Tiểu luận Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm phục tráng cây trồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
Chủ đề: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm
phục tráng cây trồng

Giảng viên giảng dạy:PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh
Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Trang
Lớp: K55CNSHA
MSV: 550411

Hà Nội, tháng 11 năm 2012
1


I. Đặt vấn đề.
Bệnh virus trên cây là một bệnh hại phổ biến trên cây trồng (chỉ sau nấm) gây thiệt hại
lớn và nghiêm trọng đối với người nông dân nhất là trong điều kiện hiện nay khi mà các bệnh
mới do virus xuất hiện càng nhiều và có nguy cơ ảnh hưởng đến an ninh lương thực trong nước
cũng như trên tồn cầu. Bệnh cây do virus thường khơng phát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức
độ lây lan cao. Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng bị chết
nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thối hóa, giảm sức sống, dần tàn lụi.
Một câu hỏi đặt ra là làm thế nào để phục tráng các giống đã bị nhiễm virus, tạo ra các
cây giống sạch bệnh virus cho trồng trọt?
Trên thực tế nền nông nghiệp của con người đã chung sống với bệnh virus trong suốt lịch
sử phát triển của nó. Con người đã biết sử dụng các cây, củ giống sạch virus bằng cách chọn lọc
những cây bố mẹ khỏe mạnh rồi sử dụng làm giống cho các vụ sau. Nhưng biện pháp này vẫn
tốn kém, không đảm bảo và tác hại của bệnh virus vẫn chưa kiểm sốt được. Mặt khác, virus
khơng thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng, tích lũy dần
dần trong cây (do virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây kí chủ) và làm thối hố giống. Do đó

cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh.
Hiện nay bằng việc áp dụng công nghệ nuôi cây invitro việc tạo ra nguồn giống sạch
bệnh virus đã cho hiệu quả tốt hơn hẳn so với các biện pháp truyền thống. Đặc biệt là việc áp
dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem để nhân nhanh và loại sạch virus khỏi những cây bố
mẹ đã bị nhiễm virus.
Trong phạm vi bài tiểu luận nhỏ này chúng ta cùng tìm hiểu về Ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm phục tráng cây trồng.

2


II. Nội dung.
Virus sống kí sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của
White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy: nồng độ virus ở mô
phân sinh đỉnh rể, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa ở với
mơ phân sinh ở phía dưới. Từ đây các ơng đã đề xuất kĩ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để tạo
ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh.
The Mathews 1970, Wang et Hu 1980 đã đưa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus ở
meristem như sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này khơng có trong mơ phân
sinh đỉnh. Mô phân sinh ở ngọn chồi và các phác thể lá ở chồi đang tăng trưởng thường chưa liên
kết với mơ dẫn truyền của cây, do đó chúng thường không bị xâm nhiễm bởi virus vốn đi vào cây
thông qua hệ thống này.
- Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền
của virus.
- Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây.
- Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản q trình sao chép thơng tin
của virus.
Trên thực tế, đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về nuôi cấy mô phân sinh đỉnh của cây để
làm sạch bệnh virus. Những cơng trình đó đã đạt được những thành tựu vô cùng to lớn, đáp ứng

nhu cầu sản xuất , trồng trọt của con người. Sau đây là một vài cơng trình nghiên cứu về kỹ thuật
nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch bệnh virus nhằm phục tráng cây trồng.

