ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN VIBRIO SPP. VÀ NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BẰNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY N – HEXANOYL HOMOSERINE LACTONE
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.74 MB, 130 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
****************
PHẠM MINH NHỰT
ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN VIBRIO SPP. VÀ
NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ
CHẼM (Lates calcarifer) BẰNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN
PHÂN HỦY N – HEXANOYL HOMOSERINE LACTONE
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2010
i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
****************
PHẠM MINH NHỰT
ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN VIBRIO SPP. VÀ
NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ
CHẼM (Lates calcarifer) BẰNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN
PHÂN HỦY N – HEXANOYL HOMOSERINE LACTONE
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 6042.80
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn khoa học:
1. TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH
2. TS. NGUYỄN HỮU THỊNH
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2010
ii
ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN VIBRIO SPP. VÀ
NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ CHẼM
(Lates calcarifer) BẰNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY
N – HEXANOYL HOMOSERINE LACTONE
PHẠM MINH NHỰT
Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
2. Thư ký:
TS. NGUYỄN PHÚ HÒA
Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
3. Phản biện 1: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
Viện Sinh học Nhiệt Đới
4. Phản biện 2: TS. HỒ THỊ KIM HOA
Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
5. Ủy viên:
TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản II
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG
iii
LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Phạm Minh Nhựt, sinh ngày 29 tháng 12 năm 1983 tại huyện
Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Con Ông Phạm Văn Thắng và Bà Nguyễn Thị Bảnh. Tốt
nghiệp tú tài tại Trường Trung học Phổ thông Quang Trung, tỉnh Tây Ninh năm
2000.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học, hệ Chính quy tại Trường
Đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh.
Sau đó, làm việc tại Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trường
Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, chức vụ Giảng viên.
Tháng 09 năm 2007 theo học Cao học Ngành Công nghệ Sinh học tại
Trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: Vợ: Trần Thị Ánh Nguyệt, năm kết hôn: 2010.
Địa chỉ liên lạc: Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Kỹ thuật Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, 144/24 Điện Biên Phủ, Phường 25,
Quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh.
Điện thoại: (08).35120788
Mobile: 0906.627.859
Email:
iv
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Phạm Minh Nhựt
v
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành được luận văn Cao học đồng thời hoàn thành khóa học Cao
học của mình, tôi rất chân thành biết ơn
TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ trong quá
trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Những kiến thức cũng như kinh
nghiệm của chị đã giúp em rất nhiều không chỉ trong luận văn mà còn
trong công tác sau này.
TS. Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình chỉ bảo và giúp em hoàn thiện luận văn
Cao học.
Các Thầy Cô và Ban Giám Hiệu Trường Đại học Trường Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy cũng như chỉ bảo để em có
thêm những kiến thức mới về ngành.
Ban Giám Hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa học này. Đồng thời, tôi
cũng gửi lời tri ân sâu sắc đến các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ đã giúp tôi cả về kiến thức lẫn thời
gian để tôi hoàn thành khóa học.
Ban Giám Đốc Trung tâm Quốc gia Giống Hải Sản Nam Bộ cùng tập thể
anh chị em Phòng Bệnh học – Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Cuối cùng, con gửi lời biết ơn sâu sắc đến mẹ cùng các cậu và dì trong gia
đình đã hết lòng giúp đỡ và động viên con mỗi khi con gặp khó khăn trong quá
trình học tập. Và cũng gửi lời tri ân sâu sắc đến vợ, người luôn luôn giúp đỡ,
động viên và luôn bên cạnh anh để anh có thể vượt qua những khó khăn trong
quá trình học tập và trong cuộc sống.
vi
TÓM TẮT
Đề tài “Đánh giá tính đối kháng vi khuẩn Vibrio spp. và nghiên cứu nâng
cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer) bằng các gốc vi khuẩn phân
hủy N – hexanoyl homoserine lactone” được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Vi
sinh vật nước và Trung Tâm Quốc Gia Giống Hải Sản Nam Bộ - Viện Nghiên
Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, thời gian từ tháng 09/2008 đến tháng 08/2009.
Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá một số đặc tính của các gốc vi khuẩn đã
phân lập như phân hủy HHL, đối kháng với Vibrio spp. trên ấu trùng cá chẽm,
sau đó tiến hành thử nghiệm hiệu quả của các gốc vi khuẩn này đối với tỷ lệ sống
của ấu trùng cá chẽm.
