Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
Học viện Quân y

2. PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh
Viện Nghiên cứu hệ gen

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trên con đường khoa học đầy vinh quang nhưng cũng không ít những chông
gai và hoàn thành luận án này mới chỉ là bước khởi đầu, tôi thấy mình thật may mắn
bởi luôn có những người thầy, cộng sự, người thân đã đồng hành cùng tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn
Thái Sơn và PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, những người thầy luôn tận tụy, góp ý cho
tôi, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành
luận án.
Luận án được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh y học; Trung tâm Nghiên cứu Y
Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường,
Viện Công nghệ sinh học, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em đồng
nghiệp giành cho, tôi xin phép được gửi tới lòng biết ơn chân thành nhất. Luận án
nhận được sự hỗ trợ quý báu bởi đề tài cấp Bộ Quốc Phòng “Nghiên cứu chế tạo kit
PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và dịch hạch”, do
PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn làm chủ nhiệm.
Đồng thời, để có thể hoàn thành được chương trình học tập cũng như hoàn
thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các cá
nhân và cơ quan, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:
GS. TS. Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã
dành cho tôi những đóng góp quý báu về nội dung nghiên cứu chính giai đoạn đầu
của nghiên cứu sinh cùng những quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận án.
Ban Lãnh đạo, Bộ phận Đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Đảng ủy, Ban
Giám đốc Học viện Quân y; Ban Cán bộ, Phòng Chính trị; Chỉ huy Trung tâm
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí và trang

thiết bị.
TS. Đoàn Trọng Tuyên, Cục Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi về chủng
nghiên cứu cùng những chia sẻ về kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu
với các mầm bệnh nguy hiểm.
Cuối cùng là gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.
Đinh Thị Thu Hằng
i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng
cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

NCS. Đinh Thị Thu Hằng

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tên đầy đủ

Chữ viết tắt

Giải nghĩa

API

Analytical profile index

BHI

Brain heart infusion

Môi trường dinh dưỡng BHI

BLAST

Basic local alignment search tool

Bp

Base pairs

Công cụ
xếp cơ bản
Cặp base

BSL-3

Bio-safety level 3

An toàn sinh học cấp 3

CDC
CFU

Centers for Disease Control and
Prevention
Colony forming unit

Trung tâm kiểm soát và phòng
ngừa dịch bệnh
Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CRMs

Certified reference materials

Vật liệu tham chiếu được chứng
nhận

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

EQA

External quality assessment

Đánh giá chất lượng từ bên ngoài

IC

Internal amplification control

Chứng nội tại

ID

Identification

Định danh

IS

International standard

Mẫu chuẩn quốc tế

ISO

International
organization
Kilo base

Kb
LAMP
LB

Loop
mediated
amplification
Luria-Bertani

MCS

Multiplex cloning site

standard

isothermal

tìm

kiếm

sắp

Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế

Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm

Vùng đa điểm cắt

iii


mPCR

Multiplex PCR

PCR đa mồi

NAT

Nucleic acid amplification
testing
The National Center for
Biotechnology Information
Next generation sequencing

Xét nghiệm khuếch đại dựa trên
axit nucleic
Trung tâm Quốc gia về thông tin
công nghệ sinh học
Giải trình tự thế hệ mới

OD

The National Institute for
Biological Standards and Control
The National Institute of
Standards and Technology
Optical density

Viện Quốc gia về kiểm chuẩn
sinh học
Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và
Công nghệ

Mật độ quang học

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

QA

Quality assurance

Đảm bảo chất lượng

QC

Quality control

Kiểm soát chất lượng

RMs

Reference materials

Các vật liệu tham chiếu

Rpm

Resolution per minute

Vòng/phút

SNPs

Đa hình nucleotide đơn

SRMs

Single
nucleotide
polymorphisms
Standard Reference Materials

TBE

Tris - Borate - EDTA

YHDPQĐ

Y học dự phòng Quân đội

WHO

World Health Organization

NCBI
NGS
NIBSC
NIST

Các vật liệu tham chiếu chuẩn

Tổ chức Y tế Thế giới

iv


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames .....................................
8

Bảng 2.1.

Thông tin các chủng vi khuẩn nghiên cứu ..............................................
34

Bảng 2.2.

