Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro
GVHD: TS. Nguyễn Thị Lâm Hải
SVTH: Nhóm 6

1


Nhóm sinh viên thực hiện:
Họ và tên

Mã sinh viên

Nguyễn Thị Huế

560928

Lê Thị Huyền

560931

Lưu Thị Hương

560935

Ngô Thị Hương

560936

Trương Thị Hương

560942

Vũ Thị Hương

560943

Vũ Thúy Hường

560945

Trần Hữu Khá

560946

2


NỘI DUNG
Cây đơn bội và ứng dụng
Nguyên lý tạo cây đơn bội
Phương pháp tạo cây đơn bội
Thành tựu và hiện trạng
Kết luận chung
3


1. Khái niệm cây đơn bội
Cây đơn bội thường là những cá thểể

củ
ểa những loài nhị bội hay đa bội khác
ngủồồ
n mà trong tểế bào soma củ
ểa chúng
sồế lượng nhiểễ
m sắế
c thểể bằng nưể
a sồế
lượng NST củ
ểa loài khơ
ể i đầồ
ủ, trong mồễ
i
cặp NST tương đồồ
ng nó chỉ
ể có một NST.

4


Datura stramonium

5


Datura inoxia

6

7


Ứng dụng
1

Nghiên cứu
di truyền về
mối tương
tác của các
gen.

3
2

Tạo đột biến ở
mức độ đơn
bội.

Tạo dòng đồng
hợp tử tuyệt
đối, phục vụ
cho công tác
chọn tạo giống
cây trồng.

8

Sơ đồ các hướng ứng dụng của cây đơn bội

9


Nguyên lí tạo cây đơn bội
Dựa trên cơ sở của sự sinh
sản
đơn
tính
đực
(androgensis), người ta nuôi
cấy các hạt phấn đơn nhân
(tiểu bào tử) tách rời hay
các bao phấn có chứa các
hạt phấn đơn nhân trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo
phù hợp để kích thích hạt
phấn phát triển thành cây
đơn bội.

Phương pháp trinh sinh đực trong
ống nghiệm(invitro androgenesis)
10


Nguyên lí tạo cây đơn bội
Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn
tính cái, người ta kích thích tế bào
trứng hay các tế bào cực, tế bào đối

cực, tế bào kèm trong noãn phát
triển và tái sinh tạo thể đơn bội.

Phương pháp trinh sinh cái trong
ống nghiệm (invitro gynogenesis)
11


Các phương pháp tạo cây đơn bội invitro

Trinh sinh đực
(Invitro androgenosis)
Các phương
pháp
Trinh sinh cái
(Invitro gynogensis)

Nuôi cấy
bao phấn
Nuôi cấy
hạt phấn
Nuôi cấy noãn
chưa thụ tinh

12


Phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt
phấn
Nuôi cấy bao phấn trên môi trường đặc: callus

và cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn.
Nuôi cấy bao phấn trên môi trường lỏng và lắc:
hạt phấn giải phóng vào môi trường, callus và
cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.
Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi trường
lỏng và lắc đều hoặc môi trường bán lỏng:
callus và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.

13


Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn in vitro
Khử trùng bề mặt

Tách các bao phấn

Hoa

Loại bỏ chỉ nhị
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn

Nuôi cấy trên
mt bán rắn(có agar)
Phát triển phôi
Cây đơn bội

Nuôi cấy trên
mt lỏng

14


Nuôi cấy bao phấn
1.Chọn bao phấn: chọn bao phấn chứa
hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào nguyên
nhiễm lần I. Bao phấn của những hoa đầu
tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.

2.Xử lí nụ hoa: xử lí lạnh sẽ kích thích
nhân dinh dưỡng phân chia. Chế độ xử lí
nhiệt độ phụ thuộc vào loại cây.

3.Chọn môi trường nuôi cấy thích
hợp: tùy theo đối tượng nuôi cấy khác
nhau mà chọn môi trường tương ứng.

