Độ nhạy với bệnh loét của cây có múi gây ra bởi vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri phụ thuộc vào bộ gen trong nhân của cây chủ

Độ nhạy với bệnh loét của cây có múi gây ra bởi vi
khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri phụ thuộc
vào bộ gen trong nhân của cây chủ.
1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.1. vật liệu
* Nguyên liệu thực vật
- Cây lai tạo thuộc loài cây có múi đã được tạo thành bởi sự kết hợp
giữa tế bào trần có nguồn gốc từ phôi tâm của cây cam MARC unshiu
cv. Juman và 1 tế bào thịt lá của cây cam C. sinensis Osbeck cv.
Washington navel orange (Yamamoto và Kobayashi 1995).
- Hình thái lá của cây lai tạo tương tự như của cây C. sinensis. Đặc
điểm hoa của cây lai tạo hầu như giống hệt với cây C. sinensis trừ số
nhị hoa (Yamamoto et al 2001).
- Cây lai tạo bao gồm bộ gen nhân của cây C. sinensis và bộ gen tế bào
chất của cây C. unshiu. Các chồi giống của cây lai tạo và cây bố mẹ
của nó sử dụng cho tiêm truyền thử nghiệm sẽ được ghép vào trong
chậu có gốc ghép 2 năm tuổi của cây cam ba lá Poncirus trifoliata
Raf.
- Bệnh cây được đánh giá trong ba cây được trồng từ 8 năm trước trong
vườn cây ăn quả tại Citrus Kuchinotsu thuộc Trạm nghiên cứu.
* Dòng vi khuẩn
- Chủng vi khuẩn KC21 - Xanthomonas axonopodis pv. citri đột biến
phát sinh tạo thành KC21T14 (gen sinh bệnh pthA-KC21 đã bị gián
đoạn bởi chèn thêm đoạn Tn5) (Shiotani et al, 2007).
- Các vi khuẩn được nuôi cấy ở 27oC trong môi trường men (YP)
peptone, 1,5% agar, có bổ sung kháng sinh kanamycin với nồng độ 50
µg/1ml (KC21T14 kháng kháng sinh).
1


- Gen pthA KC21 được gửi vào GenBank với số đăng nhập là

AB206388.
1.2. Phương pháp
* Tiêm truyền thử nghiệm
- Độ nhạy của cây lai tạo và cây bố mẹ với X. axonopodis pv. citri được
đánh giá sau khi tiêm truyền chủng vi khuẩn này vào lá (Shiotani et
al.2000).
- Vi khuẩn bị đình chỉ hoạt động trong 0,85% NaCl ở nồng độ 108 tế
bào / ml, nhưng ít bị đình chỉ trên lá của cây trưởng thành.
- Đưa các vi khuẩn bị đình chỉ hoạt động vào lá bằng vòi chích của côn
trùng (đường kính 0,5 mm).
- Sau đó, đem các cây đã tiêm vi khuẩn trồng trong nhà kính.
- Đo đường kính của vòng tròn tổn thương trên lá, bao gồm cả mô bần
và phần mép xung quanh sũng nước.
- Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trong các tổn thương trên lá ở 0, 1,
2, 3, 4, 8, 16, và 32 ngày.
- Sau đó, loại bỏ các tổn thương. Đem ngâm mô cắt trong môi trường
XCSM bán chọn lọc (Shiotani et al.2000) có NaCl 0,85%, vi khuẩn sẽ
bị đình chỉ hoạt động.
* Quá trình phát triển bệnh
- Quá trình phát triển của bệnh được điều tra trong Tháng 7 năm 2003
trên 20 chồi non ở mỗi cây được lựa chọn theo thứ tự từ mức độ tổn
thương nhiều đến ít, với chỉ số sau: 0 : không có tổn thương; 1 : 1-3
tổn thương, 3: 4-10 tổn thương, 5: 11-20 tổn thương; 7: hơn 20 tổn
thương.
- Mức độ nghiêm trọng của bệnh (DS) được tính toán từ tổng các chỉ số
(SI) như sau:
DS= SI / (20 x 7) x 100