29 gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) và tôm sú (Penaeus
monodon) đã được thử nghiệm khả năng phân hủy HHL (N – hexanoyl
homoserine lactone), đối kháng với Vibrio spp. ở điều kiện in vitro, mức độ an
toàn đối với ấu trùng cá chẽm và mức độ bảo vệ ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm
với Vibrio spp. trong điều kiện in vivo trong 48 giờ cũng như đánh giá khả năng
nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở điều kiện bể ương của các gốc vi
khuẩn này.
Kết thúc thí nghiệm in vitro, trong số 29 gốc vi khuẩn chỉ có 15 gốc vi
khuẩn có khả năng phân hủy HHL trung bình trở lên hoặc/và có tính đối kháng
với Vibrio spp. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của các gốc này đối với ấu
trùng cá chẽm chỉ có 9 gốc vi khuẩn (gồm 6 gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm và
3 gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú) an toàn đối với ấu trùng cá chẽm trong thời
gian 48 giờ khảo sát. Tuy nhiên, 9 gốc vi khuẩn này không thể hiện được khả
năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm với Vibrio spp.
Ở điều kiện bể ương, ba gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú không có tác dụng
nâng cao tỷ lệ sống của cá chẽm. Năm trong số 6 gốc vi khuẩn phân lập từ cá
chẽm lại có hiệu quả khá cao trong việc nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm
tại ngày thứ 30 của giai đoạn sản xuất giống.
vii
ABSTRACT
The thesis “Evaluation of antagonistic ability of N – Hexanoyl
Homoserine Lactone degrading bacteria against Vibrio spp. and its application in
improving survival rate of seabass larvae (Lates calcarifer)” was carried out at
Laboratory of Aquatic Microbiology and National Breeding Center for Southern
Marine Aquaculture – Research Institute for Aquaculture No.2 from September,
2008 to August, 2009. This study was aimed to evaluate ability of isolated
bacteria to degrade HHL, antagonise Vibrio spp. and improve survival rate of sea
bass larvae.
Twenty nine isolates from sea bass (Lates calcarifer) and black tiger
shrimp (Penaeus monodon) were tested to evaluate ability to degrade HHL, for
Vibrio spp. antogonism in vitro, safety and protection of sea bass larvae against
Vibrio spp. infection in in vivo condition within 48 hours, and survival rate
improvability of sea bass larvae in pilot hatchery scale.
Among 29 tested isolates, fifteen were able to degrade HHL at medium to
high level, and/or to antagonise Vibrio spp. These fifteen isolates were tested for
the safety to sea bass larvae. Only nine isolates (six from sea bass and three from
black tiger shrimp) were safe toward sea bass larvae during of 48 hours.
However, these nine isolates did not have ability to protect sea bass larvae in
Vibrio spp. experimental infection.
In pilot scale hatchery condition, three isolates from black tiger shrimp
could not improve survival rate of sea bass larvae. In contrast, five among six
isolates from sea bass showed positive effect on survival of sea bass larvae after
30 day of hatchery.
viii
MỤC LỤC
TRANG
Trang chuẩn y.................................................................................................i
Lý lịch cá nhân ............................................................................................. ii
Lời cam đoan............................................................................................... iii
Lời cảm tạ ....................................................................................................iv
Tóm tắt..........................................................................................................v
Abstract........................................................................................................vi
Mục lục .......................................................................................................vii
Danh sách các chữ viết tắt ...........................................................................xii
Danh sách các hình.................................................................................... xiii
Danh sách các bảng .....................................................................................xv
1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..............................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài........................................................................................2
1.3. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................2
1.4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................3
2. TỔNG QUAN ..........................................................................................4
2.1. Kỹ thuật ương ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer).............................4
2.1.1. Đặc điểm chung của cá chẽm ...............................................................4
2.1.2. Kỹ thuật sản xuất giống cá chẽm..........................................................4
2.1.2.1. Phương pháp thu trứng......................................................................4
2.1.2.2. Nuôi cá bố mẹ...................................................................................5
2.1.2.3. Thu trứng..........................................................................................6
2.1.2.4. Nuôi ấu trùng ....................................................................................6
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm trong điều
kiện ương ..............................................................................................9
2.1.3.1. Nhiệt độ ............................................................................................9
2.1.3.2. Độ mặn .............................................................................................9
