Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời bacillus anthracis và yersinia pestis tt

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết đề tài
Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh
tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi
kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí
sinh học. Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh
miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài
gặm nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất
kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp
thời trong phòng chống khủng bố sinh học.
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu
môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh,
chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định
đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh
những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị
chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu
chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc
dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày,
một số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử
nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp này cần tiến hành ở điều
kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3) với nhân viên được đào
tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu
dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc
hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn
đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học.
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định
nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển
với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể
thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ cần thực hiện ở điều kiện
phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này
chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không

phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid
trên. Đối với B. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác
những chủng gây bệnh, ngoài gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần
chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực là pXO1 và
pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong


hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi. Tương tự, Y. pestis
chứa hai plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các
gen đặc trưng tương ứng. Do đó, các kỹ thuật này có thể không đánh
giá được đầy đủ tình trạng độc lực của B. anthracis, Y. pestis và phải
phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể bỏ sót
chẩn đoán, chưa đề cập đến là chúng có thể không phù hợp với một
số chủng trong nước.
Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn
đoán B. anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả công bố, tuy
nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật
PCR để chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là
trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được sử
dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì
phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời
gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR mPCR) có thể xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân B.
anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi. Xuất phát từ những
vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ
thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus
anthracis và Yersinia pestis”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời
Bacillus anthracis và Yersinia pestis.
- Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các

bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Thiết kế các cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis.
- Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B.
anthracis và Y. pestis.
- Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR chẩn đoán
đồng thời B. anthracis và Y. pestis trong phòng thí nghiệm và các
chủng phân lập.


- Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực của các
chủng B. anthracis và Y. pestis.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong
nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi
được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao
gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid
pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B. anthracis; và 3 gen đích
là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1
(thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là
plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục
được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi
khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với
chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực
hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán.
5. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 139 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (3
trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật liệu

và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết quả nghiên
cứu (47 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (21 trang); Kết luận và
kiến nghị (2 trang); Các công trình đã công bố của tác giả (1 trang).
Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh (6 trang), Tài liệu tham


khảo (15 trang). Luận án có 16 bảng biểu, 44 hình và 151 tài liệu
tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo các tài liệu trong và ngoài nước về 3
vấn đề chính: (1) Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis:
đặc điểm sinh học, hệ gen cũng như sự liên quan giữa B. anthracis,
Y. pestis và vũ khí sinh học; (2) Các phương pháp xác định B.
anthracis và Y. pestis: các phương pháp vi sinh truyền thống, xác
định sinh hóa, dựa trên ái lực và các phương pháp dựa trên axit
nucleic; (3) Kiểm định kit mPCR chẩn đoán.
B. anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi
Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây
bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus),
một số có lợi cho con người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis,
Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá,
tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. Tuy
nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn
hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa kháng
nguyên bảo vệ và pXO2 mã hoá vỏ. Y. pestis thuộc chi Yersinia, họ
Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài, là các vi khuẩn Gram
âm, không sinh bào tử. Trong chi Yersinia, chỉ có ba loài gây bệnh ở
người là Y. pestis, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia
enterocolitica (Radnedge, 2001). Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây

bệnh dịch hạch và viêm phổi cấp tính.
Vũ khí sinh học hiện nay đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của
an ninh quốc gia bởi có thể bị các tổ chức khủng bố lợi dụng trong
chiến tranh sinh học. Trong các tác nhân đã được WHO và CDC nêu
ra, B. anthracis, Y. pestis được đánh giá là tác nhân có nguy cơ cao
nhất trong khủng bố vì gây bệnh nguy hiểm, dễ nuôi cấy, tăng sinh
khối với số lượng lớn, không cần trang bị hiện đại lại dễ sử dụng,
vận chuyển và gây nhiễm.
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phòng chống chiến tranh
sinh học đề phòng các tình huống địch tấn công bằng vũ khí sinh
học. Sự quan tâm được đặt ở mức đặc biệt với hai loại vi khuẩn là B.
anthracis và Y. pestis. Xác định tầm quan trọng của việc xác định


nhanh và chính xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 01-09 và một
số đề tài đã thiết kế các phản ứng PCR chẩn đoán cho từng loại tác
nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiên cứu xây dựng
phương pháp chẩn đoán nhanh Y. pestis trên các loại môi trường giả
định. Tuy nhiên, công trình chỉ dừng lại ở việc khẳng định Y. pestis
thông qua một đoạn gen duy nhất trên plasmid gây độc là pPCP1 (Lê
Thanh Hòa, 2005). Trên thực tế, một số chủng Y. pestis plasmid
pPCP1 có thể bị mất đi thì sản phẩm của nghiên cứu này sẽ không áp
dụng được (Marston, 2005). Hay nghiên cứu tách dòng và đọc trình
tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng B. anthracis
VCM1167 (Phạm Thúy Kiều, 2006).
Như vậy, có thể nói các đề tài về B. anthracis và Y. pestis ở Việt
Nam hiện nay còn ít và riêng lẻ cho từng loại tác nhân. Do đó, việc
nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh và chính xác
đồng thời hai tác nhân nguy hiểm này là cấp thiết, đáp ứng yêu cầu
an ninh quốc phòng và phòng chống dịch bệnh. Kỹ thuật mPCR