3


1) Đề tài: Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta ( Allium Sativum L.) bằng nuôi cấy
Meristem do PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh và ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương thuộc Viện sinh
học nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội thực hiện.
Nội dung:
Quy trình ni cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) nhằm làm sạch virus cho giống tỏi ta (Allium
sativum L.) đã được nghiên cứu và thiết lập. Các mẫu tỏi bệnh thu thập theo triệu chứng bệnh từ
đồng ruộng được kiểm tra xác định nhiễm virus thông qua các phương pháp: (1) lây nhiễm nhân
tạo trên cây chỉ thị rau muối (Chenopodium album L.); (2) sử dụng RT-PCR để xác định RNA
của virus trong cây. Mẫu tỏi củ được xử lý với ethanol 70% trong 1 phút, NaDCC (sodium
dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong 5 phút trước khi tách meristem. Môi trường nuôi cấy tái
sinh meristem tốt nhất là MS + 30g saccarose + 1mg BA/l. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng
để làm sạch virus cho giống tỏi nghiên cứu cần tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 0,3mm, hoặc
trong trường hợp tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 1mm thì mẫu cấy cần được ni cấy trên
mơi trường có bổ sung ribavirin ở nồng độ 20mg/l. Chồi tỏi sạch virus tái sinh được nhân lên
trong môi trường MS + 30g saccarose + 0,5mg αNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi cao
nhất (4,08 lần), chồi sinh trưởng tốt nhất (chiều cao chồi đạt 7,55cm). Chồi cũng có thể được tái
sinh từ callus trên mơi trường MS + 15g saccarose/l + 10g glucose/l + 5g manitol/l + 2,0mg BA/l
cho số chồi tái sinh trên mẫu là 11,67 chồi/mẫu. Môi trường tạo rễ in vitro cho cây tỏi là MS +
30g saccarose + 0,5g than hoạt tính/l + 0,5mg αNAA/l, cho tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung
bình đạt 5,19 rễ/cây và cây sinh trưởng phát triển tốt.
Đánh giá kết q nghiên cứu:
Cơng trình nghiên cứu đã được thực hiện trên đồng ruộng ở xã Cổ Bi và Đặng Xá, huyện Gia
Lâm, Hà Nội. Việt Nam có điều kiện thuận lợi để trồng và phát triển giống tỏi nhằm đem lại lợi

4


ích kinh tế cao cho người dân. Nghiên cứu đã tìm ra những mơi trường và nhân tố phù hợp để
làm sạch virus trên cây tỏi, giúp cây sinh trưởng phát triển tốt. Hiện nay nghiên cứu đang được
ứng dụng trên diện tích đất trồng tỏi của bà con nhân dân và đạt được những kết quả mong đợi.

2) Đề tài: Tẩy sạch virus giống khoai tây KT2 bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh do
GS.TS. Nguyễn Quang Thạch thuộc Viện sinh học nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội
thực hiện.
Nội dung:
Khoai tây giống nhập từ Hà Lan, Hàn Quốc, được bà con nông dân trồng vào vụ Đông, từ
khoảng cuối tháng 10 đến tháng 12. Sau khoảng 70– 80 ngày có thể thu hoạch, bà con lại chọn
những củ “khoai tây đẹp” cất trên nền nhà để làm giống cho vụ sau. Đây là phương pháp thủ
công truyền thống từ xưa vốn dĩ khá phù hợp với điều kiện nhà nông: đơn giản, không tốn kém
và tiện lợi. Nhưng từ vụ nọ sang vụ kia, các giống khoai tây các thế hệ F1, F2, F3... đem trồng
phát triển kém, hay bị bệnh dẫn đến năng suất giảm đáng kể, mà ngun nhân chính là giống bị
thối hóa, nhiễm virus và già củ do bảo quản thô sơ không đảm bảo. Là nước nhiệt đới, nên chỉ
cần từ 5 – 10% khoai tây bị nhiễm virus là bắt buộc phải thay giống mới. Nhập giống khoai tây
mới “sạch bệnh” của nước ngồi thì q tốn kém, nằm ngồi khả năng tài chính của bà con nơng
dân nên dường như cánh cửa sản xuất đang khép lại dần vì khơng tìm được lối thốt. Khoai tây
bị bệnh là tình trạng chung không tránh khỏi. Việc tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy
meristem đã được áp dụng thành công trên thế giới qua các nghiên cứu của Morel G. và Martin
C. từ những năm 1952 – 1955, Norris D.O. (1954), Kasanis B. (1957). Tuy nhiên ở Việt Nam
chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết quy trình tẩy sạch virus cho khoai tây bằng công nghệ này. Áp
dụng thành tựu của thế giới, GS. Thạch và cộng sự đã nghiên cứu thành cơng quy trình tẩy sạch

