Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (paphiopedilum sp )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

*****

VŨ QUỐC LUẬN

XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN
CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI
(Paphiopedilum sp.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

*****

VŨ QUỐC LUẬN

XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN
CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI
(Paphiopedilum sp.)

Chuyên ngành
Mã số

: Khoa học cây trồng
: 62.62.01.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
2.
TS. Đỗ Khắc Thịnh

2017


i

LỜI CAM ĐOAN
Các số liệu trong luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi và nhóm tác giả nghiên
cứu từ năm 2010 cho tới nay trong các đề tài và dự án của phòng Sinh học phân tử
và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên: (1) Đề tài
cấp cơ sở chọn lọc, thực hiện năm 2011-2012: Bước đầu nghiên cứu tái sinh cây
lan hài (Paphiopedilum sp.), theo quyết định số 26, ngày 14 tháng 03 năm 2011
của Viện Sinh Học Tây Nguyên. (2) Đề tài cấp cơ sở, thực hiện năm 2013-2014:
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đơn
sắc lên quá trình sinh trưởng và phát triển in vitro và ex vitro của cây lan hài
(Paphiopedilum sp.), theo quyết định số 19, ngày 25 tháng 02 năm 2013 của Viện
Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. (3) Đề tài cấp Quốc gia: Hệ thống chiếu sáng
đơn sắc – nguồn sáng nhân tạo cho nghiên cứu tái sinh và nhân giống một số
loại cây trồng nuôi cấy in vitro, mã số: 106.16-2012.32, do Quỹ Khoa học và
Công nghệ Quốc Gia (NAFOSTED) thuộc bộ Khoa học và Công nghệ quản lý. (4)
Dự án sản xuất cấp Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam: Hoàn thiện

quy trình nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
với số lượng lớn dưới hệ thống chiếu sáng đơn sắc (LED) phục vụ nhu cầu của
tỉnh Quảng Nam; nên tôi được phép sử dụng để báo cáo với những kết quả do
chính tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là
trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu
để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này.
Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017
Người cam đoan

Vũ Quốc Luận


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong cuộc sống của mỗi con người, ai cũng phải có một ước mơ, một hoài bão,
một lý tưởng cho riêng mình. Nhưng điều đó có thể thực hiện được hay không là do
sự quyết tâm của bản thân, cũng như sự giúp đỡ tận tình về mặt vật chất cũng như
tinh thần của những người xung quanh chúng ta. Từ những ngày chập chững tìm
hiểu về nghiên cứu khoa học cho tới nay đã được 14 năm, một quãng thời gian
không dài, nhưng nó cũng đủ để cho em hiểu “công việc của những người làm
nghiên cứu khoa học luôn đầy dãy những khó khăn và thách thức”. Để thực hiện
được ước mơ khám phá những điều mới lạ, chúng ta cần phải có một quãng thời
gian đủ dài cùng với lòng say mê và làm việc một cách nghiêm túc.
Cảm ơn Thầy Dương Tấn Nhựt đã giúp em bay cao hơn, xa hơn và thực hiện
được những ước mơ, hoài bão, lý tưởng của mình. Thầy đã truyền cho em niềm say
mê làm việc, say mê nghiên cứu khoa học, được làm những việc mình yêu thích là
một niềm hạnh phúc vô cùng lớn.
Cảm ơn Thầy Đỗ Khắc Thịnh (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền

Nam), đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Viện Khoa
học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài này.
Cảm ơn toàn thể anh chị em tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên nơi tôi
thực hiện các nội dung chính trong đề tài luận án, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành luận án này.
Cuối cùng xin gởi lời cảm ơn thiêng liêng nhất đến gia đình, vợ, con luôn là
nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ trong suốt quá trình làm luận án.
Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017
Tác giả luận án

Vũ Quốc Luận


iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ i
Lời cảm ơn...................................................................................................................ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ............................................................................................. xiii
Danh mục bảng ........................................................................................................ xiv
Danh mục hình ........................................................................................................xvii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài .......................................................... 3
5. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................... 3

Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về lan hài (Paphiopedilum) ............................................................. 4
1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................................. 4
1.1.2. Nguồn gốc phân bố ........................................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm hình thái - đặc trưng của lan hài ...................................................... 5
1.1.4. Sinh thái ............................................................................................................ 8
1.1.5. Giá trị kinh tế của lan hài ............................................................................... 12
1.1.6. Sự suy thoái và tuyệt chủng của các loài lan hài ngoài tự nhiên ................... 13
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro của
thực vật ..................................................................................................................... 13
1.2.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây............... 13
1.2.1.1. Tuổi của cây ................................................................................................. 14
1.2.1.2. Tuổi của mô và cơ quan ............................................................................... 14
1.2.1.3. Tình trạng sinh lý ......................................................................................... 14
1.2.1.4. Điều kiện phát triển ...................................................................................... 14
1.2.1.5. Vị trí của mẫu cấy ........................................................................................ 15


iv

1.2.1.6. Kích thước của mẫu cấy ............................................................................... 15
1.2.1.7. Vết thương .................................................................................................... 15
1.2.1.8. Phương pháp cấy ......................................................................................... 15
1.2.1.9. Ảnh hưởng của ánh sáng .............................................................................. 16
1.2.1.10. Ảnh hưởng của chất khoáng ...................................................................... 16
1.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật..................................................................................................... 17
1.3.1. Auxin ............................................................................................................... 17
1.3.2. Cytokinin ......................................................................................................... 17
1.3.3. Gibberellin ...................................................................................................... 17