được phát triển nhằm xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis
một cách chính xác hơn bằng việc sử dụng cặp mồi thiết kế trên
nhiễm sắc thể, đồng thời cũng sử dụng các cặp mồi để phát hiện các
gen độc lực trên plasmid.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
Các chủng vi khuẩn, plasmid
Chủng chuẩn B. anthracis 17JB (ký hiệu: Ba) và Y. pestis
SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ độc lực. Chủng chuẩn đối chứng âm:
Bacillus cereus ATCC 6464, E. coli ATCC 25922, Y. enterocolitica
ATCC 27729. Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ B. anthracis:
gồm 23 chủng B. anthracis Ba1-Ba23; 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2.
Plasmid pJET1.2-capA chứa toàn bộ trình tự gen capA (thuộc
plasmid pXO1) của B. anthracis.
Sinh phẩm, hoá chất, thiết bị: Sinh phẩm, hóa chất sử dụng trong
các thí nghiệm được đặt mua từ các hãng: Thermo Scientific,
Integrated DNA Technologies- IDT, Qiagen, Norgen, bioMérieux,
Biolabs, Gibco, Invitrogen. Các trang thiết bị Bộ môn Vi sinh y học,
Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và


Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mô tả,
phân tích trong phòng thí nghiệm và trên thực địa với các kỹ thuật vi
sinh kinh điển và sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng trong
nghiên cứu gồm:
2.2.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn

2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose
2.2.5. Tinh sạch DNA
2.2.6. Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng và
gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis
2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis
2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR
2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại
2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc
hiệu và ổn định của kit mPCR
2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh
2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH
NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis
3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR
Kỹ thuật mPCR lý tưởng để xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis phải được thiết kế phát hiện đồng thời B. anthracis, Y. pestis
và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng trong tự
nhiên. Trong đó, với B. anthracis cần 1 cặp mồi trên nhiễm sắc thể
(lựa chọn gen vrrA) và 2 cặp mồi trên plasmid pXO1 và pXO2 tương
ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y. pestis, gen ypo2088 (trên
nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) và caf1 (pMT1) được lựa chọn. Như


vậy, 6 cặp mồi đặc hiệu cho mPCR được thiết kế đảm bảo khuếch đại

6 gen đích kích thước khác nhau.
Với gen vrrA, dựa vào trình tự tham chiếu trên NCBI, đã thiết kế
được 5 cặp mồi cho khuếch đại một phần trình tự gen đích (Hình
3.2). Cặp mồi gen vrrA chưa được lựa chọn ngay bởi còn phụ thuộc
vào kết quả thiết kế các cặp mồi cho 5 gen đích còn lại. Tương tự
cho thiết kế các cặp mồi gen pagA, capA (B. anthracis) và ypo2088,
pla, caf1 (Y. pestis). Sau khi kiểm tra về khả năng hình thành cấu
trúc bậc 2 hay bắt cặp chéo giữa các mồi cũng như sự phù hợp về
kích thước sản phẩm, 6 cặp mồi đã được lựa chọn.

vrrA

Hình 3. 2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA
Bảng 3. 1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và
Y. pestis
Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

Tổng số
base

Tm*

Kích thước
(bp)

vrrAF1/R1

CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F

CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R

20

59.76
59.13

222

pagAF1/R1

AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F
AGCCTGTATCCACCCTCACT-R

20

59.96
59.96

751

capAF1/R1

TGACGATGACGATGGTTGGT-F
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R

20

59.39
59.26

610

ypoF1/R1

GGATGAGATAACGCGGGTGT-F
AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R

20

59.90
59.90

103

plaF1/R1

CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F
ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R

20

60.04
60.11

438


cafF1/R1

CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F
GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R

20

60.25
59.69

271

*Tm. Nhiệt độ nóng chảy

3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR
Kỹ thuật mPCR được thiết kế và đánh giá trên 2 chủng chuẩn có
đầy đủ độc lực là B. anthracis Ba và Y. pestis Yp cùng đối chứng âm
là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica.
3.1.2.1. PCR đơn mồi phát hiện gen vrrA, pagA, capA của B.
anthracis
Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3
gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp
kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm và độ đặc hiệu từng cặp mồi.
Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích
pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba bằng
PCR đơn mồi
ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; M.
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất
hiện băng đặc hiệu và không có băng phụ (Hình 3.8). Như vậy, nồng
độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ được

sử dụng cho mPCR tiếp theo.
3.1.2.2. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen vrrA, pagA, capA
của B. anthracis
Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B.
anthracis.
3.1.2.3. PCR đơn mồi phát hiện gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis
PCR đơn mồi cho Y. pestis được thực hiện tương tự, sản phẩm là
pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10).