ix
2.1.3.3. Độ thông khí .....................................................................................9
2.1.3.4. Cường độ ánh sáng .........................................................................10
2.1.3.5. Mật độ giống...................................................................................10
2.1.3.6. Thức ăn và chế độ cho ăn................................................................10
2.1.3.7. Chất lượng nước .............................................................................11
2.1.3.8. Sự phân cỡ ......................................................................................11
2.1.3.9. Sự ăn thịt đồng loại .........................................................................11
2.1.4. Tác nhân Vibrio gây bệnh trên cá chẽm .............................................12
2.1.4.1. Đặc điểm ........................................................................................12
2.1.4.2. Dấu hiệu bệnh lý .............................................................................13
2.2. Probiotic và ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản ......13
2.2.1. Khái niệm probiotic ...........................................................................13
2.2.2. Các yếu tố cơ bản trong chọn lựa và phát triển probiotic trong nuôi
trồng thủy sản ...................................................................................14
2.2.2.1. Thu thập các thông tin.....................................................................14
2.2.2.2. Phân lập vi sinh vật probiotic giả định ............................................16
2.2.2.3. Sàng lọc và tiền chọn lọc các chủng probiotic giả định ...................16
2.2.2.4. Khả năng gây bệnh của các chủng chọn lọc ....................................18
2.2.2.5. Ảnh hưởng của probiotic lên vật chủ trong điều kiện in vivo ..........18
2.2.2.6. Phát triển các công cụ kiểm tra .......................................................19
2.3. Giới thiệu phân tử quorum sensing ...................................................20
2.3.1. Lịch sử phát hiện quorum sensing ......................................................20
2.3.2. Định nghĩa quorum sensing ...............................................................20
2.3.3. Quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm ................................................22
2.3.4. Quorum sensing ở vi khuẩn Gram dương...........................................25
2.3.5. Ứng dụng của phân tử tín hiệu quorum sensing trong kiểm soát bệnh
trong nuôi trồng thủy sản ..................................................................26
2.3.5.1. Ức chế sự tổng hợp các phân tử tín hiệu..........................................27
2.3.5.2. Ứng dụng chất đối kháng với phân tử tín hiệu quorum sensing .......28
2.3.5.3. Bất hoạt và phân hủy các phân tử tín hiệu bằng enzyme..................29
x
2.3.5.4. Ứng dụng các chất tương đồng kích thích phân tử tín hiệu quorum
sensing ...........................................................................................30
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................31
3.1. Địa điểm và thời gian..........................................................................31
3.2. Vật liệu ................................................................................................31
3.2.1. Vật liệu sử dụng trong thí nghiệm in vitro..........................................31
3.2.1.1. Vật liệu ...........................................................................................31
3.2.1.2. Môi trường......................................................................................31
3.2.1.3. Dụng cụ ..........................................................................................31
3.2.2. Vật liệu sử dụng trong thí nghiệm in vivo...........................................33
3.2.2.1. Ấu trùng cá chẽm............................................................................33
3.2.2.2. Vật liệu ...........................................................................................33
3.2.2.3. Môi trường......................................................................................33
3.2.2.4. Dụng cụ ..........................................................................................33
3.3. Bố trí thí nghiệm .................................................................................34
3.3.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng phân hủy phân tử HHL (N –
Hexanoyl Homoserine Lactone) của các gốc vi khuẩn khảo sát. ........34
3.3.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá đặc tính đối kháng của các gốc vi khuẩn
khảo sát với Vibrio spp. .....................................................................35
3.3.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn khảo
sát đối với ấu trùng cá chẽm..............................................................37
3.3.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với
Vibrio spp. khi có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn khảo sát...........38
3.3.5. Thí nghiệm 5: Đánh giá hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm
của các gốc vi khuẩn khảo sát ...........................................................39
3.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................41
3.4.1. Xây dựng đường tuyến tính chuẩn HHL ............................................41
3.4.2. Phương pháp nuôi vi khuẩn chuẩn bị cho thí nghiệm .........................41
3.4.3. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn..............................................41