Các mồi sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng và giải trình tự ...............................
36

Bảng 2.3.

Trình tự cặp mồi tạo dòng chứng nội tại cạnh tranh ...............................................
37

Bảng 2.4.

Các máy và thiết bị chính ........................................................................................
37

Bảng 2.5.

Thành phần dự kiến của mPCR xác định đồng thời B. anthracis

và Y. pestis ...............................................................................................................
41
Bảng 3.1.

Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y.
pestis ........................................................................................................................
52

Bảng 3.2.

Tổng hợp kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR ........................................
60

Bảng 3.3.

Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR ............................................

60

Bảng 3.4.

Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR ..........................................
62

Bảng 3.5.

Tổng hợp kết quả tối ưu dung dịch đệm trong mPCR.............................................
62

Bảng 3.6

Các thành phần cho mPCR tối ưu với 6 cặp mồi xác định gen
vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát hiện đồng thời B.
anthracis và Y. pestis ...............................................................................................
63

Bảng 3.7.

Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis ..............................
70

Bảng 3.8.

Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis .............................................
71

Bảng 3.9.

Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis ....................................
72

74
Bảng 3.10. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B. anthracis ............................................

Bảng 3.11. Đánh giá độ nhạy của mPCR với B. anthracis trên bộ mẫu
chuẩn ........................................................................................................................
75

Bảng 3.12. Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu
chuẩn ........................................................................................................................
76

v


77
Bảng 3.13. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với B. anthracis ........................................

Bảng 3.14. Đánh giá độ đặc hiệu của kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu
chuẩn ........................................................................................................................
78

Bảng 3.15. Tổng hợp kết quả định danh xác định các chủng B. anthracis
bằng kit API50 CH ..................................................................................................
82

Bảng 3.16. Tổng hợp các đột biến được xác định trên các chủng Bacillus

anthracis ..................................................................................................................
92

vi


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Bacillus anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu .........
4

Hình 1.2.

Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu .........................
5

Hình 1.3.

Yersinia pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa ...............................................
11

Hình 1.4.

Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu .........................................................
12

Hình 2.1.

Sơ đồ quá trình tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp pJET1.2-capA-

IC1 ..............................................................................................................................
43
Hình 3.1.

Các đoạn sản phẩm PCR tương ứng với 5 cặp mồi khác nhau gen
vrrA ............................................................................................................................
48

Hình 3.2.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA với kích thước khác
nhau ............................................................................................................................
49

Hình 3.3.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pagA với kích thước khác
nhau ............................................................................................................................
49

Hình 3.4.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen capA với kích thước khác
nhau ............................................................................................................................
50

Hình 3.5.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước
khác nhau ...................................................................................................................
50

Hình 3.6.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác

nhau ............................................................................................................................
51
Hình 3.7.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác
nhau ............................................................................................................................
51

Hình 3.8.

Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của B. anthracis Ba1 bằng PCR
đơn mồi ......................................................................................................................
53

Hình 3.9.

Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis bằng
mPCR với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 ......................................
54

Hình 3.10.

Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng PCR đơn
mồi..............................................................................................................................
55
vii


Hình 3.11.

Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng
mPCR với 3 cặp mồi ypo2088F1/R1, plaF1/R1, cafF1/R1 .......................................
56

Hình 3.12.

Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn ...............................................
56

Hình 3.13.

Sản phẩm mPCR với 6 cặp mồi, 2 loại tác nhân........................................................
57

Hình 3.14.

Tối ưu nồng độ mồi của mPCR .................................................................................
58

Hình 3.15.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR ........................................................................

59

Hình 3.16.

Tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR ..........................................................................
61

Hình 3.17.

Tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR ..........................................................................
61

Hình 3.18.

Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng

phụ trong vector pJET1.2/blunt .................................................................................
64
Hình 3.19.

Các kết quả tạo dòng chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1 ............................................
65

Hình 3.20.

Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trong quá trình tách chiết

DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis ...............................................
66
Hình 3.21.

Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung chứng nội tại trong quá trình

tách chiết DNA ở các nồng độ 105 và 5x104 copy .....................................................
67
Hình 3.22.

Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng ......................................
69

Hình 3.23.

Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis ...................................................................
70

Hình 3.24.

Xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis ..........................................................................
73

Hình 3.25.

Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis ..................................
76

Hình 3.26.

Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. pestis .........................................
76

Hình 3.27.

Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y.
pestis ...........................................................................................................................
77

Hình 3.28.

Đánh giá độ đặc hiệu với B. anthracis của bộ kit BaYp-mPCR................................
78

Hình 3.29.

Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR ...................................
78

Hình 3.30.

Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix ............................................................
79

Hình 3.31.

Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng ...........................
79

viii


Hình 3.32.

Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản 12 tháng .............................
80

Hình 3.33.

Khuẩn lạc các chủng nghi ngờ B. anthracis trên thạch máu cừu...............................
81

Hình 3.34.

Định danh chủng B. anthracis Ba3 bằng kit API 50 CH ...........................................
81

Hình 3.35.

Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu .........................................................
82

Hình 3.36.

Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR

tối ưu chứa chứng nội tại IC ......................................................................................
83
Hình 3.37.

Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của B. anthracis Ba3 ..............................
85

Hình 3.38.

Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. pestis ...........................................
86

Hình 3.39.

Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt ........................................................
87

Hình 3.40.

So sánh trình tự nucleotide gen vrrA của 10 chủng B. anthracis
với các chủng tham chiếu trên Genbank ....................................................................
89

Hình 3.41.

Xác định một số đột biến điểm trên trình tự nucleotide gen pagA

của 3 chủng Ba1, Ba3 và Ba4 khi so sánh với 15 chủng B.
anthracis tham chiếu ..................................................................................................
90
Hình 3.42.

So sánh trình tự gen capA của 3 chủng B. anthracis với 12 chủng
B. anthracis tham chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có đột
biến điểm)...................................................................................................................
91

Hình 3.43.

So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA
3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu

trên Genbank ..............................................................................................................
91
Hình 3.44.

So sánh trình tự nucleotide và axit amin (gen pla) của 2 chủng Y.
pestis Yp1, Yp2 với 4 chủng tham chiếu ...................................................................
93

ix


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................
i
Lời cam đoan ................................................................................................................
ii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt...........................................................................
iii
Danh mục bảng .............................................................................................................
vi
Danh mục hình .............................................................................................................
viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................
1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................
4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis...................................
4
1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis .............................................................
4
1.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis ....................................................................
11
1.1.3. B. anthracis, Y. pestis và vũ khí sinh học ......................................................
17
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B. anthracis, Y. pestis .................................
18
1.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống ..........................................................
18
1.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa ..............................................................
20
1.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực ....................................................
20
1.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic ..........................................
22
1.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN..............................................................
30
1.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới...................................................
30
1.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ở Việt
Nam...............................................................................................................
31
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................
34
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................................

34
2.1.1. Các chủng vi khuẩn, plasmid .........................................................................
34
x


2.1.2. Sinh phẩm, hóa chất.......................................................................................
34
2.1.3. Các máy, thiết bị nghiên cứu .........................................................................
37
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu......................................................................................
37
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................................................
38
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu .......................................................................................
38
2.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .........................................................
38
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................................................
48
3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH
ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis .............................................................
48
3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR ..................................
48
3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR ..............................................................
53
3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis ....................................................................................................
57

3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR .............
63
3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis ...................
68
3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR
TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ....................
69
3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu
chuẩn ...............................................................................................................
69
3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng
phân lập .........................................................................................................
80
3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ............
94
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................
95
4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B.
anthracis VÀ Y. pestis ........................................................................................
95
4.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis ..................................................................................................
95
xi


4.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis ...........................................................................................................
100
4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ

MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ................................................
103
4.2.1. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn ................
103
4.2.2. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập ..............
107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................
116
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ....................
118
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ............................................................
119
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................
125
PHỤ LỤC

xii


1

MỞ ĐẦU
Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy
hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hoàng trong lịch
sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Bởi tính chất dễ lây truyền và
tỷ lệ tử vong cao qua đường hô hấp, theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch
bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention, USA - CDC), B. anthracis
và Y. pestis được phân loại là những tác nhân khủng bố sinh học nhóm A (nhóm các
tác nhân sinh học tối nguy hiểm). Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở
các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài gặm

nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt
khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng
bố sinh học.
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường
nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là
một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia.
Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo
điều trị chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn
vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao,
phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không
cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy cần tiến
hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (Biosafety level 3, BSL-3) với nhân
viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu
dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó,
các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống
khủng bố sinh học.
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và
chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật
như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ


2

cần thực hiện ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ
thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không phát
hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. Đối với B.
anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen
đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc
lực là pXO1 và pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong
hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi. Tương tự, Y. pestis chứa hai

plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương ứng.
Do đó, các kỹ thuật này có thể không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của
B. anthracis, Y. pestis và phải phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền nhưng
vẫn có thể bỏ sót chẩn đoán, chưa đề cập đến là chúng có thể không phù hợp với
một số chủng trong nước.
Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn đoán B.
anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả công bố, tuy nhiên những nghiên cứu
này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên.
Điều này có nghĩa là trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào
được sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì phải
dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời gian và kinh phí. Do
đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) có thể xác định chính xác đồng
thời hai loại tác nhân B. anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi.
Xuất phát từ những vấn đề trên, luận án: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật
multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis”
được thực hiện với hai mục tiêu:
- Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y.
pestis.
- Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn
và các chủng phân lập.


3

Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong nghiên cứu
phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y.
pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch
đại đồng thời 7 sản phẩm bao gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA
(thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B. anthracis; và 3 gen đích

là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid
pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết
quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường
hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt
với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các
lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis
1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis
1.1.1.1. Đặc điểm sinh học
B. anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus
gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây
nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người
(Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái,
tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất
giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn
hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và
plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ.
B. anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm,
thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1.1). Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường
nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình
dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có
vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015).

Hình 1. 1. B. anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu

(Nguồn: Christine, 2015)


5

B. anthracis dễ sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt
độ thích hợp là 37C, pH 6,9 - 7,0. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc
thành khuẩn lạc dạng R (Rough - dạng xù xì), đường kính 4 - 5 mm, màu trắng ngà,
bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Trên môi trường thạch máu
cừu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc không làm tan máu, khuẩn lạc khi được
phóng đại vài chục lần có hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử (Hình 1.2). Vi
khuẩn mọc không làm đục trên môi trường lỏng, tạo cặn như bông lắng xuống đáy,
lắc không tan. Tính chất lên men đường của B. anthracis bao gồm: Lên men không
sinh hơi với các đường glucose, manitol, saccarose, không lên men đường salicin,
làm lỏng gelatin, đông huyết tương, không mọc trên môi trường thạch Mac Conkey
(Geo, 2013).

Hình 1. 2. Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu
(Nguồn: Christine, 2015)

Thể sinh dưỡng của B. anthracis có sức đề kháng không cao, bị diệt ở điều
kiện nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 100°C trong 5 phút và những chất khử trùng
thông thường. Thể bào tử có sức đề kháng rất cao, tồn tại trong điều kiện tự nhiên
nhiều năm, có thể tới vài chục năm mà vẫn còn khả năng gây bệnh (Geo, 2013).
Tuy nhiên, bào tử có thể bị phá hủy bởi hấp ướt ở điều kiện 121°C sau 20 phút
(Fasanella, 2003).
Độc lực của B. anthracis được tạo thành bởi 2 yếu tố chính đó là ngoại độc tố
và protein vỏ. Ngoại độc tố của B. anthracis hợp thành từ 3 yếu tố riêng biệt được mã
hóa bởi plasmid pXO1. Yếu tố gây phù làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân

6

trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm
tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt
protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011).
Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng
hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2. Plasmid này có thể truyền
từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê
Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ
cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka,
2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có
khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ của vi
khuẩn có thể được hình thành ở động vật mắc bệnh hoặc trên môi trường nuôi cấy ở
điều kiện khí trường CO2 5%, được phát hiện bằng các phương pháp như: Nhuộm
mực tàu, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Đây cũng là những phương pháp để phân
biệt B. anthracis với B. cereus và B. thuringiensis bởi chúng đều không có khả năng
tổng hợp vỏ. Với những chủng B. anthracis không có plasmid pXO2, thành tế bào
xuất hiện lớp S-layer (Surface layer), gồm 2 loại protein là EA1 (Extractable Antigen
1- Kháng nguyên có thể tách chiết) và Sap (Surface array protein- Protein bề mặt),
được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể. Đây là một dạng siêu cấu trúc xuất hiện
phổ biến ở một số đơn bào nguyên thủy và các vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho
là có vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài,
đảm bảo hình dạng vi khuẩn và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra, S-layer còn có
vai trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của
đại thực bào vật chủ (Fouet, 1999).
1.1.1.2. Đặc điểm hệ gen
Hệ gen của B. anthracis gồm 1 nhiễm sắc thể dạng vòng và 2 plasmid độc
lực là pXO1, pXO2. Hệ gen với hàm lượng nucleotide AT cao, GC chỉ chiếm
khoảng 35%. Điều này cho thấy DNA của B. anthracis có nhiệt độ nóng chảy thấp