2

2. Kết quả và thảo luận
Độ nhạy với bệnh loét của cây có múi phụ thuộc vào bộ gen nhân của
cây chủ. Độ nhạy của cây lai tạo và cây bố mẹ được đánh giá sau khi tiêm vi
khuẩn KC21 vào lá của chúng. Vết tổn thương lan ra trên tất cả các cây trong
vòng 4 ngày sau khi tiêm. Sau đó, mủ sinh ra từ các tổn thương (cây C.
unshiu xuất hiện ít mủ hơn so với cây lai tạo và cây C. Sinensis).

Hình 1: Triệu chứng loét trên bề mặt lá của cây Citrus sinensis, C. unshiu,
và cây lai tạo. Các triệu chứng phát triển 40 ngày sau khi tiêm vi khuẩn
KC21 bị đột biến không hoàn toàn (KC21T14) chứa gen sinh bệnh pthAKC21.

3


Bảng 1: Mức độ nghiêm trọng của bệnh loét trên loài cây có múi và cây lai tạo.

Trong tất cả các cây thử nghiệm, mật độ cư trú của vi khuẩn KC21
tăng đều trong 4 ngày đầu tiên sau khi tiêm khoảng 3.4 x 105 CFU mỗi
thương tổn (Hình 2 a). Sau 4 ngày, tỷ lệ vi khuẩn được nhân lên ở cây C.
unshiu khác so với ở cây lai tạo và cây C. sinensis. Sau 16 ngày, số lượng vi
khuẩn trên cây C. unshiu giảm, nhưng ở cây lai tạo và cây C. sinensis thì
không giảm. Số lượng vi khuẩn quan sát được giữa cây lai tạo và cây C.
sinensis là giống nhau trong suốt thí nghiệm.
Những kết quả này cho thấy độ nhạy với bệnh loét trong mô lá của cây
lai tạo tương đương với cây C.sinensis, có thể phụ thuộc vào bộ gen trong
nhân của loài. Mức độ nghiêm trọng của bệnh trên các cây lai tạo cũng tương
tự như trên cây C. sinensis. Giống cây có múi và các loài cây có kích thước
lớn phát triển mạnh, thời gian sống của lá ngắn dễ bị loét hơn là giống cây
trồng phát triển chậm và những cây có lá trưởng thành nhanh (Gottwald et

al. 1993).
Tế bào chất có thể có khả năng kháng bệnh (Mazouz et 2002 al;
Ohtani et al 2002), tuy nhiên, mức độ đề kháng đối với bệnh loét của cây
C.unshiu có thể là độc lập với bộ gen tế bào chất của nó.

4


Có sự khác nhau giữa tỷ lệ tăng tổn thương trên lá của cây lai tạo và
cây C. Sinensis (Bảng 2).
Quan sát này cho thấy sự khác biệt này không phụ thuộc vào bộ gen
nhân của chúng mà phụ thuộc bộ gen tế bào chất. Tuy nhiên, sự khác biệt
này không có nghĩa là độ nhạy với bệnh loét của các cây này là khác nhau;
bởi vì vi khuẩn tăng trưởng trên hai cây này là tương tự nhau trong 32 ngày
sau khi tiêm (Hình 2).

Hình 2: Thời gian phát triển của vi khuẩn trong lá của cây có múi. Lá của
các cây Citrus sinensis, C. unshiu, và cây lai đã được tiêm chủng hoang dại
KC21 (a) và chủng bị đột biến KC21T14 (b), trong đó gen gây bệnh pthAKC21 đã bị gián đoạn do chèn đoạn Tn5. Lấy những mẫu lá để 32 ngày sau
khi tiêm.
5


Bảng 2: Đường kính các tổn thương trên lá của các cây thí nghiệm sau khi
tiêm một trong hai chủng hoang dại KC21 và chủng đột biến KC21T14.