3.4.4. Xác định tỷ lệ trứng thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ sống của ấu trùng ........42
xi
3.4.5. Phương pháp xác định tổng vi sinh hiếu khí.......................................42
3.4.6. Phương pháp xác định Vibrio tổng số ................................................42
3.4.7. Phương pháp xác định ammonia (NH3 – N) .......................................42
3.4.8. Phương pháp xác định nitrite (NO2 – N) ............................................43
3.4.9. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................43
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................44
4.1. Đánh giá khả năng phân hủy phân tử HHL (N – Hexanoyl
Homoserine Lactone) của các gốc vi khuẩn khảo sát. .......................44
4.1.1. Xây dựng đường tuyến tính chuẩn .....................................................44
4.1.2. Đánh giá khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn khảo sát......45
4.2. Đánh giá đặc tính đối kháng của các gốc vi khuẩn khảo sát với
Vibrio spp. trong điều kiện in vitro .....................................................52
4.2.1. Đặc tính đối kháng của sinh khối các gốc vi khuẩn đối với
Vibrio spp...........................................................................................52
4.2.2. Đặc tính đối kháng của dịch nổi sau khi ly tâm các gốc vi khuẩn đối
với Vibrio spp....................................................................................54
4.3. Đánh giá mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với
ấu trùng cá chẽm ................................................................................59
4.4. Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio spp. khi
có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn khảo sát. .................................62
4.4.1. Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio spp. khi
có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm. .................63
4.4.2. Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio spp. khi
có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú ....................65
4.5. Đánh giá hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các
gốc vi khuẩn khảo sát trong điều kiện ương ......................................70
4.5.1. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu theo dõi................................................70
4.5.1.1. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trường.........................................70
4.5.1.2. Kết quả theo dõi chỉ tiêu Vibrio tổng số ..........................................71
4.5.2. Kết quả đánh giá tỷ lệ sống và sinh trưởng của ấu trùng cá chẽm.......74
xii
4.5.2.1. Đợt 1 (từ 27/04/2009 đến 10/05/2009) ............................................74
4.5.2.2. Đợt 2 (từ 18/05/2009 đến 16/06/2009) ............................................75
4.5.2.3. Đợt 3 (từ 25/06/2009 đến 24/07/2009) ............................................76
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................81
5.1. Kết luận ...............................................................................................81
5.2. Đề nghị ................................................................................................81
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................83
PHỤ LỤC
xiii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PHB
poly - - hydroxybutyrate
AHL
N - Acyl Homoserine Lactone
3-oxo-C6-HSL
N-(3-oxohexanoyl)-homoserine lactone
BHL
N – Butanoyl – L – Homoserine Lactone
HHL
N – Hexanoyl – L – Homoserine Lactone
ODHL
N – (3 – oxodecanoyl) – L – Homoserine Lactone
OHBHL
N – (3 - hydroxybutanoyl) – L – Homoserine Lactone
AI-2
AutoInducer – 2
HAI – 1
Harveyi Autoinducer – 1
CAI – 1
Cholerae Autoinducer – 1
xiv
DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1: Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ........................................15
Hình 2.2: Cơ chế hoạt động chung của phân tử tín hiệu quorum sensing.....22
Hình 2.3: Cơ chế hoạt động của phân tử tín hiệu quorum sensing ở Vibrio
harveyi ........................................................................................24
Hình 2.4: Phân tử tín hiệu quorum sensing ở vi khuẩn Gram dương............25
Hình 2.5: Một số hướng ứng dụng ức chế quorum sensing ở vi khuẩn gây
bệnh ............................................................................................27
Hình 2.6: Cấu trúc tương tự giữa AHL và furanone ....................................28
Hình 2.7: Hướng phân hủy phân tử AHL ....................................................29
Hình 3.1: Vòng tròn violacein .....................................................................34
Hình 3.2: Thí nghiệm đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các gốc
vi khuẩn khảo sát khi gây nhiễm với Vibrio spp. .........................38
Hình 3.3: Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng
cá chẽm của các gốc vi khuẩn khảo sát ........................................40
Hình 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ HHL và đường kính
vòng tròn sắc tố violacein ............................................................45
Hình 4.2: Mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá
chẽm ở mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml .............................................48
Hình 4.3: Kết quả phân hủy HHL theo thời gian của gốc Ch102 .................49
Hình 4.4: Mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm
sú ở mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml ..................................................49
Hình 4.5: Mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá
chẽm ở mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml .............................................50