Hình 3. 10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen
đích pla, caf1, ypo của Y. pestis Yp bằng
PCR đơn mồi
ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; M.
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

3.1.2.4. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen ypo2088, pla,
caf1 của Y. pestis
Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis.
3.1.2.5. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và từng tác nhân
Để kiểm tra các cặp mồi của tác nhân này có bắt cặp chéo với
DNA tác nhân còn lại, kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 1 khuôn
hoặc DNA B. anthracis hoặc Y. pestis được thực hiện. Đường chạy
Yp với khuôn là DNA Y. pestis chỉ xuất hiện 3 băng đích của Y.
pestis. Tương tự, đường chạy Ba chỉ xuất hiện 3 băng đích của B.
anthracis (Hình 3.12). Như vậy, các cặp mồi đã được thiết kế đặc
hiệu cho B. anthracis, Y. pestis và không có hiện tượng bắt cặp chéo.
bp

ĐC(-) Yp Ba M

bp

Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi,
từng loại DNA khuôn
ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản
phẩm mPCR với khuôn DNA Y. pestis; Ba. Sản
phẩm mPCR với khuôn DNA B. anthracis; M.
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân
Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khuôn chỉ thu được 3
băng đích của Y. pestis.


3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
anthracis và Y. pestis
Cần tối ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng
thời B. anthracis và Y. pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl 2, dNTPs
cũng như các điều kiện về chu trình nhiệt để thu được đồng thời 6
băng sản phẩm đích đặc hiệu.
Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối
ưu trong mPCR (Hình 3.14).
Hình 3. 14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. 0,1
μM; 2. 0,2 μM; 3. 0,4 μM; 4. 0,6 μM

Với nhiệt độ gắn mồi 56oC, nồng độ MgCl2 và dNTPs tối ưu
tương ứng là 0,6 mM và 0,25 mM, phản ứng mPCR cho kết quả 6
băng đặc hiệu rõ nét nhất. Nồng độ dung dịch đệm được khảo sát ở 4

mức là (1; 1,2; 1,4; 1,5X), và nồng độ 1,2X được lựa chọn.
3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật
mPCR
Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội tại (Internal amplification
control - IC) là rất cần thiết để loại trừ các trường hợp âm tính giả do
quá trình tách chiết không hiệu quả hay những chất ức chế ảnh
hưởng đến kỹ thuật PCR. Do đó, song song với việc thiết kế mPCR,
chúng tôi đã thiết kế IC cho mPCR, đảm bảo kết quả chẩn đoán là
chính xác bằng con đường tái tổ hợp. Quá trình tạo dòng IC đạt được
kết quả như sau: một đoạn gen lef (IC1) phân lập từ B. anthracis
bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI, tạo dòng phụ trong vector
pJET1.2-blunt, kiểm tra vector pJET1.2-IC1 tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc (Hình 3.18). Cặp enzyme BamHI và NdeI được sử dụng
cắt đồng thời các vector pJET1.2-IC1 và pJET1.2-capA. Đoạn IC1
(0,65 kb từ pJET1.2-IC1) và phần còn lại của vector pJET1.2-capA
(~4 kb) được tinh sạch gel, nối ghép tạo thể tái tổ hợp pJET1.2capA-IC1. Plasmid này được kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải
trình tự. Plasmid này chứa trình tự nhận biết của cặp mồi capAF1/R1
nên cũng được khuếch đại trong mPCR, cho sản phẩm kích thước
1000 bp phân biệt với sáu sản phẩm của gen chẩn đoán.


Hình 3. 18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo
dòng phụ trong vector pJET1.2/blunt
a) Sản phẩm khuếch đại gen lef (IC1) trên gel agarose 1,2%; M. Marker
100 bp (Thermo Scientific); 1. Sản phẩm khuếch đại gen lef.
b) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%,
M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); 1-3. Các dòng khuẩn lạc 1-3 chứa
Hình 3. 20. Kiểm tra mPCR
vector táibổtổsung
hợp pJET1.2-IC1.

IC trong quá trình tách chiết DNA ở
các nồng độ khác nhau với mẫu B.
anthracis
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific);
109-103. Các mức nồng độ IC tương ứng.