5

virus cho khoai tây KT2. GS. Thạch giải thích: “Thân thực vật, trong đó có khoai tây KT2, có
nhiều meristem với kích thước từ 0.1-0.3mm. Đây là những bộ phận rất sạch, khơng có mạch dẫn
nên virus khơng xâm nhập vào được”. Trong phịng thí nghiệm của Viện Sinh học Nông nghiệp,
các nhà khoa học đã tách cắt meristem của khoai tây KT2 dưới kính hiển vi, sau đó tiến hành
nuôi cấy mô để phát triển thành cây khoai tây trong ống nghiệm. Vì meristem khơng có virus và
mơi trường ni cấy hồn tồn sạch bệnh nên cây khoai tây KT2 sạch virus 100% và có được
những tính trạng ưu việt ban đầu của nó.
Những cây khoai tây ni cấy mô này, sau một thời gian sinh trưởng, sẽ được ươm trong mơi
trường sạch, an tồn của nhà màn. Các nhà khoa học ngồi phương pháp ni cây trong ống
nghiệm, cũng có thể nhân giống bằng cách tạo củ trong ống nghiệm, từ đó có thể đem trồng trên
đồng ruộng. GS.Thạch cho biết thêm, lợi thế của củ mini là có thể sản xuất quanh năm trong mơi
trường tự nhiên, giá thành hạ, năng suất cao và dễ bảo quản củ giống. Đến bây giờ Viện sinh học
Nông nghiệp đã hoàn thiện hệ thống sản xuất giống sạch bệnh.
Đánh giá kết quả thí nghiên cứu:
Chỉ trong 2 năm, diện tích khoai tây giống của một xã Bắc Ninh giảm hơn nửa do bị bệnh. Một
số địa phương đã nhận chuyển giao công nghệ như Công ty giống cây trồng TW, Trung tâm
khuyến nơng Thái Bình. Ngồi ra Viện cũng đã cải tiến phương tiện vận chuyển cây giống: giao
cây giống gốc cho các địa phương, sản xuất củ mini trong nhà màn cách ly để nhân ra một lượng
lớn cây đồng đều trong thời gian ngắn. Đồng thời xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây liên hồn
từ phịng thí nghiệm đến cơ sở sản xuất đã được chấp nhận ở quy mơ tỉnh để có thể nhân giống
đồng loạt số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn và trái vụ, củ giống đạt tiêu chuẩn quốc tế
nhưng giá thành hạ.

6


3) Phục tráng cây thuốc lá nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Bệnh virus không những làm giảm năng suất, chất lượng cây thuốc lá, mà còn là nguy cơ
truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau. Đặc biệt, cây thuốc lá dễ lây lan nhiễm bệnh và dễ
phát triển thành dịch. Mặt khác, virus khơng thể tiêu diệt, phịng trừ như những bệnh vi khuẩn,