hơn các loài khác. Các plasmid tương đối lớn và mã hóa cho nhiều gen khác nhau,


7

nhưng quan trọng nhất là các gen mã hóa cho ngoại độc tố và protein vỏ. Plasmid
pXO1 chứa các gen độc tố quan trọng là pagA, lef và cyaA. Plasmid pXO2 mang
các gen tổng hợp protein vỏ và cần thiết cho tính độc đầy đủ của B. anthracis.
Nhiễm sắc thể
Một trong những chủng được nghiên cứu đầy đủ nhất là B. anthracis Ames,
bởi chính dòng Ames được sử dụng trong cuộc tấn công khủng bố bằng bào tử than
ở Mỹ năm 2001. Nhiễm sắc thể của B. anthracis Ames có kích thước 5.227.293
nucleotide (5,2 Mb) với 5.508 gen mã hóa protein liên quan đến khả năng tồn tại,
trao đổi chất của B. anthracis cũng như các gen quy định đặc tính sinh học (Klee,
2010). Trong đó, có 33 gen RNA ribosome (23S, 16S và 5S) sắp xếp trên 11 operon
và cùng với 95 gen RNA vận chuyển. Nhiễm sắc thể chiếm khoảng 95% hệ gen,
còn lại là 2 plasmid độc lực (pXO1 = 181.677 bp, 3 bản sao/ tế bào; pXO2 = 94.829
bp, 2 bản sao/ tế bào) (Straub, 2013). Chủng B. anthracis Ames này chỉ khác biệt
một vài nucleotide so với chủng tổ tiên B. anthracis Ames Ancestor, có kích thước
nhiễm sắc thể 5.227.419 bp, pXO1 181.677 bp và pXO2 94.830 bp (Ravel, 2009).
Đồng thời, khi so sánh một chủng khác là B. anthracis H9401 (Hàn Quốc) với B.
anthracis Ames Ancestor cho thấy chúng có độ tương đồng 99,68% về nucleotide
(trong đó, nhiễm sắc thể 99,69%; pXO1 99,57%; pXO2 99,58%) và 99,87% về axit
amin (Read, 2003; Chun, 2012).
Trên nhiễm sắc thể của B. anthracis, các gen đặc trưng thường dùng cho
chẩn đoán như gyrA, vrrA, Ba813, SG-850 và rpoB. Trong các gen đặc trưng trên,
gen vrrA (variable repeat region A) mã hóa cho protein glutamine, khối lượng phân
tử khoảng 30 kDa (Keim, 1999), vrrA có ở hầu hết các chủng B. anthracis và ít khi
bị biến đổi hoặc mất đi trong tự nhiên cũng như nuôi cấy (Jackson, 1997; Perdue,
2003). Vì vậy, vrrA chính là gen phù hợp để xác định B. anthracis.

Việc tổng hợp nên protein của các khung đọc mở có liên quan tới các trình tự
chèn. Các trình tự chèn này có thể gắn tự do vào bất kì vị trí nào trên hệ gen vi
khuẩn. Hoạt động gắn và tách khỏi hệ gen không phụ thuộc vào thông tin di truyền


8

trên nhiễm sắc thể. Khi gắn vào vị trí mới, chúng làm cho đoạn gen gắn vào bị mất
chức năng.
Bảng 1. 1. Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames
Đặc điểm

Nhiễm sắc thể

pXO1

pXO2

Kích thước (bp)

5.227.293

181.677

94.829

Số lượng gen

5.508

217

113

Tỷ lệ replicon mã hóa (%)

84,3

77,1

76,2

Kích thước gen trung bình
(nucleotide)