Hình 4.6: Mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm
sú ở mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml ..................................................51
Hình 4.7: Vòng tròn kháng khuẩn Vibrio spp. của một số gốc vi khuẩn ......54
xv
Hình 4.8: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm sau khi bổ sung các gốc vi
khuẩn phân lập từ cá chẽm tại thời điểm 48 giờ ...........................60
Hình 4.9: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm sau khi bổ sung các gốc vi
khuẩn phân lập từ tôm sú tại thời điểm 48 giờ .............................61
Hình 4.10: Tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với V. parahaemolyticus
khi có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm tại
các thời điểm khảo sát .................................................................63
Hình 4.11: Tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với V. parahaemolyticus
khi có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú tại
các thời điểm khảo sát .................................................................64
Hình 4.12: Tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với V. alginolyticus khi
có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm tại
các thời điểm khảo sát .................................................................66
Hình 4.13: Tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với V. alginolyticus khi
có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú tại
các thời điểm khảo sát .................................................................67
Hình 4.14: Mật độ Vibrio tổng số theo thời gian khảo sát (đợt 1) ................71
Hình 4.15: Mật độ Vibrio tổng số theo thời gian khảo sát (đợt 2) ................72
Hình 4.16: Mật độ Vibrio tổng số theo thời gian khảo sát (đợt 3) ................73
Hình 4.17: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 14 ngày của các
nghiệm thức.................................................................................74
Hình 4.18: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 30 ngày của các
nghiệm thức.................................................................................75
Hình 4.19: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 30 ngày của các
nghiệm thức.................................................................................77
xvi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1: Các giai đoạn phát triển của ấu trùng ............................................7
Bảng 2.2: Mật độ cá chẽm chuẩn theo tuổi ....................................................8
Bảng 2.3: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm từ ngày thứ 1 – 30 ở các độ mặn
khác nhau ......................................................................................9
Bảng 2.4: Mật độ giống và tỷ lệ giống của ấu trùng cá chẽm ở các độ tuồi
khác nhau ....................................................................................10
Bảng 2.5: Một số phân tử tín hiệu của các vi khuẩn gây bệnh .....................21
Bảng 3.1: Các gốc vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm ................................32
Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm................................................................39
Bảng 4.1: Kết quả tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn
violacein (cm) .............................................................................44
Bảng 4.2: Mức độ phân hủy HHL theo thời gian của các gốc vi khuẩn
phân lập từ cá chẽm tại thời điểm 12 giờ .....................................46
Bảng 4.3: Mức độ phân hủy HHL theo thời gian của các gốc vi khuẩn
phân lập từ tôm sú tại thời điểm 12 giờ........................................47
Bảng 4.4: Mức độ đối kháng của sinh khối các gốc vi khuẩn khảo sát đối
với Vibrio spp.............................................................................53
Bảng 4.5: Mức độ đối kháng của dịch sau khi ly tâm các gốc vi khuẩn
khảo sát đối với Vibrio spp. .........................................................54
Bảng 4.6: Kết quả tổng hợp của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm .......56
Bảng 4.7: Kết quả tổng hợp của các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú..........57
Bảng 4.8: Kết quả tổng hợp đánh giá các đặc tính có lợi của các gốc vi
khuẩn khảo sát ở điều kiện in vivo ...............................................69
xvii
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.
Đặt vấn đề
Trong hơn 30 năm trở lại đây, ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang
trên đà phát triển rất mạnh với sản lượng không chỉ đáp ứng cho nhu cầu trong
nước mà còn xuất khẩu ra các nước trên toàn thế giới. Chính vì thế, nhu cầu về
nguồn giống sạch bệnh và đạt chất lượng để cung cấp cho các trang trại nuôi
trồng thủy sản rất lớn. Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất giống, bệnh do vi sinh
vật gây ra đang là một vấn đề quan trọng, gây chết ấu trùng hàng loạt, dẫn đến sự
tổn thất nghiêm trọng của các trại sản xuất. Bệnh do vi khuẩn gây ra trên ấu trùng
cá chẽm (Lates calcarifer) đã làm ảnh hưởng đến khả năng cung cấp nguồn
giống đạt chất lượng cho các trang trại và trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất thủy
hải sản.
Trước thực tế đó, để có thể tồn tại và đáp ứng được nhu cầu cấp thiết về
nguồn giống, các trang trại sản xuất giống đã sử dụng một số biện pháp để phòng
và trị các bệnh do vi sinh vật như sử dụng kháng sinh, hóa chất. Chính vì việc sử
dụng kháng sinh, hóa chất tràn lan như hiện nay đã dẫn đến tình trạng dư lượng
kháng sinh trong sản phẩm đầu ra. Bên cạnh đó, vi khuẩn kháng kháng sinh hình
thành ảnh hưởng lớn đến hiệu quả sử dụng kháng sinh về sau này.