Để kiểm soát toàn bộ các công đoạn của xét nghiệm, IC được bổ
sung vào trong quá trình tách chiết với một lượng tối thiểu có thể
phát hiện được nhằm loại bỏ tối đa sự ảnh hưởng đến hiệu quả tách
chiết cũng như mPCR. Kết quả trên cho thấy, băng chứng nội tại (1
kb) xuất hiện rõ ở các mức nồng độ plasmid từ 10 9-105 copy/ mẫu. Ở
mức nồng độ IC là 106-105 copy/ mẫu xuất hiện đầy đủ 3 băng đích
của B. anthracis và băng IC. Trong đó, băng IC xuất hiện rõ nét,
không bị smear và quan trọng hơn, băng đích capA cũng xuất hiện.
Còn mức nồng độ IC là 104 và 103 copy không còn xuất hiện băng IC
(Hình 3.20). Qua quá trình tối ưu trên các mẫu B. anthracis, Y. pestis,
mPCR-IC cho các băng đích rõ nét, tách biệt gồm 6 băng cho xác
định B. anthracis và Y. pestis và 1 băng IC. Có thể thấy rằng, mức
nồng độ IC 5x104copy/ mẫu cho các băng rõ nét nhất và đây chính là
nồng độ được lựa chọn sau khi tối ưu lại nồng độ của cặp mồi
capAF1/R1 (0,64 µM), các thông số khác của mPCR đã tối ưu ban
đầu cơ bản vẫn giữ nguyên (Hình 3.21). Như vậy, đã thiết kế thành


công kỹ thuật mPCR-IC tại xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis. Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC/4 phút, 32 chu kỳ (94oC/1
phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 phút.
Hình 3. 21. Kiểm tra mPCR tối
ưu có bổ sung IC ở các nồng độ
105 và 5x104 copy

M. Marker 100 bp (Thermo
Scientific); 1, 2. Mẫu Y. pestis; 3,
4. Mẫu B. anthracis và Y. pestis; 5,
6. Mẫu B. anthracis.

3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis
Sau khi xây dựng được quy trình kỹ thuật mPCR, chúng tôi đã
tiến hành chế tạo master mix theo thành phần tối ưu. Bước đầu đã
chế tạo 1000 test, 50 test/bộ, bảo quản ở điều kiện -20oC cho đánh
giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ ổn định của kit
mPCR theo thời gian và thử nghiệm trên các chủng phân lập (Ký
hiệu kit BaYp-mPCR) (Hình 3.22).

Hình 3. 22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng

3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT
mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN
LẬP


3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các
bộ mẫu chuẩn
Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy của kit mPCR
Ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu có thể phát hiện được bằng PCR
là thông số cần khảo sát trước khi xây dựng bộ mẫu chuẩn độ nhạy.
Mẫu gốc DNA được tách chiết, tinh sạch đạt nồng độ 120 ng/µl, từ
mẫu này pha loãng trong nước khử ion.
B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-)

Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis
M. Marker 50 bp; B50-B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(-). Đối chứng âm

Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được
là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl
tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA.
Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis
như trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50
µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử
dụng 10 mức nồng độ ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát
hiện B. anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) - PBA19 (0,000092
ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 - EB10.
Tương tự, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn Y. pestis là 130,5
copy/ phản ứng. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y. pestis
cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký
hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột.


Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit
mPCR
Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được
thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B.
cereus. Tương tự, sử dụng chủng E. coli và Y. enterocolitica cho Y.
pestis.
Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu
của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis
Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu
chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi tiến
hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ
mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis.

Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu
chuẩn
Khả năng phát hiện B. anthracis của bộ kit mPCR được kiểm tra
trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ
mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% các mẫu
đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của B. anthracis. Tương tự
cho đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis, đồng thời B.
anthracis và Y. pestis đều cho kết quả 100%.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp - mPCR
trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu
chuẩn độ đặc hiệu đã thiết lập từ B. cereus. Kết quả 100% các mẫu
không xuất hiện gen đặc trưng capA, pagA của B. anthracis nhưng
100% các mẫu dương tính với gen vrrA. Với Y. pestis, độ đặc hiệu
của bộ kit mPCR là 100%.
Các thành phần của kit BaYp-mPCR có sự ổn định trên 12 tháng
bảo quản ở điều kiện -20oC (Hình 3.32).
Hình 3. 32. Kiểm tra độ
ổn định mPCR sau thời
gian 12 tháng
M. Marker 100 bp; 1-10.
Các mẫu DNA EBY2


3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các
chủng phân lập
Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng,
gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và tối ưu
thành công trên chủng chuẩn. Việc đánh giá khả năng phát hiện của
kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện lý tưởng
-điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa ra thử

nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng như Y.
pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay lưu trữ thời
gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu
gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công
kỹ thuật mPCR, các chủng phân lập B. anthracis và Y. pestis sau khi
được kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, được xác định bằng kỹ thuật
mPCR. Kết quả xác định của mPCR được khẳng định bằng phân tích
trình tự toàn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các
plasmid độc lực.
Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh
Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba
(đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu ở
37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng
R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai đầu, xếp đôi,
chuỗi, bào tử ở giữa và không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, trong
đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường thạch máu cừu - có 4
chủng hình thành vỏ (B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4). 13 chủng còn
lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là B. anthracis, còn lại là B.
cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, Yp2 cho kết quả mọc các
khuẩn lạc kích thước 1 - 2 mm dạng S, màu xám đục, bờ đều, bề mặt
nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và không tan máu, là trực
khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase (-). Định danh là Y. pestis với ID Yp1,
Yp2 lần lượt là 98,6 và 96,4%.
Thử nghiệm kỹ thuật mPCR
Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B.
anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli.
Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng B. anthracis và Y.
pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số. Ở tất cả các mẫu đối
chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều

này chứng tỏ quá trình tách chiết DNA và mPCR đảm bảo, theo đó
các kết quả xác định là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 3.36). Mẫu đối
chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 220 bp - tương
ứng với gen vrrA, ngoài ra không xuất hiện thêm băng nào khác.
Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử dụng chủng B. cereus, gen
vrrA có mặt trong các loài nhóm “B. cereus”. Còn mẫu đối chứng
dương xuất hiện cả 6 gen đích đối với cả 2 tác nhân (Hình 3.36a),
hoặc xuất hiện 3 gen đích đối với từng tác nhân (Hình 3.36b).


(+) (-)

M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6

(+) (-)

M

Ba3 Ec

Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật
mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp B.
anthracis và Y. pestis; (-). Đối chứng âm là hỗn hợp B. cereus và E. coli; BY2.
Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Y. pestis Yp1;
Yp2. Y. pestis Yp2; Ba4. B. anthracis Ba4; Ba5. B. anthracis Ba5; Ba6. B.
anthracis Ba6; b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (-). Đối chứng
âm B. cereus; Ba3. B. anthracis Ba3; Ec. E. coli

Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1
băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình
3.36a) hay không xuất hiện băng đích nào (mẫu Ec Hình 3.36b),
được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh
(tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình
3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích
thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương
tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu
ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất
hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác
định lần lượt là chủng Y. pestis và B. anthracis gây bệnh. Trong khi
đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có
kích thước tương ứng với 2 gen đích là pagA và vrrA, không xuất
hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid
pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B. anthracis Ba6). Như vậy,
trong 10 chủng phân lập B. anthracis, bằng kỹ thuật mPCR đã xác
định được 3 chủng B. anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1


chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B.
anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không độc. Đồng thời
với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có
đầy đủ gen độc lực.
Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích
chẩn đoán được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các trình
tự đều thuộc các gen đích tương ứng của B. anthracis và Y. pestis.
Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành công trên chủng
chuẩn và chủng phân lập.
Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis
và Y. pestis

Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định
các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên,
mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố ở các vị trí khác
nhau. Cụ thể, với B. anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc
thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với Y.
pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla,
caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR được
phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và gen
độc ở các chủng phân lập được ở Việt Nam có sự giống và khác nhau
như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành phân tích
trình tự toàn bộ chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng của B.
anthracis và Y. pestis.
Phân lập toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực
Đối với B. anthracis, 7 gen vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB,
capC đã được nhân dòng cho xác định toàn bộ trình tự. Các gen này
đã khuếch đại thành công, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt là
551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp đúng với lý thuyết. Đối
với Y. pestis, gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 gen
trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 cho sản phẩm
kích thước là 645, 1019 và 654 bp.
Nghiên cứu tạo dòng toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực
Sản phẩm khuếch đại các gen đích được tinh sạch và tạo dòng
trong vector pJET1.2/blunt. Chúng tôi lựa chọn một số enzyme giới

a)

b)


hạn để cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp, BglII được sử dụng

trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. Ngoài ra,
trong một số trường hợp, chúng tôi sử dụng thêm một số enzyme
khác có trình tự nhận biết ở trên vector và trong trình tự gen đích.
Quá trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được minh họa với
vector tái tổ hợp pJET1.2-pagA (Hình 3.39).

Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt
a) Sơ đồ biểu hiện quá trình cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA bằng BglII;
b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA trên gel agarose 1,2%.

Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI và EcoRI,
chúng tôi đã chọn được các dòng tế bào mang plasmid chứa gen
pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng XbaI
và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như vậy, các gen đích
đã được tách dòng thành công.
Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực
Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis phân lập
cho thấy, gen vrrA giống nhau hoàn toàn, độ tương đồng từ 99-100%
so với chủng tham chiếu. Phân tích trình tự gen pagA của 3 chủng B.
anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột biến điểm
(TC), trong đó 1 đột biến đồng nghĩa (TC)195, 2 đột biến sai
nghĩa là (TC)1693 và (TC)1799 khi so sánh với chủng B. anthracis
Vollum-USA. Nghiên cứu trình tự gen cya và lef (pXO1), chỉ xác
định được 1 đột biến đồng nghĩa (TC)600 trên gen cya chủng B.
anthracis Ba3 và Ba4, còn gen lef có mức độ tương đồng 100% so
với chủng tham chiếu. Một đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới


(AG)1048 ở gen capA chủng B. anthracis Ba1 làm thay đổi axit
amin lysine thành glutamic (Hình 3.43). Hai gen còn lại là capB,

capC có tính bảo tồn cao, không xảy ra đột biến ở bất cứ điểm nào.
Các gen này đã được đăng ký trên Genbank với mã số: KP213102-7;
KP759885-93.

