ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nhiễm edwardsiella ictaluri

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







LÊ NGỌC LAN VÂN








ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH LÊN
CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM
Edwardsiella ictaluri






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

LỜI CẢM TẠ

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Đặng Thụy Mai Thy, cô Đặng Thị Hoàng
Oanh và chị Nguyễn Thị Thúy Liễu đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.

Mình xin chân thành cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp Bệnh học
thủy sản khóa 31 đã luôn gắn bó, quan tâm, giúp đỡ mình trong 4 năm đại học.

Lời cảm ơn cuối cùng con xin gởi đến cha mẹ, cha mẹ là nguồn động viên
lớn nhất giúp cho con vượt qua những lúc khó khăn , giúp con có đủ tự tin
trong học tập và trong cuộc sống.

Chân thành cảm ơn!

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

i
TÓM TẮT

Đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm Edwardsiella ictaluri” nhằm mục tiêu
xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi cá
tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E. ictaluri. Cá tra giống mua về
có biểu hiện bệnh mủ gan, tiến hành bố trí thí nghiệm với 7 nghiệm thức trong
đó có 6 nghiệm thức sử dụng kháng sinh, nghiệm thức 1 – Amoxicilin, nghiệm
thức 2 – Flofenicol, nghiệm thức 3 – Docycilin, nghiệm thức 4 – Flofenicol và
Amoxicillin, nghiệm thức 5 – Flofenicol và Doxycilin và nghiệm thức 6 -
Amoxicillin và Doxycilin, 1 nghiệm thức đối chứng không sử dụng kháng
sinh. Theo dõi tỉ lệ chết của cá, tiến hành phân lập vi khuẩn và lấy máu xác
định các chỉ tiêu huyết học trên những cá có biểu hiện lờ đờ. Kết quả thí
nghiệm cho thấy tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 cao nhất (100% cá chết vào ngày
thứ 3 thí nghiệm), kế đến là nghiệm thức đối chứng (93,3%), nghiệm thức 2
(93%), nghiệm thức 3 (47%), nghiệm thức 4 (43%), nghiệm thức 5 và 6
(30%). . Kết quả phân lập vi khuẩn xác định cá nhiễm bệnh do E.ictaluri.
Trong máu tìm được 5 loại tế bào: hồng cầu, lympho, tiểu cầu, bạch cầu đơn
nhân, bạch cầu trung tính. Ngoài ra còn tìm thấy hồng cầu nhiều nhân và
không nhân. Hồng cầu được định loại bằng dung dịch Natt – Herick, bạch cầu
bằng phương pháp nhuộm Wright & Giemsa.
Số lượng hồng cầu của cá sau khi điều trị bằng kháng sinh là 1,6x10
6
tế
bào/mm
3
thấp hơn hồng cầu của cá nhiễm bệnh trước khi sử dụng kháng sinh
là 1,8x10

6
tế bào/mm
3
, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Lympho sau sử dụng kháng sinh thấp hơn trước khi sử dụng kháng sinh còn
bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính sau sử dụng kháng sinh cao hơn
trước khi sử dụng kháng sinh.
Đối với từng nghiệm thức, lympho và bạch cầu trung tính ở nghiệm thức
không sử dụng kháng sinh có số lượng thấp nhất (13,3x10
3
tế bào/mm
3
và
7,3x10
3
tế bào/mm
3
), số lượng lympho cao nhất ở nghiệm thức 6 (53,8x10
3
tế
bào/mm
3
) và bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức 2 (16,6x10
3
tế
bào/mm
3
). Số lượng bạch cầu đơn nhân cao nhất ở nghiệm thức 2 với 12,8x10
3

tế bào/mm
3
và tiểu cầu cao nhất với số lượng 24.6x10
3
tế bào/mm
3
ở nghiệm
thức 6. Nghiệm thức 5 có số bạch cầu đơn nhân thấp nhất (5,1x10
3
tế
bào/mm
3
) và nghiệm thức 2 có số tiểu cầu thấp nhất (5,3x10
3
tế bào/mm
3
).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

ii
MỤC LỤC
Tóm tắt i
Mục lục ii
Danh sách bảng iv
Danh sách hình v
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra 2
2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra 2
2.3 Bệnh mủ gan trên cá 2