Đứng trước thực trạng đó, các giải pháp sinh học đã được các nhà khoa
học nghiên cứu và ứng dụng để kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Một trong những hướng nghiên cứu nhiều triển vọng nhất là sử dụng các chế
phẩm probiotic để phòng các bệnh do vi sinh vật. Ở Việt Nam, probiotic đã được
sử dụng rộng rãi trong thời gian gần đây nhưng nguồn cung cấp probiotic do các
công ty sản xuất thường không rõ nguồn gốc xuất xứ. Do đó, việc nghiên cứu và
sản xuất các chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam đã được tiến hành trong thời
gian gần đây và bước đầu đã thu được những kết quả đáng kể.
1
Hiện nay, cá chẽm (L. calcarifer) là đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế
cao ở Việt Nam. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm trong sản xuất giống
của đối tượng này không cao, không ổn định và bị ảnh hưởng lớn bởi các tác
nhân gây bệnh (chủ yếu là nhóm Vibrio). Việc sử dụng kháng sinh không mang
lại hiệu quả cao trong phòng bệnh do vi sinh vật mà lại làm tăng khả năng kháng
thuốc. Trong thời gian gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện
một số vi khuẩn có khả năng ức chế các phân tử tín hiệu “quorum sensing”. Các
phân tử tín hiệu này do vi khuẩn gây bệnh tiết ra dùng trong quá trình giao tiếp
và có liên quan đến độc lực của chúng. Vì vậy, việc phân lập các gốc vi khuẩn có
các đặc tính nói trên và sử dụng trong quá trình nuôi trồng thủy sản, đặc biệt
trong công tác sản xuất giống sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát các
vi khuẩn gây bệnh và nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá biển.
Với tầm quan trọng và tính ứng dụng thực tiễn, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài “Đánh giá tính đối kháng vi khuẩn Vibrio spp. và nghiên cứu
nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer) của các chủng vi
khuẩn phân hủy N – Hexanoyl Homoserine Lactone”. Đề tài được thực hiện
tại Phòng Vi Sinh Nước và tại Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ thuộc
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
1.2.
-
Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu các đặc tính đối kháng của các gốc vi khuẩn đã phân lập đối
với tác nhân gây bệnh Vibrio spp. trên ấu trùng cá chẽm.
-
Thử nghiệm hiệu quả của các gốc vi khuẩn này đối với tỷ lệ sống và khả
năng tăng trưởng của ấu trùng cá chẽm.
1.3.
Tính cấp thiết của đề tài
Việc sử dụng các chủng vi khuẩn có lợi trong nuôi trồng và trong sản xuất
giống và nuôi trồng thủy sản nhằm thay thế việc sử dụng kháng sinh và hóa chất
đang được áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên, đa số các chế phẩm vi sinh trong nước
đều có nguồn gốc ngoại nhập và không rõ thành phần, chủng loại và những tác
động của các chế phẩm vi sinh này không kiểm soát được. Bên cạnh đó, việc sản
xuất các chế phẩm vi sinh ở Việt Nam vẫn còn hạn chế. Do đó, việc phân lập và
2
sản xuất các chủng vi sinh từ các trại sản xuất giống là điều rất cần thiết. Một
trong những hướng tiếp cận mới của thế giới hiện nay là phân lập các vi khuẩn có
khả năng phân hủy phân tử “quorum sensing” của các vi khuẩn gây bệnh. Đây là
một phương pháp khả thi và bền vững vì các vi khuẩn có lợi chỉ ức chế độc lực
chứ không ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh, từ đó không gây ra sự
mất cân bằng trong hệ vi sinh và không gây nên hiện tượng đề kháng của vi sinh
vật gây bệnh.
1.4.
-
Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu các nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu
quorum sensing ở vi khuẩn V. harveyi, V. parahaemolyticus và V. alginolyticus
gây bệnh trên cá chẽm (Lates calcarifer) và có hoạt tính đối kháng với Vibrio
spp.
-
Các thử nghiệm hiệu quả của các gốc vi khuẩn này chỉ được thực hiện trên
ấu trùng cá chẽm.