Hình 3. 43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen
capA 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu

Với Y. pestis, gen ypo2088 và caf1 của 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2
có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Chỉ có 1 đột
biến điểm được xác định ở gen pla (TC)836 khi so sánh với chủng
Y. pestis Angola. Trình tự phân tích các gen được đăng ký trên
Genbank với mã số KM880025-7.
Như vậy, kỹ thuật mPCR được thiết kế xác định đồng thời B.
anthracis, Y. pestis và thử nghiệm dựa trên các chủng phân lập trong
nước hoàn toàn có thể chẩn đoán cho các chủng từ các khu vực khác
trên thế giới.
3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và
Y. pestis
Kỹ thuật mPCR xác định nhanh, đồng thời B. anthracis và Y.
pestis được phát triển thành kit BaYp-mPCR, kiểm định tại Viện
kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm, Bộ Y tế cho kết quả đạt
tiêu chuẩn cơ sở, độ nhạy, độ đặc hiệu 100% trên panel mẫu chuẩn.


Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG
THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis
Kỹ thuật mPCR cho phép tiết kiệm thời gian, kinh phí và đóng
vai trò quan trọng trong chẩn đoán phân tử. Thực tế, việc nghiên cứu
thiết kế mPCR tối ưu đòi hỏi nhiều công đoạn hơn so với PCR thông

thường. Các thành phần tham gia trong phản ứng cũng như chu trình
nhiệt cần được đánh giá, tối ưu. Đồng thời, việc nghiên cứu, thiết kế
mồi trong mPCR có vai trò rất quan trọng. Đối với 2 tác nhân B.
anthracis và Y. pestis, cần chỉ ra được chủng gây bệnh (có đầy đủ
độc lực) hay không. Với B. anthracis, gen pagA (pXO1) được WHO
khuyến cáo sử dụng bởi khi chủng B. anthracis thiếu gen này sẽ
không thể gây độc. Ngoài ra, gen capA (pXO2) được lựa chọn nhiều
trong chẩn đoán (Skottman, 2007; Kurosaki, 2009). Một gen đích
nữa được sử dụng để phát hiện tất cả các chủng vi khuẩn than là vrrA
nằm trên nhiễm sắc thể - có tính ổn định cao và bền vững. Trong xác
định Y. pestis, pla, caf1, ypo2088 là các gen đích thường được sử
dụng, cho phép chẩn đoán chính xác Y. pestis. Như vậy, cần thiết kế 6
cặp mồi trong mPCR cho xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis. Khi thực hiện mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản
phẩm không đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa các mồi tăng lên. Do đó, sau
khi nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu mPCR là điều kiện tiên quyết để
hạn chế tối đa những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi cũng như
việc tạo thành các sản phẩm phụ.
Cho đến trước nghiên cứu này, có rất ít công trình phát triển kỹ
thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis cũng như
các tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp các cặp mồi chẩn đoán
xác định cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và gen độc lực trên
plasmid cùng chứng nội tại để xác minh kết quả. Hầu hết các công
trình chỉ lựa chọn một trong các gen đích độc lực trên plasmid
(Batra, 2013; Safari Foroshani, 2013; Whiteduck-Leveillee, 2016),
như vậy sẽ không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của các
chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể bỏ sót chẩn đoán. Để khắc phục
hạn chế này, một số nghiên cứu đã kết hợp cả gen trên nhiễm sắc thể
và gen độc lực, tuy nhiên lại trên từng tác nhân riêng rẽ (Chen, 2012;
Ogawa, 2015; Riojas, 2015; Lindsey, 2017). Mặt khác, nhiều công