2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và
Việt Nam 3
2.5 Kháng sinh 4
2.5.1 Khái niệm 4
2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh 4
2.5.3 Các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong thủy sản 5
2.6 Những nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
E.ictaluri 6
2.7 Các chỉ tiêu huyết học 7
2.7.1 Hồng cầu ( Erythrocyte) 8
2.7.2 Bạch cầu đơn nhân 8
2.7.3 Bạch cầu trung tính ( Neutrophil) 9
2.7.4 Tiểu cầu ( Thrombocyte 9
2.7.5 Tế bào lympho ( lymphocyte) 10
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iii
3.1 Thời gian thực hiện 11
3.2 Địa điểm nghiên cứu 11
3.3 Vật liệu nghiên cứu 11
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 11
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 11
3.3.3 Hóa chất 11
3.4 Phương pháp nghiên cứu 12
3.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm 12
3.4.2 Bố trí thí nghiệm 12
3.4.3 Các chỉ tiêu thu thập 12
3.5 Định danh vi khuẩn 13
3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học 13

3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hống cầu 13
3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu 14
3.7 Xử lý số liệu 15
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 16
4.1 Dấu hiệu bệnh lý 16
4.2 Kết quả thí nghiệm 16
4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn 17
4.4 Kết quả phân tích huyết học 18
4.4.1 Hồng cầu 18
4.4.2 Bạch cầu 20
CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24
5.1 Kết luận 24
5.2 Đề xuất 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iv
Phụ lục 28

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

v

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn E.ictaluri
phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (nguồn: Nguyễn Đức Hiền) 8
Bảng 3.1 Các loại thuốc và liều lượng kháng sinh sử dụng cho các nghiệm
thức thí nghiệm 12
Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu trước và sau khi sử dụng
kháng sinh 20

Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu ở các nghiệm thức sau khi sử dụng kháng
sinh 21


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vi
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G),
thận (Th) và tỳ tạng (Tt)). 3
Hình 2.2 Tế bào hồng cầu 8
Hình 2.3 Bạch cầu đơn nhân 9
Hình 2.4 Bạch cầu trung tính 9
Hình 2.5 Tiểu cầu 10
Hình 2.6 Tế bào lympho 10
Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 13
Hình 3.2 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 14
Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trogn quá trình thí
nghiệm 16
Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA 17
Hình 4.3 Kết quả nhuộm gram 18
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra các loai đường 18
Hình 4.5 Hồng cầu nhiều nhân (100X) 18
Hình 4.6 Hồng cầu không nhân (100X) 18
Hình 4.7 Biểu đồ mật độ hồng cầu cá tra trước, sau khi sử dụng kháng sinh và
không sử dụng kháng sinh 19
Hình 4.8 Tế bào lympho (100X) 20
Hình 4.9 Tiểu cầu (100X) 20
Hình 4.10 Bạch cầu trung tính (100X) 20

Hình 4.11 Bạch cầu đơn nhân (100X) 20
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vii


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Nghề nuôi trồng thuỷ sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có
đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Hiện tại, nhu cầu cá tra cho xuất
khẩu và tiêu thụ trong nước đều tăng cao. Giải pháp quan trọng để tạo thêm
nhiều sản phẩm là nuôi công nghiệp tập trung. Song song với sự phát triển đó,
vấn đề dịch bệnh trên cá tra nuôi ngày càng trở nên trầm trọng. Tình hình dịch
bệnh xuất hiện nhiều hơn khi vào mùa mưa, chủ yếu là bệnh gan thận có mủ,
trắng gan, trắng mang. Theo thống kê của Bộ nông nghiệp và phát triển nông
thôn, diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL giảm hơn trước, tính đến ngày15/8/2008,
diện tích thả nuôi của các tỉnh An Giang là 1.392 ha, Cần Thơ - 1.250 ha,
Đồng Tháp - 630 ha, Bến Tre - 563 ha, Vĩnh Long - 221 ha, Sóc Trăng - 212
ha, Hậu Giang - 171 ha và Tiền Giang - 118 ha (Dương Long Trì, 2008).
Để hạn chế dịch bệnh người nuôi đã sử dụng một số loại kháng sinh. Việc
dùng kháng sinh trị bệnh thường tốn kém và hiệu quả không cao. Theo điều tra
của Nguyễn Tấn Duy Phong ( 2008) về tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản
ở 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang cho thấy chi phí cho việc sử dụng thuốc thú y
thủy sản là rất lớn, chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất. Hơn nữa lượng tồn dư
kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn ảnh hưởng
đến sức khoẻ người tiêu dùng.
Việc dùng kháng sinh tùy tiện, không đúng loại, liều lượng và cách thức điều
trị đã đưa đến hiệu quả điều trị của kháng sinh ngày càng giảm và tạo ra các