3
Chương 2
TỔNG QUAN
2.1.
Kỹ thuật sản xuất giống cá chẽm (Lates calcarifer)
2.1.1. Đặc điểm chung của cá chẽm
Cá chẽm (Lates calcarifer) còn được gọi là cá vược là một trong những
loài cá có giá trị kinh tế cao ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc vùng Tây
Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương. Loài cá này có một số đặc điểm như sau:
-
Cá chẽm là loài cá nước lợ có thể thích nghi được sự thay đổi từ nước
ngọt sang nước mặn và sống được trong nước mặn lên đến 35 ‰. Do đó, đây là
loài cá thích hợp nuôi ở các cửa biển, cửa sông, những nơi có độ mặn không ổn
định.
-
Cá chẽm có thể ăn và tăng trưởng tốt trong nguồn nước có sự thiếu ổn
định về độ mặn.
-
Cá chẽm là loại cá có tốc độ tăng trưởng nhanh, đạt được kích cỡ thương
phẩm trong khoảng thời gian 1 năm hoặc ít hơn 1 năm khi nuôi trong điều kiện
thích hợp.
-
Cá chẽm là loài cá khỏe mạnh nên chịu được những tác động mạnh của
con người.
-
Cá chẽm có thể tăng trưởng tốt ở mật độ cao khi nuôi cá lồng.
-
Cá chẽm có cơ thịt màu trắng, vị ngon và được nhiều người chấp nhận nên
có giá thành cao (NICA, 1986).
2.1.2. Kỹ thuật sản xuất giống cá chẽm
2.1.2.1.
Phương pháp thu trứng
Trứng cá chẽm thụ tinh được thu bằng phương pháp tiêm hormone và thu
toàn bộ trứng như thu trứng tự nhiên trong ao.
Sử dụng hormone hiện diện ở màng đệm và dịch chiết của tuyến yên cá
chẽm là phương pháp hiệu quả để nâng cao sự trưởng thành tuyến sinh dục và
4
kích thích sự đẻ trứng của cá. Tuy nhiên, cá thường bị tổn thương hoặc bị stress
khi xử lý bằng phương pháp này.
Nếu có cá chẽm đực và cái trưởng thành, nên sử dụng phương pháp thu
trứng. Trứng được thu vào những bể nhỏ và tinh dịch của cá được trộn chung với
chúng và không cần bổ sung thêm nước biển (phương pháp khô). Sau khi thụ
tinh, trứng được rửa với nước biển và cho vào trong các bể ương. Phương pháp
này rất kinh tế vì không cần nhiều bể cá bố mẹ. Số lượng và chất lượng trứng thu
được từ phương pháp này thỉnh thoảng thấp. Phương pháp này chỉ được sử dụng
với quy mô trang trại vừa và nhỏ.
Phương pháp đẻ trứng tự nhiên trong bể là phương pháp tốt nhất để thu
được trứng đã thụ tinh. Với phương pháp này, cá sẽ sản xuất ra số lượng trứng
lớn nhất với chất lượng cao nhất trong thời gian dài (NICA, 1986).
2.1.2.2.
Nuôi cá bố mẹ
a. Thu cá bố mẹ
Cá bố mẹ được chọn từ cá được nuôi trong lồng với thiết kế như ở biển.
Những con cá này được thu từ 4 nguồn:
-
Nuôi từ cá ở giai đoạn juvenile trong lồng
-
Sử dụng những con cá bố mẹ của mùa sinh sản trước
-
Mua lại từ những người đánh bắt cá
-
Mua lại từ những người nuôi cá.
b. Chọn lựa cá bố mẹ
Việc chọn lựa cá bố mẹ được thực hiện từ 2 – 4 tuần trước khi bắt đầu
mùa sinh sản. Chọn lựa những con cá đực và cá cái có trọng lượng từ 3,5 – 6 kg
c. Nuôi cá bố mẹ
Cá bố mẹ được di chuyển vào các bể nuôi. Mật độ nuôi từ 1,6 – 3,3
con/10 m3 nước biển. Tỷ lệ giới tính trong mỗi bể nuôi là 1:1.
Cá được cho ăn mỗi ngày một lần vào buổi sáng với cá vụn tươi và sạch
được chặt nhỏ. Khối lượng thức ăn cho cá là khoảng 1 – 2 % trọng lượng cơ thể
mỗi ngày.