15


4. Chọn lọc cây đơn bội.
Có thể xác định cây đơn bội bằng
phương pháp:
Kiểm tra số lượng NST của tế bào
Đo hàm lượng DNA trong tế bào
So sánh cây tái sinh từ bao phấn với
cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình
thái, kích thước…

16

5. Lưỡng bội hoá
Các cây đơn bội thu được sau nuôi cấy
bao phấn, để có thể sử dụng được trong
chọn giống thì cần lưỡng bội hoá tạo cây
lưỡng bội. Có 2 cách:
Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô:
thường sử dụng mô lá của cây đơn bội.
Cảm ứng nhị bội hóa bằng cochicine: sử
dụng ở nồng độ 0.05-0.5% tùy theo từng
loại thực vật và đối tượng mô cần xử lí.

17


Nuôi cấy hạt phấn
Năm 1934, Stow phát hiện
cấu trúc giống túi phôi của
hạt phấn ở một số loài thực
vật thuộc Hyacinthus.

18


Kĩ thuật tách rời hạt phấn
 Các bao phấn vô trùng được nghiền hoặc ép trong môi trường
lỏng để giải phóng hạt phấn ra ngoài bao phấn. Tách hạt phấn ra
khỏi bã túi phấn bằng cách rót dung dịch trên qua lưới lọc có
kích thước phù hợp.

 Dung dịch sau lọc được li tâm 8001000rpm trong 3-5 phút để tách và
làm sạch hạt phấn. Thành phần nhẹ
nổi trên được gạn đi trong khi hạt
phấn lắng dưới đáy được rửa sạch
bằng môi trường mới và được li
tâm thêm 2 lần nữa để loại bỏ các
chất ức chế trong túi phấn.
 Tạo huyền phù hạt phấnvới mật độ
104 -105 tế bào/ml.

19


Một số chú ý khi nuôi cấy hạt phấn
• Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh
phôi trực tiếp
• Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng
phương pháp nuôi trợ dưỡng: nuôi kèm với bao
phấn hay loại mô khác của cây mẹ.
• Môi trường nuôi cấy hạt phấn cần bổ sung các
axit amin (glutamin, serin…) với nồng độ cao và
có trường hợp không cần bổ sung chất điều tiết
sinh trưởng (thuốc lá, cải dầu…)
20


Ưu điểm

 Nuôi cấy bao phấn
 Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao

tác dễ dàng.
 Môi trường nuôi cấy đơn giản.
 Nuôi cấy hat phấn
 Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.
 Giống tạo ra co phẩm chất di truyền
đồng đều.
 Phát sinh phôi dễ dàng trong quá
trình nuôi cấy.
 Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc
nghiên cứu di truyền.

Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm rút ngắn
thời gian, đồng thời giúp tăng vọt số lượng cá thể đơn bội
21
thu được.


Nhược điểm

 Nuôi cấy bao phấn :
 Khó sàng lọc cây đơn bội.
 Khi nuôi cấy bao phấn
thường gặp hiện tượng
bạch tạng.
 Nuôi cấy hạt phấn :
 Khó thao tác do hạt phấn
có kích thước nhỏ.
 Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất
tạo cây đơn bội không cao.
 Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy

nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây.
Kĩ thuật nuôi cấy bao phấn , hạt phấn tạo cây đơn bội phức
tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của
bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm...

22


Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn, hạt
phấn in vitro
 Tuổi hạt phấn
Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt
phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4
nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên.
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn
 Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái
sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn.
 Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu
được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong
những lần trổ hoa tiếp theo.
 Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường
độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao
hơn.
23


 Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn
 Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến
hành xử lý mẫu trước khi cấy.
 Xử lý nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và

cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu
hơn.
 Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh
sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo
phôi cao hơn.
 Mật độ bao phấn, hạt phấn
 Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối
bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường
và thay đổi tùy theo loài thực vật.

24


Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh


Những năm 70, các nhà
nghiên cứu đã tập trung
giải quyết vấn đề cây đơn
bội bằng nuôi cấy noãn
chưa thụ tinh và thu
được một số thành tựu
trên các đối tượng hành,
hướng dương, củ cải
đường, ngô..
25