trình lại không thiết kế chứng nội tại để kiểm soát kết quả chẩn đoán
lâm sàng. Kỹ thuật mPCR được phát triển trong luận án sử dụng 6
cặp mồi trong đó có cả chứng nội tại để phát hiện nhanh, đồng thời
và chính xác B. anthracis và Y. pestis gây bệnh bằng cách kết hợp 1
gen đích trên nhiễm sắc thể và 2 gen đích độc lực trên plasmid cho
mỗi loại tác nhân. Đặc biệt, chúng tôi đã thiết kế IC cạnh tranh
(Abdulmawjood, 2002; Hoorfar, 2004), sử dụng chung cặp mồi chẩn
đoán là capAF1/R1. Như vậy, sẽ không phải thiết kế thêm cặp mồi
cho IC và công đoạn tối ưu sẽ được rút ngắn. Như vậy, kỹ thuật
mPCR có chứa 6 cặp mồi cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm
gồm 3 gen đích của B. anthracis, 3 gen đích của Y. pestis và 1 gen
IC. Kỹ thuật này đã cung cấp một công cụ hữu ích góp phần xác định
nhanh, đồng thời 2 tác nhân vi khuẩn có nguy cơ cao sử dụng làm vũ
khí sinh học này chỉ trong một ống phản ứng, giúp giảm giá thành,
công sức và thời gian chẩn đoán.
4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN
CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
Kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis sau
khi thiết kế, tối ưu thành công đã được chế tạo thử nghiệm thành kit
(kit BaYp-mPCR). Để đảm bảo chất lượng, kit mới chế tạo phải được
đánh giá với các tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn
định trên các bộ mẫu chuẩn - điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit
chẩn đoán nào trước khi đưa vào thử nghiệm thực địa (WHO, 2004;
Bunk, 2007; Madej, 2010; NIBSC, 2014). Các loại mẫu chuẩn dùng
trong kiểm định có thể tìm trong danh mục của WHO hoặc NIBSC là
lý tưởng nhất. Tuy nhiên, khi không có các loại trên thì thiết lập các
bộ mẫu chuẩn nội bộ là cần thiết (Belak, 2001), đặc bệt với B.
anthracis và Y. pestis là 2 loài vi khuẩn tối nguy hiểm, không có sẵn

mẫu chuẩn. Các chủng chuẩn sử dụng trong tách chiết DNA cho thiết
lập mẫu chuẩn nội bộ đều được kiểm tra, đánh giá tính chất sinh vật,
hóa học điển hình. Các mẫu DNA có độ tinh sạch và nồng độ cao
được sử dụng làm mẫu chuẩn. Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ
đồng nhất cao và có thể pha loãng thành các nồng độ chính xác, cũng
là hướng thiết lập được WHO khuyến cáo. Giá trị ngưỡng phát hiện
cho B. anthracis và Y. pestis tương ứng là 81,5 và 130,5 copy/phản
ứng, tương đương với kết quả của các công trình đã công bố (Heinz


Ellerbrok, 2002; Batra, 2013; Nghiem, 2015), độ nhạy 100% thử
nghiệm trên số mẫu đủ lớn là 100, đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu cho thấy, nếu chỉ sử dụng 1 gen trên
nhiễm sắc thể (vrrA) có thể chẩn đoán nhầm giữa B. anthracis và B.
cereus (Bode, 2004; Rasko, 2004). Mặt khác, nếu chỉ dựa vào 1 gen
trên plasmid thì nguy cơ âm tính giả với chủng mất một trong các
plasmid độc lực. Với B. anthracis, để khẳng định là vi khuẩn than
gây bệnh cần có mặt đồng thời 3 gen là vrrA, pagA, capA. Kết quả
này cũng minh chứng cho yêu cầu phải kiểm định trên panel mẫu với
tất cả các kit thương mại trước khi đưa ra thị trường. Như vậy, các bộ
panel độ nhạy và độ đặc hiệu được thiết lập là đảm bảo và có ý nghĩa
đánh giá giá trị khoa học của bộ kit, có khả năng kiểm định các tiêu
chuẩn của một bộ kit PCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis với
nhiều cách thiết kế mồi khác nhau.
Đánh giá kit PCR chẩn đoán trên các bộ mẫu chuẩn là kiểm định
trong điều kiện lý tưởng. Trên thực tế, B. anthracis và Y. pestis có thể
tồn tại tự nhiên hay bị gây nhiễm ngoài môi trường, là những mẫu
phức tạp, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR, đòi hỏi cần
được xác định nhanh, chính xác trong những trường hợp nghi ngờ.
Kỹ thuật mPCR này đã được thử nghiệm trên chủng chuẩn và chủng

phân lập (sau khi đã được kiểm tra tính chất sinh vật, hóa học, định
danh). Đồng thời, để có cơ sở đánh giá kỹ thuật mPCR được phát
triển cho ứng dụng xác định chủng địa phương và chủng quốc tế,
chúng tôi tiến hành phân tích trình tự toàn bộ chiều dài các gen đặc
trưng và gen độc lực tiêu biểu của B. anthracis (thuộc plasmid
pXO1, pXO2), Y. pestis (thuộc pPCP1, pMT1). Kết quả này đã cung
cấp dữ liệu nucleotide tương đối hoàn chỉnh về một số gen tiêu biểu
của các chủng B. anthracis, Y. pestis phân lập ở Việt Nam. Kỹ thuật
mPCR chứa chứng nội tại tối ưu đã xác định chính xác chủng B.
anthracis, Y. pestis riêng lẻ hay đồng thời B. anthracis và Y. pestis có
đầy đủ độc lực (B. anthracis Ba1, Ba3, Ba4, Y. pestis Yp1, Yp2) cũng
như phân biệt với chủng giảm độc (B. anthracis Ba6) hay không độc
(B. anthracis Ba2, Ba5, Ba7-Ba9, Ba11) (minh họa ở Hình 3.36).
Với trường hợp chủng B. anthracis không độc (thiếu 2 plasmid
pXO1 và pXO2), kỹ thuật mPCR này không phân biệt được với
chủng B. cereus bởi gen vrrA cũng có mặt trong các loài thuộc nhóm
“B. cereus”. Như vậy, nếu chỉ sử dụng gen vrrA rất khó phân biệt