dòng vi khuẩn kháng thuốc.
Từ thực tế nêu trên, đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ
tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm
Edwardsiella ictaluri” được thực hiện với mục tiêu xác định ảnh hưởng của
các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi cá tra lên các chỉ tiêu huyết học
của cá tra khỏe và cá bị nhiễm E. ictaluri.
Nội dung đề tài:
- Xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi
cá tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E. ictaluri.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra
Tình hình dịch bệnh trên cá tra của các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông
Cửu Long trong năm 2007 cho thấy các bệnh thường xảy ra và gây thiệt hại
cho người nuôi đó là bệnh gan, thận có mủ (đốm trắng trên gan, thận) với tần
suất xuất hiện cao (52,8%), kế đến là bệnh xuất huyết (42,5%), phù đầu, phù
mắt (20,7%), vàng da và thân (21,6%). Riêng bệnh gan, thận có mủ (đốm
trắng trên gan, thận) thì An Giang chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến là
Cần Thơ: 54,89%, Vĩnh Long 53,8%, Đồng Tháp 36%. Bệnh thường xảy ra từ
tháng 5 đến tháng 9 vào mùa nước xoay ở đồng bằng sông Cửu Long, đỉnh
điểm rơi vào tháng 9-10; đặc biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ
thả giống hay lứa tuổi cá.
2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra
Bệnh mủ gan được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1998. Đây là một
bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long. Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61% không
cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ 68,3%, bệnh phù

đầu 51,2% . Bệnh mủ gan là một trong các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tỷ lệ
hao hụt cao, đặc biệt giai đoạn cá giống và cá nuôi thương phẩm dưới 3 tháng
tuổi. Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra
phát triển mạnh mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần
Thơ (huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp) (Từ Thanh Dung và ctv, 2002)
2.3 Bệnh mủ gan trên cá tra
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002), giống như những bệnh khác, cá mắc bệnh
mủ gan có biểu hiện lờ đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu
môn. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá kém ăn, nhưng nếu không áp dụng các
phương pháp điều trị và không giảm lượng thức ăn thì bệnh sẽ trở nên trầm
trọng hơn và rất khó điều trị. Phần nội quan có những đốm trắng, đường kính
1-3mm. Trên gan, thận, tỳ tạng sưng to nhất là thận sẽ bị sưng và nhũng. Tỉ lệ
chết từ 10-90% tổng số cá nuôi trong bè. Nguyên nhân của bệnh này là do vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3

Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G),
th
ận (Th) v
à t
ỳ tạng (Tt) (Từ Thanh Dung
và

ctv
, 2002
).

E. ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy
hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương tính. Các chỉ tiêu sinh hóa
của E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính.
Phản ứng indole và H
2
S âm tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2002).
2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới
Nhận rõ sự nguy hiểm của kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng trực tiếp
đến người tiêu dùng do vậy thị trường bên ngoài đã có nhiều biện pháp nhằm
kiểm soát dư lượng kháng sinh an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản. Cụ thể ở
một số thị trường bên ngoài mà Việt Nam hướng vào như Canada, Trung
Quốc, Hàn Quốc, EU, Mỹ… đã ban hành những văn bản pháp lý làm rào cản
trong việc kiểm soát dư lượng kháng sinh tồn tại trong sản phẩm thủy sản
(Nguyễn Ngọc Hải, 2004).
Ở Việt Nam
Qua khảo sát của Nguyễn Ngọc Hải (2004) cho thấy người ương cá đều dùng
thuốc hay hóa chất với nhiều chủng loại khác nhau. Tỉ lệ thuốc kháng sinh
nguyên liệu và thuốc có nguồn gốc kháng sinh chiếm đa số với 23 loại kháng
sinh là nguyên liệu gốc và 27 loại có chứa thành phần phối chế chuyên dùng
như kháng sinh, tỉ lệ thuốc kháng sinh chiếm số lượng lớn (40,65%) trong cơ
cấu thuốc. Ngoài ra, có nhiều loại thuốc được dùng có tên gọi không rõ ràng
(12% số hộ), 6 loại đã được quy định giới hạn sử dụng tối đa: ampicillin,
tetracillin, oxytetracillin, amoxicillin, cloxacillin, sulfonamide; 1 loại bị cấm