800

645

639

Tỷ lệ G+C (%)

35,4

32,5

33,0

Số rRNA operon

11

0

0

tRNAs

95

0

0

sRNAs

3

2

0

Số gen phage

62

0

0

Số gen transposon

18

15

6

Số khung đọc bị phá vỡ

37

5

7

Số gen chức năng

2.762

65

38

Số gen hypothetical bảo tồn

1.212

22

19

Số gen chưa biết chức năng

657

8

5

Số gen hypothetical

877

122

51

(Nguồn: Read, 2003)

Plasmid
Toàn bộ độc lực của B. anthracis nằm trên 2 plasmid là pXO1 và pXO2.
Plasmid pXO1 có khối lượng 110 MDa, kích thước khoảng 182 kb, gồm 217 gen, tỷ
lệ GC là 32,5%. Trên plasmid pXO1 có 143 khung đọc mở, trong đó gần 70% ORF
mã hóa cho protein không rõ chức năng, 11 ORF được dự đoán là mã hóa cho
protein cấu trúc. Hầu hết chức năng của plasmid này được quy định bởi một “đảo
gây bệnh” PAI (Pathogenicity Island), nằm ở vị trí từ 117.177 đến 162.013 trên
plasmid, kích thước 44,8 kb, tỷ lệ nucleotide GC là 30% và được giới hạn bởi 2
đoạn chèn IS1627 ở mỗi đầu. Đây là vùng chứa tất cả các gen mã hóa cho protein

9

độc tố của pXO1 như gen pagA, cya, lef, gen điều hòa atxA và gen mã hóa
toiposomerase (topA) (Okinaka, 1999; Pannucci, 2002).
Trong đó, gen pagA kích thước 2.295 bp, mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA
(Protective Antigen) có vai trò rất quan trọng, bởi PA là trung tâm cho hoạt động
của các yếu tố gây chết, gây phù của B. anthracis. Kháng nguyên bảo vệ là môi
trường trung gian bắt buộc để chuyển các yếu tố gây chết, gây phù vào trong tế bào
vật chủ (Ramisse, 1996; Price, 1999). Chính vì vậy, sử dụng gen pagA trong chẩn
đoán B. anthracis có thể giúp xác định các chủng B. anthracis có khả năng gây độc.
Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu của các tác giả gần đây (Safari Foroshani,
2013; Ogawa, 2015; Banada, 2017).
Gen cya kích thước 2.403 bp, mã hóa cho yếu tố gây phù nề EF (Edema
Factor). Trong đó, tiểu phần khối lượng phân tử 30 KDa của EF liên kết với PA có
ái lực cao giúp EF xâm nhập vào trong nội bào. Tiểu phần còn lại khối lượng phân
tử 58 kDa là một adenylyl cyclase phụ thuộc calmodulin (CaM) và hoạt động của
nó được điều hòa bởi nồng độ cation Ca2+ sinh lý. Tiểu phần này có thể được chia
thành hai đơn vị chức năng, phần khối lượng 43 kDa có vai trò phân hủy adenosine
triphosphate (ATP) thành cyclic adenosine monophosphate (cAMP) và phần khối
lượng 17 kDa còn lại không có hoạt tính xúc tác nhưng tạo điều kiện để CaM kích
hoạt EF (Guo, 2004).
Gen lef kích thước 2.430 bp, mã hóa cho yếu tố gây chết LF (Lethal Factor),
gồm một đoạn peptide tín hiệu 33 axit amin và phân tử protein trưởng thành kích
thước 776 axit amin, không chứa cystein (khối lượng 90,2 kDa), mà được mã hóa
bởi một trình tự nucleotide giàu AT (hàm lượng nucleotide AT khoảng 70%).
Protein này là một protease phụ thuộc cation Zn2+, làm ức chế con đường dẫn truyền
tín hiệu MAPK (Mitogen activated protein kinase), thông qua việc phân tách các
enzyme hoạt hóa MAPK gần đầu amin của nó, ngăn cản sự phosphoryl hóa các

thành phần p38, ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK (c-Jun aminoterminal kinases). Hoạt động này của LF gây tổn thương lan rộng, có thể tổn hại đa