nấm, mà chúng tiềm tàng tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống. Cách duy nhất là
loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh.
Làm sạch virus kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh là hai biện pháp nằm trong phạm
vi phục tráng giống. Bên cạnh hai nhiệm vụ là duy trì đặc tính giống và tính đồng đều của giống,
nhiệm vụ chủ yếu của công tác phục tráng giống là cung cấp hạt giống sạch virus cho sản xuất
hạt giống thương mại và cung cấp cho người sử dụng.Từ năm 2003-2005, Viện Kinh tế kỹ thuật
Thuốc lá đã phục tráng 2 giống thuốc lá C176 và K326 nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Hai giống thuốc lá C176 và K326 là hai giống nhập nội từ năm 1990, vì vậy chúng bắt đầu xuất
hiện những đặc tính thối hố giống như cây lùn đi, lá nhỏ lại và dẫn đến năng suất thấp. Việc
phục tráng lại hai giống C176 và K326 nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Meristem) theo phương
pháp Murashig Skoog,1962, bình ni cấy đặt tại Phịng ni cấy của Viện KTKTTL, nhiệt độ
20-25oC, chiếu sáng 8 giờ trong ngày. Sau đó cây được đem ra ngồi thực nghiệm bố trí theo
phương pháp khối ngẫu nhiên đã đảm bảo tương đương các chỉ tiêu cao cây, kích thước lá, năng
suất ... so với giống gốc nhập nội.
Nhờ các dòng thuốc lá đã được phục tráng, hàng năm đã duy trì bồi dục làm vật liệu sản xuất
hạt giống. Hạt giống thuốc lá sản xuất theo phương pháp này có tiêu chuẩn chất lượng cao tương
đương hạt nhập nội. Tuy nhiên, giá thành sản xuất hạt giống trong nước rẻ hơn rất nhiều so với
nhập hạt giống từ nước ngoài.

7


4) Ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa lan tạo dòng cây sạch bệnh
Hoa lan là một trong những giống hoa rất được u thích khơng chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà
còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã. Chính vì vậy mà hiện nay, rất nhiều hộ gia
đình đang có thú chơi hoa lan. Nguyên nhân của trào lưu trên là do cuộc sống ngày càng phát
triển, nhu cầu tạo góc vườn nhỏ, mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của những
người dân ngày càng cao. Với ưu điểm ít chiếm diện tích, khơng q khó trồng, cho hoa đẹp lại
lâu tàn nên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của
nhiều người.

Bên cạnh đó, hoa lan là sản phẩm trồng trọt ln có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ
sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại. Nhưng làm sao để có số lượng lớn
cây giống, đồng đều và sạch bệnh là một vấn đề khó. Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh và đáp ứng giá cả phải
chăng là vơ cùng hữu ích.
Theo Champagnat (1997) và Fast (1980), các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới
nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi cấy đỉnh sinh
trưởng cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành
protocorm. Còn đối với Cattleya khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường bị hóa nâu. Chính vì vậy
đỉnh sinh trưởng của hoa lan thường được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vơ trùng và
được ni trong mơi trường khơng có agar, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào mơi trường.
Sự thành lập protocorm ở cattleya mất nhiều thời gian và luôn tạo ra ở phần gốc mẫu cấy. Các
protocorm tạo thành được tách ra và cấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm
bất định từ các protocorm ban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và
ra rễ.

8


5) Ứng dụng của nuôi cấy phân sinh đỉnh nhằm làm sạch bệnh virus trong một số cây
trồng.
a) Cây thức ăn gia súc.
Để sản xuất hạt giống cây trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ ba lá cần phải có cây bố mẹ sạch
bệnh virus để tránh sự lây bệnh thông qua hạt giống và đảm bảo thu được năng suất hạt cao.
Người ta nghiên cứu nhiều phương pháp làm sạch virus khác nhau. Xử lý lạnh và nuôi chồi ngọn
mang lại tốc độ sinh trưởng cao, nhưng chỉ sạch virus từng phần, nếu xử lý nhiệt kết hợp với
ni cấy đỉnh phân sinh thì thu được phần lớn các cây sạch virus.
b) Cây hoa bia.
Các loại bệnh virus ở hoa bia thường làm giảm năng suất đáng kể. Tiến hành chọn lọc bằng
mắt thường, xử lý nhiệt và ni cấy đỉnh sinh trưởng, cải tiến dần tình trạng sạch bệnh người ta