hoàn toàn : chloramphenicol đều có xuất hiện trong danh mục sử dụng ở vùng
Hồng Ngự. Mức độ đầu tư cho khoảng chi phí thuốc và hóa chất phòng trị
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
bệnh khá cao, đa phần các hộ đều không nhớ hết những loại đã sử dụng và số
lần phải dùng để điều trị trong năm, ước lượng chiếm từ 8- 31% ( trung bình
15,7%) tổng chi phí vụ ương.
Theo điều tra của Nguyễn Chính (2005) ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ về tình
hình sử dụng thuốc và hóa chất cho thấy các nhà sản xuất đã thay đổi cách
phối trộn, liều lượng và đặt tên khác cho sản phẩm, cùng 1 sản phẩm nhưng có
nhiều tên khác nhau như cùng sản phẩm với đơn chất là Colistin nhưng có đến
7 tên khác nhau: Coli 1000, HHN-Coli, Colimeiji, Vicoli, ST Colizon, ADP
Colizon, Coli-tialincomplex. Ngoài ra, nhiều loại kháng sinh điều trị cho
người và gia súc cũng được người dân sử dụng trong thủy sản. Liều lượng sử
dụng rất khó xác định vì là thuốc phối chế.
2.5 Kháng sinh
2.5.1 Khái niệm
Hiện tượng kháng sinh được Alexander Fleming phát hiện từ năm 1928 thông
qua việc phát hiện ra chất penicillin do một loại nấm có tên là Penicillin
notatum sản sinh ra. Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin
thô thử nghiệm trên động vật có kết quả tốt, đến năm 1946 con người đã sản
xuất ra được penicillin kết tinh, từ đó bắt đầu một thời kỳ mới, thời đại hoàng
kim của y học: thời đại của chất kháng sinh.
Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), kháng sinh là các
chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn,
vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng hợp nên, có tác dụng một
cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong chu trình biến dưỡng của
các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân kháng nấm), của
virus (tác nhân kháng virus).
2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

Theo Bùi Quang Tề (2004) các thuốc kháng sinh có tác dụng độc lập với cấu
trúc hóa học chính là do nó được gắn vào các điểm tác dụng, mà các điểm tác
dụng này có thể xác định được một cách chắc chắn bằng các phương pháp
hóa, lý khác nhau. Khi thuốc kháng sinh tác động vào các điểm tác dụng, liền
theo đó các quá trình sinh tổng hợp proyein, sinh tổng hợp màng, quá trình
hoạt động màng, sự chuyển hóa ADN và ARN, sự tổng hợp purin và
pirimidin, sự oxy hóa – khử sinh học, sự phosphoryl hóa trong cơ thể sinh vật
bị thay đổi, đảo lộn hoặc mất đi. Bằng những con đường khác nhau, chất
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
kháng sinh làm thay đổi các yếu tố trao đổi chất của các quá trình trên và từ đó
nó thể hiện tác dụng diệt khuẩn, tác dụng kháng khuẩn hoặc các tác dụng khác
trong đó có tác dụng gây nên khả năng kháng thuốc. Các kết quả nghiên cứu
hiện đại đã chỉ rõ hoạt động của các chất kháng sinh đều cho một hướng giống
nhau ở trong cơ thể đơn bào cũng như cơ thể đa bào, nhưng những hiệu quả
của các quá trình đó thể hiện bằng những đặc hiệu khác nhau cả về số lượng
và cả về chất lượng.
2.5.3 Các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong thủy sản
Y Nhóm β-lactamin
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu có tác dụng trên vi
khuẩn gram dương và một số ít vi khuẩn gram âm, là kháng sinh diệt khuẩn
tác dụng ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.
Ngoài tác dụng diệt khuẩn nhóm này còn tác động kiềm hãm vi khuẩn. Tuy
nhiên, nhóm β-lactamin chỉ có tác dụng với vi khuẩn đang phát triển, còn vi
khuẩn không phân bào thì không chịu tác dụng của thuốc do chúng có thể tổng
hợp màng ngoài ( Nguyễn Khang, 2005.).
Một số loại thường dùng trong nhóm β-lactamin là amoxillin, ampicillin
thường dùng điều trị các bệnh do Stretococcosis, Edwardsiellosis,
Furunculosis, Pasteurellosis.Nhóm Vibrio và Aeromonas thường kháng với
kháng sinh này ( Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006).

