãnh liệt để đạt cực đại (ngày thứ 20 – 30). Tùy dạng kháng nguyên và loài cá,
lượng kháng thể trong huyết thanh có thể suy giảm nhanh hoặc chậm.
So với động vật có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn, nhưng thời gian duy
trì hàm lượng kháng thể lại lâu dài hơn.
2.1.3. Đáp ứng miễn dịch dịch nhầy
Gây miễn dịch bằng cách ngâm hoặc cho ăn có thể kích thích sự hình thành
đáp ứng kháng thể trong lớp dịch nhầy mà không làm gia tăng kháng thể trong
huyết thanh. Để kích thích việc sản xuất kháng thể trong huyết thanh bằng cách
ngâm hoặc cho ăn vaccine cần phải lặp lại việc gây miễn dịch nhiều lần (Joosten và
ctv, 1997; Palm và ctv, 1998). Mặc khác, gây miễn dịch bằng cách tiêm được xem
là phương thức hiệu quả nhất để kích thích các tế bào sản xuất kháng thể so với
kháng nguyên được hấp thu ở ruột và mang cá (Davidson và ctv, 1993; Lin và ctv,
1999).
2.1.4. Ký ức miễn dịch
Ký ức miễn dịch có ý nghĩa vừa tích cực lẫn tiêu cực. Tính tiêu cực thể hiện
ở tính dung thứ miễn dịch. Tính tích cực thể hiện trong đáp ứng miễn dịch thứ phát
mà điển hình là thời gian hình thành kháng thể sớm hơn và cường độ phản ứng
mãnh liệt hơn so với đáp ứng miễn dịch nguyên phát.
Ký ức và dung thứ miễn dịch có thể tồn tại ngắn ngủi hoặc lâu dài. Cơ chế
của ký ức miễn dịch tập trung vào sự biệt hóa của các tế bào nhớ T, tế bào nhớ B có

23


tuổi thọ lớn và những biến đổi tính chất của tế bào đáp ứng miễn dịch, nhờ đó các
dòng tế bào có ái tính cao với kháng nguyên được chọn lọc.
Ký ức miễn dịch đã được chứng minh ở cá đối với cả miễn dịch dịch thể lẫn
miễn dịch qua trung gian tế bào. Hàm lượng kháng thể cực đại hình thành trong đáp
ứng miễn dịch thứ phát so với hàm lượng này trong đáp ứng miễn dịch nguyên phát
ở cá nhìn chung thấp hơn nhiều so với động vật có vú và phụ thuộc vào nhiệt độ. Cá
chép nuôi ở 18oC có thời gian đáp ứng miễn dịch thứ phát ngắn hơn, đạt cực đại
nhanh hơn nhưng hàm lượng kháng thể tối đa trong huyết thanh không thay đổi so
với đáp ứng miễn dịch nguyên phát. Ở 20oC hàm lượng kháng thể thứ phát cao hơn
nguyên phát khoảng 10 lần, và ở 24oC tỷ lệ này là khoảng 50 lần (Lamers và ctv,
1985).
Dung thứ miễn dịch ngắn hạn được chứng minh ở cá khi cho cá còn non tiếp
xúc với kháng nguyên bằng cách cho ăn hoặc ngâm (Joosten, 1995; Tatner, 1996)
2.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch
-Nhiệt độ
Mikkelsen và ctv (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hình
thành kháng thể đặc hiệu chống lại Ichthyophthirius multifiliis trên cá hồi vân
(Oncorhynchus mykiss) bằng cách gây nhiễm cá với Ichthyophthirius multifiliis sau
đó nuôi trong 3 nhiệt độ khác nhau 5oC, 12oC và 20oC trong 56 ngày. Kết quả cho
thấy nhóm nuôi trong nước 5oC có đáp ứng miễn dịch chậm hơn nhưng không cản
trở sự hình thành kháng thể. Có mối quan hệ giữa nhiệt độ nước thấp và sự chậm
hình thành kháng thể.
Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và oxy trong việc hình thành
kháng thể đặc hiệu trên cá chẽm (Dicentrarchus labrax L.) cho thấy rằng nhóm cá
được nuôi trong nhiệt độ 24 và 30 °C có kháng thể cao hơn nhóm nuôi trong nhiệt
độ nước 12 và 18 °C. Hơn nữa sau 56 ngày thí nghiệm còn cho thấy cá sống trong

24


điều kiện đầy đủ oxy có kháng thể cao hơn có ý nghĩa so với nhóm cá sống thiếu
oxy.
Bly và Clenn (1992) đã tổng hợp các thông tin về ảnh hưởng của nhiệt độ
đến đáp ứng miễn dịch. Nhìn chung, trong phạm vi thích ứng của loài, nhiệt độ càng
cao đáp ứng miễn dịch càng nhanh và cường độ càng cao.
Ngoài ra còn có nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch
như mùa trong năm, dinh dưỡng, các vitamin, kháng sinh, chất gây ô nhiễm, stress.
2.2. Tổng quan về tác nhân gây bệnh-vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri thuộc

Ngành

: Proteobacterria

Lớp

: Gammaproteobaterria

Bộ

: Enterobacteriales

Họ

: Enterobacteriaceae

Giống

: Edwardsiella

2.2. 1. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri
E. ictaluri là vi khuẩn gram âm, hình que, vận động nhờ tiêm mao.
Bảng 2.1.: Đặc tính của vi khuẩn E. ictaluri
E. ictaluri

Đặc tính
Pron oCatalase

+

β-galactosidase

+

Lysine decarboxylase

+

Ornithine decarboxylase

+

25