các loài thuộc nhóm này. Điều này đã khẳng định, cần kết hợp với 2
gen đặc trưng tương ứng trên plasmid pXO1 và pXO2 để xác định
chính xác B. anthracis gây bệnh (Radnedge, 2003; Kim, 2015). Đồng
thời, mặc dù pXO1 và pXO2 được coi là đặc trưng cho B. anthracis,
có một số báo cáo chỉ ra rằng, một số chủng thuộc nhóm “B. cereus”
hiếm gặp chứa plasmid có sự tương đồng với các plasmid này
(Rasko, 2007; Koehler, 2009). Trường hợp ngoại lệ này bao gồm một
thể lâm sàng nhiễm B. cereus với triệu chứng bệnh than, mang một
plasmid pXO1 giống đến 99,6% với pXO1 B. anthracis (Hoffmaster,
2004). Và một trường hợp mẫu lâm sàng từ khỉ hoang dã cỡ lớn mà
chết vì bệnh giống than, không có kiểu hình của B. anthracis, nhưng

chứa plasmid giống pXO1 và pXO2, có khả năng tạo kháng nguyên
bảo vệ và tạo vỏ. Xác định trình tự đa locus những chủng này cho
thấy chúng có quan hệ rất gần với B. anthracis và là chủng B.
cereus và B. thuringiensis độc hiếm gặp (Koehler, 2009). Đến nay,
chỉ mới có một vài trường hợp này được báo cáo trên thế giới, làm
thay đổi quan niệm cũ về bệnh than chỉ được giới hạn trong B.
anthracis (Hoffmaster, 2004; Klee, 2006; Kim, 2015). Đây là trường
hợp hiếm, cá thể khi bị nhiễm những chủng đặc biệt này đều bị tử
vong giống bệnh than, và cũng có thể được xác định bằng kỹ thuật
mPCR được phát triển này (Chun, 2012; Irenge, 2012; Girault,
2014). Như vậy, kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại tái tổ hợp
này đã cho phép xác định B. anthracis cũng như Y. pestis gây bệnh.
Kỹ thuật mPCR này đã chứng tỏ đây là công cụ hữu ích cho việc xác
định nhanh đồng thời cũng như phân biệt chính xác các chủng B.
anthracis, Y. pestis độc lực và không độc lực trong tự nhiên.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Phát triển thành công kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis.
Phát triển thành công kỹ thuật mPCR tối ưu với 6 cặp mồi và
chứng nội tại tái tổ hợp, cho phép xác định nhanh đồng thời B.
anthracis và Y. pestis, trong đó:


-

3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của B. anthracis là vrrA,
pagA, capA và 3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của Y. pestis
là ypo2088, pla, caf1 trong kỹ thuật mPCR.

- Chứng nội tại tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1 được bổ sung trong
quá trình tách chiết với nồng độ 5x104 copy/ mẫu để xác minh
kết quả chẩn đoán, tránh hiện tượng âm tính giả.
2. Đánh giá thành công khả năng phát hiện của kỹ thuật
mPCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập.
Các bộ mẫu chuẩn được thiết lập gồm bộ mẫu chuẩn DNA độ
nhạy, độ đặc hiệu riêng rẽ của B. anthracis, Y. pestis và bộ hỗn
hợp B. anthracis và Y. pestis.
Kỹ thuật mPCR có khả năng xác định đồng thời B. anthracis và
Y. pestis độc lực đạt độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ ổn
định của kit hơn 12 tháng trên các bộ mẫu chuẩn.
Đã xác định trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (nhiễm sắc thể),
các gen độc lực pagA, lef, cya (plasmid pXO1), capA, capB,
capC (plasmid pXO2) của 10 chủng B. anthracis và gen đặc
trưng ypo2088 (nhiễm sắc thể), gen độc lực pla (plasmid
pPCP1), caf1 (plasmid pMT1) của 02 chủng Y. pestis ở Việt
Nam. Các chủng B. anthracis và Y. pestis có tính ổn định cao,
không có sự biến đổi đáng kể về trình tự nucleotide so với
chủng tham chiếu.
Kỹ thuật mPCR có khả năng xác định nhanh đồng thời B.
anthracis và Y. pestis trên các chủng phân lập, cho phép phân
biệt chủng đầy đủ độc lực với chủng không đầy đủ độc lực trong
tự nhiên.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu thử nghiệm kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời
B. anthracis và Y. pestis để đánh giá bổ sung trên mẫu thực địa, sẵn
sàng sử dụng khi có tình huống tấn công sinh học và phòng chống
dịch bệnh.