Y Nhóm Tetracyclin
Nhóm này có phổ kháng khuẩn rộng tác dụng trên vi khuẩn gram âm, gram
dương, nguyên sinh động vật, là kháng sinh kìm khuẩn phổ rộng, ở nồng độ
thấp có khả năng ức chế vi khuẩn nhưng ở nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn
Các kháng sinh oxytetracyclin, chlotetracyclin và doxycyclin thuộc nhóm
tetracycline được dùng phổ biến trong nuôi thủy sản. Các kháng sinh này
thường được dùng để trị bệnh đường ruột, bệnh nhiễm khuẩn máu, xuất huyết
ở các loài cá nước ngọt như cá tra, basa, trắm cỏ (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006) thì các kháng sinh
này được dùng để điều trị đỏ mỏ, đỏ kì, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa
bụng trên cá, bệnh trầy da ở ếch, bệnh phồng cổ ở basa
Y Nhóm Quinolones
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng tác dụng ức chế tổng hợp
AND do ức chế enzyme DNA gyrase làm mất hoạt tính của enzyme này. Do
có tính tạo chelat nên khi sử dụng không nên dùng chung với các chất có chứa
cation hóa trị 2 vì nó sẽ làm giảm hấp thụ kháng sinh này
Các kháng sinh nhóm Quinolones được sử dụng phổ biến trong nuôi thủy sản
như: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin được sử dụng phổ biến trong
việc điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri (Từ Thanh Dung và ctv,
2005)
Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid có hoạt
phổ mạnh trên vi khuẩn gram âm, nhóm Vibrio sp. gây bệnh trên tôm
Y Nhóm Sulfonamid
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn gram âm và một
số vi khuẩn gram dương. Nhóm Sulfonamid chỉ có tác dụng kìm khuẩn do cấu
trúc của nó tương tự như PABA ( para_aminobenzoic acid) do đó nó ức chế
cạnh tranh với chất này trong một giai đoạn tổng hợp acid folic
Các kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid thường dùng trong thủy sản là

sulfadiazine, sulfamethizole ở dạng kết hợp với trimethoprim điểu trị các bệnh
như: đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm trắng, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn
gây ra trên cá, Vibrio.
2.6 Những nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Edwadsiella ictaluri
- Theo kết quả khảo sát của Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007)
về tính đề kháng kháng sinh của 47 chủng E. ictaluri cho thấy 47 chủng
E. ictaluri phân lập được đều đề kháng với Sulfamethoxazole/Trimethoprim,
đối với Colostin thì có tới 46/47 chủng vi khuẩn (chiếm 97,9%) kháng với
kháng sinh này. Đối với các loại kháng sinh còn lại E. ictaluri đề kháng 1
phần với tỷ lệ thay đổi từ 27,7% đến 42,5%
- Qua kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Từ Thanh Dung và ctv (2002) trên vi
khuẩn E. ictaluri cho kết quả kháng với 3 loại thuốc kháng sinh là
oxytetracyllin, oxolinic acid và sulphonamid. Nguyên nhân là do trong quá
trình nuôi cá tra người dân thường sử dụng thuốc kháng sinh không hợp lý.
Đ
ộ nhạy (%) các loại kháng sinh khảo sát

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
- Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ của Nguyễn Đức Hiền (2008) tại các tỉnh
Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy
mức độ nhạy của thuốc trên vi khuẩn ngày càng giảm dần.