10

hệ thống như hệ miễn dịch, hệ tuần hoàn, hệ nội tiết, gây chết tế bào (Agrawal,
2004).
Plasmid pXO2 có khối lượng 60 MDa, kích thước khoảng 95 kb, gồm 113
gen, 85 ORF, trong đó có các gen capA, capB, capC liên quan đến sự tổng hợp
protein vỏ. Đồng thời, protein vỏ là một trong những yếu tố độc lực chính trong quá
trình xâm nhập của B. anthracis (khi kết hợp với yếu tố LF và EF). Nhờ điện tích
âm mà protein vỏ ức chế bảo vệ vật chủ thông qua sự ức chế thực bào của các đại
thực bào. Một báo cáo gần đây cho thấy protein vỏ của B. anthracis kích hoạt sinh
Interleukin-1β từ tế bào monocyte, gây ảnh hưởng lâu dài đến lympho T trong máu
trên mô hình động vật thí nghiệm (Jang, 2011). Các gen tổng hợp protein vỏ được
sắp xếp theo thứ tự là capB, capC và capA, với kích thước tổng thể là 3.244 bp.
Việc tổng hợp protein vỏ được điều hòa bởi gen atxA trên pXO1 và gen acpA trên
plasmid pXO2 (Drysdale, 2004).
Gen capA kích thước 1.235 bp, mã hóa cho protein capA (411 axit amin, khối
lượng phân tử 46 kDa), thường được sử dụng trong chẩn đoán B. anthracis (Irenge,
2010; Ogawa, 2015). Gen capB kích thước 1.394 bp, mã hóa cho protein capB (397
axit amin, khối lượng phân tử 44 kDa). Gen capC kích thước 449 bp, mã hóa cho
protein capC (149 axit amin, khối lượng phân tử 16 kDa).
Để xác định chính xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên, ngoài gen đích
trên nhiễm sắc thể, cần thiết kế thêm các cặp mồi xác định gen trên plasmid độc lực
pXO1 và pXO2. Plasmid pXO1 và pXO2 được duy trì ổn định trong B. anthracis
khi phát triển trong cơ thể chủ. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy, hay trong tự
nhiên, dưới áp lực chọn lọc, plasmid pXO2 có thể bị mất. Ngược lại, plasmid pXO1
hiếm khi bị mất, sự ổn định này có thể liên quan đến topoisomerase 1 thuộc
plasmid. B. anthracis có thể được phục hồi plasmid qua nuôi cấy tại điều kiện 43oC

hoặc bổ sung novobiocin ở nồng độ tiền gây chết (Koehler, 2009). Như vậy, để
chứng minh chủng B. anthracis có độc lực cần xác định chủng có đầy đủ plasmid


11

pXO1, pXO2 thông qua các gen độc lực, kết hợp đồng thời với gen đặc trưng như
vrrA trên nhiễm sắc thể.
1.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis
1.1.2.1. Đặc điểm sinh học
Y. pestis thuộc chi Yersinia, họ Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài,
là các vi khuẩn Gram âm hình que hay hình cầu, không sinh bào tử. Trong chi
Yersinia, chỉ có ba loài gây bệnh ở người là Y. pestis, Yersinia pseudotuberculosis
và Yersinia enterocolitica. Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh dịch hạch phân
biệt với Y. pseudotuberculosis gây viêm hạch ruột và nhiễm trùng máu, Y.
enterocolitica gây rối loạn đường tiêu hóa (còn gọi là Yersinia đường ruột). Y.
pestis có quan hệ chặt chẽ và bắt nguồn từ Y. pseudotuberculosis cách đây khoảng
3.300 năm (Cui, 2013). Tác nhân này có độ đa dạng di truyền thấp, sử dụng nhiều
phương pháp định type thông thường ít hoặc không phân biệt được giữa các chủng
Y. pestis (Jeannine, 2015).

Hình 1. 3. Y. pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa
(Nguồn: Geo, 2013)

Y. pestis có hình bầu dục hoặc trực khuẩn ngắn, kích thước 0,5 - 0,8 x 1 - 2
µm, thường đứng đơn, đôi và có thể chuỗi ngắn nếu phát triển ở môi trường lỏng,
không sinh bào tử, không lông, không di động, có vỏ khi phát triển trong cơ thể
người hoặc nuôi cấy trên động vật thí nghiệm. Y. pestis bắt màu Gram âm, đậm ở