5
Nước trong bể nuôi phải để tuần hoàn tối thiểu 8 giờ vào ban ngày và giữ
ổn định vào ban đêm. Nước phải được sục khí suốt ngày. Thức ăn thừa, phân cá
phải được loại bỏ bằng cách siphone hằng ngày (NICA, 1986).
2.1.2.3.
Thu trứng
Quá trình đẻ trứng của cá chẽm diễn ra vào ban đêm từ 8 giờ đến 9 giờ
khoảng 3 – 5 ngày liên tiếp bắt đầu từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 sau khi trăng
tròn. Khi đến thời điểm đẻ trứng, cá đực đuổi theo cá cái một cách mạnh mẽ. Sự
đẻ trứng và thụ tinh của trứng xảy ra khi cá đực và cá cái làm bắn nước một cách
mãnh liệt trên bề mặt.
Trứng cá chẽm đã thụ tinh trôi theo dòng nước. Chúng có đường kính từ
0,74 mm – 0,80 mm với một giọt dầu nhỏ có đường kính 0,23 – 0,26 mm. Một cá
cái đẻ khoảng 0,5 – 1 triệu trứng cho mỗi lần sinh sản. Có thể thu được 5 triệu
trứng được thụ tinh từ 12 cặp cá bố mẹ được nuôi trong bể có thể tích 150 m3
trong mỗi lần sinh sản. Con cái đẻ lặp lại sau ngày trăng tròn của mỗi tháng trong
mùa sinh sản.
Những trứng nổi, trứng được thụ tinh được thu vào buổi sáng sau quá
trình thụ tinh với một vợt tốt. Trứng rửa để loại bỏ các vi tảo, vật lạ và chuyển
vào trong bể ương (NICA, 1986).
2.1.2.4.
Nuôi ấu trùng
Trứng cá chẽm nở ra sau 12 – 14 giờ sau khi đẻ ở nhiệt độ trong nước từ
30 – 320C. Sự phát triển của ấu trùng cá chẽm được tóm tắt ở bảng 2.1. Nước
trong bể nên được sục khí từ phía dưới lên. Trứng nở từ từ trong quá trình ấp.
Sau khi trứng nở, ngừng sục khí cho đến khi những trứng không nở và những
chất dơ bẩn lắng xuống đáy và tiến hành siphone chúng ra ngoài trong khi đó
những trứng nở thành cá bột bơi trên bề mặt.
6
Bảng 2.1: Các giai đoạn phát triển của ấu trùng (NICA, 1986)
Tuổi
Tổng chiều
(ngày)
dài (mm)
0
1,6 + 0,4
Đặc điểm
Những ấu trùng mới nở nổi trên mặt
nước. Có thể nhìn thấy những thể sắc tố
trong mắt, cơ thể và trên những hạt dầu.
1
2,20 + 0,08
Phần lớn noãn hoàn bị hấp thu nhưng
miệng vẫn chưa mở được. Các ấu trùng
phân bố giống nhau trong các bể ương.
2
2,52 + 0,06
Noãn hoàn bị hấp thu gần hết. Miệng cá
đã mở. Ấu trùng tụ tập lại nơi có sục khí
hoặc có ánh sáng trực tiếp. Vẫn còn có sự
hiện diện của các hạt dầu.
7
3,44 + 0,09
Vây lưng và vây hậu môn xuất hiện. Các
khía răng cưa đã xuất hiện trong mang.
Những thể màu đen hiện rõ từ miệng đến
phần đuôi làm cá bột có màu đen.
14
4,75 + 0,32
Vây lưng và vây hậu môn phân tách rất
rõ với vây đuôi và vây bụng đã bước đầu
xuất hiện. Khung xương tim bắt đầu hình
thành. Sự phân bố của các thể màu đen
mở rộng lên đến bụng và cũng hiện diện
ở cả vây lưng và vây hậu môn.
Một đường trắng có thể được phân biệt từ
trung tâm vây lưng đến vây hậu môn
bằng mắt thường.
21
8,91 + 1,19
Số lượng xương sống và tai mềm của vây
lưng và vây bụng bắt đầu ổn định. Những
vảy xuất hiện trên bề mặt giữa bên trên
vây hậu môn. Màu sắc cơ thể cá chuyển
từ màu đen sang màu nâu xám.
7
Minh họa