Chú thích: Do: Doxycillin, Flo: Flofenicol, Norflox: Norfloxacin, Enro:
Enrofloxacine, Amox: Amoxicilin, Sulfa+Trime: Sulfadiazin+Trimethoprim.
Bộ thủy sản đã đưa ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng
2 năm 2005 quy định danh mục 17 loại thuốc kháng sinh cấm sử dụng và danh
mục 34 loại hạn chế sử dụng (phụ lục 1).
2.7 Các chỉ tiêu huyết học

Máu là một loại mô liên kết đặc biệt gồm các chất cơ bản là chất lỏng và phần
tế bào ( huyết cầu).Máu giữ chức năng hô hấp, vận chuyển các chất dinh
dưỡng cung cấp cho cơ thể, đào thải những chất cặn bã, độc hại (trích dẫn bởi
Phạm Thị Phương Tiến, 2008).
Theo Nguyễn Hoài Hương (2009) thì máu là loại mô liên kết bao gồm các tế
bào lơ lửng trong khoảng gian bào là dịch lỏng. Chúng có chức năng vận
chuyển các chất giữa các tế bào trong cơ thể và môi trường bên ngoài, đồng
thời làm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, điều hòa hoạt động của các cơ quan, điều hòa
thân nhiệt, cân bằng nước và muối khoáng. Ngoài ra máu còn tham gia vào
việc duy trì ổn định áp suất thẩm thấu và độ pH của dịch thể. Cùng với bạch
huyết và các dịch thể khác, máu tạo thành môi trường bên trong (nội môi).
Môi trường này luôn có chỉ tiêu sinh lý – sinh hóa ổn định đảm bảo cho sự tồn
tại và phát triển của hệ thống sống trong cơ thể. Nếu để máu vào ống nghiệm
để lắng hoặc ly tâm sẽ thấy máu phân thành 2 lớp: phía trên là huyết tương
màu vàng nhạt chiếm 55% thể tích , phía dưới là tế bào máu chiếm 45 % thể
Năm Doxy Flo Flumequin Norflox Enro Amox Sulfa+Trime
2006(n=125) 87,2 66,4 61,6 53,6 77,6 55,2 22,4
2007(n=197) 67 10,7 45,2 41,62 57,8 35 0
T1-
3/08(n=120)
66,6 3,8 30,5 41,7 21,2 49,9 0
B
ảng 2.1 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn
E.

ictalur
i

phân
lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (nguồn Nguyễn Đức Hiền, 2008)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
tích. Trong các tế bào máu hồng cầu có số lượng lớn nhất khoảng trên 99%
tổng số, còn lại một phần rất ít là bạch cầu và tiểu cầu.
2.7.1 Hồng cầu (Erythrocyte)
Hồng cầu là loại tế bào máu chiếm số lượng lớn nhất. Hồng cầu trưởng thành
có dạng hình tròn hoặc oval, nhân bắt màu tím đậm đồng nhất có kích thước từ
10x11 µm-12x13µm, đường kính nhân 4-5µm (Chinabut, 1991). Tế bào chất
bắt màu xanh nhạt, phân chia rõ ràng với nhân. Hồng cầu chưa trưởng thành ít
được tìm thấy






2.7.2 Bạch cầu đơn nhân (monocyte)
Bạch cầu đơn nhân có nhân lớn lệch tâm, hình dạng nhân biến đổi. Ớ một số
bạch cầu đơn nhân có thể quan sát được không bào trong tế bào chất. Nhân bắt
màu xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt. Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn
nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10-14µm.





2.7.3 Bạch cầu trung tính (Neutrophil)
E: hồng cầu thành thục
R: hồng cầu chưa thành thục
Hình 2.2 Tế bào hồng cầu của cá trê trắng

(Chinabut et al, 1991)
Hình 2.3 Bạch cầu đơn nhân của cá trê trắng
(Chinahut et al, 1991)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
Bạch cầu trung tính có nhân nhỏ bắt màu xanh tối, thường nằm lệch về một
góc tế bào, đôi khi gặp bạch cầu trung tính phân thùy rất rõ. Tế bào chất có hạt
dạng lưới, màu hồng nhạt, đôi khi rất khó thấy tế bào chất.






2.7.4 Tiểu cầu (Thrombocyte)
Tiểu cầu có dạng dài hoặc hình thoi, nhân xanh đen chiếm hầu hết tế bào, tế
bào chất là một vành mỏng bao quanh nhân. Theo Chinabut và ctv ( 1991),
tiểu cầu đảm nhận vai trò quan trọng trong quá trình đông máu khi bị tổn
thương.