đã giải phóng 66% cây khỏi virus hop-mosaic (HMV) và latent bằng nuôi cấy đỉnh phân sinh,
sau đó làm sạch virus prumis necrotic ringspot (PNRV) bằng xử lý nhiệt trong thời gian 10 ngày.
c) Cây rau.
Hầu hết các loài rau trừ một vài trường hợp ngoại lệ đều được nhân giống bằng hạt. Truyền
bệnh virus qua hạt vừa mới được chứng minh ở loài virus gây bệnh khảm ở xà lách và đậu (đậu
ăn quả trắng hoặc xanh), vì vậy ở những cây trồng này cần phải chọn lọc những cây làm giống
và thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo ra hạt giống sạch virus. Đối với các loài virus
gây bệnh ở các cây rau khác thì quá trình lây lan thường xảy ra do cơ học hoặc do rệp lá, vì vậy
cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng và phịng trừ tác nhân truyền bệnh. Ở một số cây rau nhân
giống vơ tính (nấm rơm,...) cần xử dụng phương pháp ni cấy đỉnh phân sinh hoặc xử lý nhiệt

9


để giải phóng virus. Đối với nấm rơm có thể làm sạch bệnh bằng phương pháp xử lý nhiệt và
trong thời gian gần đây người ta đã tạo được phương pháp miễn dịch trong agar gel.
Ngoài ra, ở những cây trồng dùng để sản xuất hạt của chúng có thể nhân giống vơ tính qua
nhiều năm, ví dụ như súp-lơ người ta cũng cần phải có vật liệu sạch bệnh virus ban đầu. Thông
qua nuôi cấy mô người ta tạo được một vài trăm cây và bằng biện pháp thử virus đã thu được
3.220 cây sạch bệnh.
d) Cây ăn quả.
Nuôi cấy đỉnh phân sinh ở cây ăn quả tới nay mới chỉ được sử dụng ở những đối tượng sau:
dâu chua, dâu chua quả đỏ, dâu chua quả đen và cây táo. Thực tiễn cho thấy đối với cây ăn quả
(cây thân gỡ) việc ni cấy đỉnh phân sinh cịn gặp khó khăn hơn bởi vì khả năng tái sinh của
chúng yếu hơn so với cây thân thảo. Các thí nghiệm trong những năm sắp tới chắc chắn sẽ nêu ra
những kết quả mới.
e) Cây hoa
Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vơ tính thường bị bệnh virus trong khi
bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví
dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên...). Hiện nay, người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác.

Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và
hoa cúc.
Việc ứng dụng thực tiễn trong các xí nghiệp chuyên sản xuất hoa đã trở thành quen thuộc
trong những năm gần đây. Ở Hà lan, có những cơ sở của tổ chức trồng hoa chuyên nhận các
loài vật liệu để làm sạch virus. Ở Anh, cũng tổ chức một cơ quan tương tự như vậy. Ở Đơng Đức
(cũ) có xí nghiệp ươm cây con ở thành phố Dresden cũng nhân các loài hoa như cúc, hoa anh
túc, hoa thủy tiên... để xử lý nhiệt và làm sạch virus.

10


Các điều kiện để làm sạch virus đối với cây hoa thường được thực hiện dễ dàng, vì thế ở
những lồi cây trồng này việc làm sạch virus thường có kết quả nhất. Vì thế dưới đây một số
biện pháp quan trọng như xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh và xét nghiệm virus được trình
bày trên đối tượng cây hoa.

Kết luận: Việc tạo ra các cây giống sạch virus là biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả
các cây giống vơ tính và cũng là một biện pháp phục tráng giống cho các giống đã bị thối
hóa do virus. Ni cấy phân sinh đỉnh làm sạch bệnh virus đã mở ra hướng đi mới và đạt
hiểu quả tốt đối với giống cây trồng. Đáp ứng nhu cầu phát triển của tiến bộ khoa học và đời
sống sản xuất.

11


Tài liệu tham khảo:
/> /> />%20sinh.html
/>
- bài giảng Công nghệ mô và tế bào thực vật của TS. Nguyễn Thị Lý Anh.
- Tạp chí khoa học và phát triển 2012, tập 10.

12