Khả năng gây bệnh của gen PthA không liên quan đến sự khác biệt về
độ nhạy giữa cây C. unshiu và cây C. Sinensis.
Gen sinh bệnh - pthA gây bệnh loét trên cây có múi, tạo khả năng làm
vỡ lớp biểu bì và gây ra các vết loét trên cây có múi. Vì vậy, PthA có thể liên

quan đến sự khác biệt trong sự phát triển mủ giữa cây C. sinensis và C.
unshiu, bộ gen nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy với bệnh loét trên
cây có múi.
Để xác định sự tham gia của gen pthA trong quá trình phát triển mủ
giữa cây C. sinensis và C. unshiu là khác nhau, chúng tôi tạo ra một gen
KC21T14 đột biến, có nguồn gốc từ một chủng KC21 thuộc loài X. axonopodis pv. citri, trong đó gen sinh bệnh pthA-KC21 bị gián đoạn do chèn
thêm đoạn Tn5, được sử dụng để chích vào lá của cây C. unshiu và cây C.
sinensis. Quan sát trong suốt thí nghiệm cho thấy chủng KC21T14 tạo ra vết
thối tổn thương trên lá, nhưng không có mụn mủ. Ngoài ra, sau 8 ngày tiêm
chủng KC21T14, số lượng vi khuẩn phát triển trong vết thương tổn trên cả
hai loài Citrus ít hơn đáng kể so với khi tiêm chủng hoang dại KC21 (Hình
2b).

6


Vết tổn thương trên các cây trong thí nghiệm lan rộng ở các mức độ
khác nhau sau khi tiêm chủng hoang dại KC21, ở chủng KC21T14 chứa gen
pthA-KC21 gây ra tổn thương nhỏ hơn và có kích thước tương đương trên
các cây (Bảng 2). Điều này cho thấy rằng gen pthA-KC21 có thể liên quan
tới sự lan rộng vết thương tổn.
Những kết quả này chỉ ra rằng gen sinh bệnh pthA-KC21 ở vi khuẩn
KC21T14 không liên quan tới sự khác biệt về độ nhạy với vi khuẩn giữa các
loài Citrus, mặc dù gen này góp phần tạo ra các triệu chứng loét (Brunings
và Gabriel 2003).
Ngoài ra, sau khi tiêm KC21T14, ở cây lai tạo và cây C. sinensis có sự
lan rộng tổn thương lớn giống nhau; nhưng ở cây C. Unshiu thì tổn thương ít
hơn. Những kết quả này cho thấy bộ gen nhân của cây C. sinensis có độ nhạy
lớn đối với vi khuẩn X. axonopodis pv. citri.
3. Ý nghĩa

Từ kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, độ nhạy đối với bệnh loét của
cây có múi phụ thuộc vào bộ gen nhân của cây chủ; từ đó, có thể đưa ra các
hướng nghiên cứu trên bộ gen nhân của cây chủ để tìm ra cách phòng và trị
bệnh tốt nhất cho các loài cây có múi.
* Những nghiên cứu, ứng dụng ở Việt Nam:
Ở Việt Nam, các loài cây có múi thường xuất hiện bệnh loét làm ảnh
hưởng nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất trái. Bệnh xuất hiện trên
cành, lá non và trái, dễ thấy nhất là trên lá và trái. Bệnh loét thể hiện trên cả
hai mặt lá và gây hại ở vỏ trái làm giảm giá trị thương phẩm, phần thịt của
múi trái có thể bị chai, trong điều kiện ẩm độ cao trái bệnh bị nứt chảy nhựa
cuối cùng trái vàng và rụng đi. Cành non cũng thường bị nhiễm nặng, các
đốm sần sùi đóng dày đặc làm khô chết cành.

7


Hiện nay, ở nước ta chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh loét trên cây có
múi do vi khuẩn X. axonopodis pv. Citri gây ra. Các nghiên cứu về bệnh loét
chủ yếu tập trung vào việc phòng trừ khả năng gây bệnh và hướng điều trị
khi mắc bệnh bằng cách phun các loại thuốc như Kasumin, Starner,
Physan…

8