Hình 2.4 B
ạch cầu trung tính

c
ủa cá tr
ê tr
ắng

(Chinabut et al, 1991)
Hình 2.5 Tiểu cầu của cá trê trắng
(Chinabut et al, 1991)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
2.7.5 Tế bào lympho (Lymphocyte)
Tế bào lympho là dạng bạch cầu thường thấy nhất trong máu tuần hoàn, nhỏ
hơn hồng cầu. Tế bào lympho có nhân tròn, bắt màu tím đậm khi nhuộm với
thuốc nhuộm Giemsa, tế bào chất nhỏ là một lớp mỏng bao quanh nhân. Tế
bào lympho chiếm 70-90% tổng bạch cầu của cá (Hibiya, 1982. Trích dẫn bởi
Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008).






Hình 2.6 T
ế b
ào lympho

c
ủa cá tr
ê tr
ắng

(Chinabut
et al
, 1991)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
CHƯƠNG III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009
3.2 Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm gây cảm nhiễm tại phòng gây cảm nhiễm của Khoa Thủy Sản,
Đại Học Cần Thơ
Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và bệnh Thủy Sản, Khoa
Thủy Sản , trường Đại Học Cần Thơ
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15–20g.
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Kính hiển vi, cân điện tử, lame, lamelle, ống đong, ống nhỏ giọt, ống
nghiệm, khẩu trang, găng tay, pipet, đầu col 1ml và 0.1ml, chai chịu nhiệt,
bình tam giác, bình xịt cồn, cốc thủy tinh, bộ tiểu phẫu, que cấy, đĩa Petri, bể
composite, máy sục khí, hệ thống sục khí, xô nhựa, vợt, kim tiêm, buồng đếm
hồng cầu.
3.3.3 Hóa chất
- NaCl, Na
2
SO
4
, Na
2
HPO
4

.2.H
2
O, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, KH
2
PO
4.

- Formaline (37%) , chlorine, Methyl violet, nước cất, cồn 96°, cồn 70°,
methanol, glycerol, Wright, Giemsa, Acid citric, Tripticase soy agar
(TSA), nutrient broth (NB).
- Dung dịch nhuộm gram, giấy test oxidase, H
2
O
2.
- Các loại kháng sinh flofenicol, docycillin, amoxcillin.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm
- Bể composite được vệ sinh bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi khô.
Bể sau đó được cấp đầy nước xử lý bằng chlorin 30ppm và sục khí liên tục
trong vòng một tuần, kiểm tra lại nồng độ chlorin trong nước trước khi cho cá

vào bể. Nguồn nước là nước máy thành phố. Bể 1m
3
dùng để trữ cá được đặt
ngoài trời nơi có mái che. Bể 100L dùng để thí nghiệm nhưng chứa từ 70-80L
nước thí nghiệm. Bể được đặt trong phòng kín.
3.4.2 Bố trí thí nghiệm
- Cá mua về tiến hành kiểm tra, phân lập vi khuẩn, kết quả cho thấy có 10/15
con nhiễm bệnh. Thí nghiệm được bố trí trong 10 ngày với 7 nghiệm thức (3
lần lặp lại), mật độ là 10 con/bể.
- Sử dụng phương pháp ngâm kháng sinh trong 7 ngày để điều trị (1 lần/ngày)

Nghiệm thức Loại thuốc Liều lượng
1 Amoxicillin 4g/bể/ngày
2 Flofenicol 4g/bể/ngày
3

Doxycilin

4g/b
ể/ng
ày

4

Flofenicol+ Amoxicillin

4g/b
ể/ng
ày

5

Flofenicol+ Doxycilin

4g/b
ể/ng
ày

6

Amoxicillin+ Doxycilin

4g/b
ể/ng
ày

7 Đối chứng
Bảng 3.1 Các loại thuốc và liều lượng kháng sinh sử dụng cho các nghiệm
thức thí nghiệm
3.4.3 Các chỉ tiêu thu thập
Quan sát và ghi nhận những dấu hiệu cũng như biểu hiện của cá, theo dõi tỉ lệ
chết của cá trong suốt quá trình thí nghiệm. Thu mẫu kiểm tra các chỉ tiêu
huyết học trên những mẫu cá có dấu hiệu lờ đờ, gần chết. Phân lập vi sinh ở
gan, thận và tỳ tạng ở cá có biểu hiện lờ đờ, gần chết để tái định danh vi
khuẩn.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
3.5 Định danh vi khuẩn
Sau khi lấy mẫu bệnh trên 3 cơ quan đem ủ vi khuẩn ở điều kiện nhiệt độ 28-

30
0
C
Ghi nhận các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc sau 24-48 giờ:
- Hình dạng và kích thước khuẩn lạc trên môi trường TSA/NA, màu sắc
khuẩn lạc, điều kiện nhiệt độ vi khuẩn phát triển.
Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (phụ lục 2):
- Nhuộm gram, kiểm tra tính di động, phản ứng oxidase, phản ứng catalase,
khả năng lên men và oxi hóa đường glucose ( O-F test), khả năng sinh indole,
khả năng sử dụng đường, sinh gar và H
2
S, phản ứng tạo nitrit từ nitrate.
3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học
3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hồng cầu
Chuẩn bị 1990 µl dung dịch Natt & Herrick cho vào ống nghiệm, dùng ống
tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu cá (cuống đuôi) . Nhỏ máu xuống 1 tấm lame rồi
dùng pipet hút 10 µl máu cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch Natt &
Herrick, lắc nhẹ. Trữ lạnh và đếm mẫu trong vòng 24 giờ bằng buồng đếm
hồng cầu. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ( 40X) để xác định mật độ
hồng cầu (2 lần lặp lại).
Cách tính mật độ hồng cầu: HC = C x 10 x 5 x 200 (tb/mm
3
)
Trong đó C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.





Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14

3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu
Mẫu máu đếm bạch cầu được lấy cùng lúc với mẫu máu đếm hồng cầu. Sau
khi cho giọt máu lên lame ( đếm hồng cầu) , tiếp tục nhỏ một giọt máu lên 1
lame khác ( lập lại 3 lần) và thực hiện thao tác trãi mẫu máu: cho lamelle chạm
nhẹ vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước. Chờ cho mẫu máu khô sau
đó đem cố định trong dung dịch methanol 1-2 phút, để mẫu khô rồi trữ lạnh






Nhuộm mẫu:
Mẫu máu đã được cố định sẽ được nhuộm bằng dung dịch Wright & Giemsa.
(Cách chuẩn bị hóa chất nhuộm mẫu được trình bày trong phụ lục 3)
Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút
+ Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút
+ Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút.
+ Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút.
+ Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Phân loại các tế bào máu theo
Chinabut & ctv (1991).
Đếm bạch cầu:
Đọc mẫu theo hình Z-Z:


Hình 3.2 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15

Tổng bạch cầu (TBC)
+ Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm.
TBC (tb/mm
3
) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số
hồng cầu trên mẫu
Từng loại bạch cầu
+ Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào.
Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm
3
) = (số lượng mỗi loại BC x mật
độ TBC)/200
3.7 Xử lý số liệu
Các chỉ tiêu huyết học sẽ được xử lý bằng phép xử lý thống kê t-test ở mức ý
nghĩa 5%.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Dấu hiệu bệnh lý
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002) thì cá tra nhiễm E. ictaluri có biểu hiện lờ
đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn, cá kém ăn ở giai đoạn
mới chớm bệnh. Ở cá thí nghiệm nhiễm bệnh có biểu hiện nổi đầu, bơi lờ đờ
trên mặt nước. Quan sát nội tạng thấy có những đốm nhỏ màu trắng xuất hiện
ở gan, thận và tỳ tạng đặc biệt là ở thận . Một vài con nhiễm bệnh nặng thận bị
nhũng. Từ Thanh Dung và ctv (2002) cũng tìm thấy các dấu hiệu tương tự

trong nội quan cá tra bệnh.
4.2 Kết quả thí nghiệm
Qua phương pháp ngâm kháng sinh để điều trị cho cá tra nhiễm bệnh và qua
10 ngày theo dõi thí nghiệm để xác định ảnh hưởng của kháng sinh lên cá tra,
kết quả cho thấy kháng sinh có ảnh hớn rất lớn đối với cá tra nhiễm bệnh.











Ngày
Tỉ lệ chết (%)
Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trong quá trình
thí nghiệm
Chú thích: NT1: Amoxicillin, NT2: Flofenicol, NT3: Docycillin, NT4:
Flofenicol+Amoxicilin, NT5: Flofenicol+Docycillin, NT6: Amoxicillin+Docycillin,
NT7: Đối chứng
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version