1.4. Vai trò của ánh sáng đối với thực vật ............................................................. 19
1.4.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của thực vật............................. 19
1.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình quang hợp ........................................ 19
1.4.3. Ánh sáng và quang phát sinh hình thái ........................................................... 21
1.4.3.1. Thụ quan ánh sáng đỏ (phytochrome) ở thực vật ........................................ 21
1.4.3.2. Các thụ quan ánh sáng xanh dương ở thực vật ........................................... 21
1.4.4. Ánh sáng nhân tạo trong vi nhân giống cây trồng .......................................... 23
1.4.4.1. Cơ sở của việc sử dụng LED đỏ và LED xanh dương trong nghiên cứu ............. 25
1.4.4.2. Ảnh hưởng của đèn LED đến sinh lý cây trồng ........................................... 26
1.4.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED trong nuôi cấy in vitro ............. 27
1.5. Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến quá trình sinh trưởng in vitro .......... 29
1.5.1. Ảnh hưởng của peptone đến quá trình sinh trưởng in vitro ........................... 29
1.5.2. Ảnh hưởng của bột khoai tây đến quá trình sinh trưởng in vitro ................... 29
1.5.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình sinh trưởng in vitro ......................... 30
1.5.4. Ảnh hưởng của bột chuối đến quá trình sinh trưởng in vitro ......................... 31
1.6. M t số nghiên c u tái sinh và nh n giống in vitro trên đối tượng lan hài .. 31
1.6.1. Các kết quả nghiên cứu về tái sinh và nhân giống trên đối tượng lan hài
được công bố trên các tạp chí trong nước. ............................................................... 32


v

1.6.2. Các kết quả nghiên cứu tái sinh và nhân giống trên đối tượng lan hài
được đăng trên các tạp chí ngoài nước.. .................................................................. 33
1.6.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống trên đối tượng lan hài ................... 33
1.6.2.2. Tái sinh và nhân giống bằng phương pháp gieo hạt ................................... 33
1.6.2.3. Tái sinh và nhân giống từ chồi đỉnh ............................................................ 36
1.6.2.4. Tái sinh và nhân giống thông qua mô sẹo và PLB....................................... 36
1.6.2.5. Tái sinh và nhân giống thông qua hình thành chồi trực tiếp ....................... 39
1.6.2.6. Tái sinh và nhân giống thông qua chồi nách ............................................... 39

1.6.2.7. Tái sinh và nhân giống bằng phương pháp gây vết thương ........................ 40
1.6.2.8. Tái sinh và nhân giống in vitro bằng phương pháp cắt đốt, cắt theo
chiều dọc và ngang thân cây con in vitro ................................................................. 41
1.6.2.9. Tái sinh chồi và nhân giống từ phát hoa ..................................................... 42
1.6.2.10. Những ưu và nhược điểm của các phương pháp nhân giống lan hài ........ 42
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 44
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 44
2.1.1. Nguồn mẫu từ hạt ............................................................................................ 44
2.1.2. Nguồn mẫu chồi non ....................................................................................... 44
2.1.3. Nguồn mẫu chồi non chồi non ngoài vườn ươm được kéo dài dưới nguồn
sáng khác nhau .......................................................................................................... 44
2.1.4. Nguồn mẫu in vitro.......................................................................................... 46
2.1.5. Thiết bị - dụng cụ ............................................................................................ 46
2.1.6. Thiết bị chiếu sáng .......................................................................................... 46
2.1.6.1. Đèn huỳnh quang ......................................................................................... 46
2.1.6.2. Hệ thống chiếu sáng LED ............................................................................ 46
2.1.7. Giá thể trồng và điều kiện nuôi cấy in vitro và ex vitro ................................. 47
2.1.7.1. Giá thể trồng cây con ................................................................................... 47
2.1.7.2. Điều kiện chiếu sáng và nhiệt độ ................................................................. 48
2.2. Phương pháp nghiên c u ................................................................................. 48
2.2.1. Phương pháp gieo hạt ..................................................................................... 48


vi

2.2.2. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non .................................................... 48
2.2.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân .............................................. 48
2.2.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt ........................................................... 49
2.2.5. Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo .................................................. 49
2.2.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt ..................... 49

2.2.7. Phương pháp hủy đỉnh .................................................................................... 49
2.2.8. Phương pháp gây vết thương .......................................................................... 50
2.3. N i dung nghiên c u ........................................................................................ 50
2.3.1. Phương pháp gieo hạt .................................................................................... 50
2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Khả năng nảy mầm của hạt 3 loài lan hài trên các môi
trường khoáng khác nhau ......................................................................................... 50
2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau đến
sự sinh trưởng của chồi 3 loài lan hài nuôi cấy in vitro ........................................... 51
2.3.2. Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh ............................................... 51
Thí nghiệm 3. Khảo sát thời gian khử trùng chồi non của 3 loài lan hài ngoài
vườn ươm................................................................................................................... 51
2.3.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân ........................................... 51
2.3.3.1. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự
kéo dài lóng thân của 3 loài lan hài ngoài vườn ươm .............................................. 52
2.3.3.2. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của mẫu cấy có nguồn gốc từ các điều kiện
chiếu sáng khác nhau đến khả năng tái sinh chồi in vitro của 3 loài lan hài........... 52
2.3.3.3. Thí nghiệm 6. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh chồi từ
mẫu cấy đốt thân ngoài vườn ươm 3 loài lan hài ..................................................... 52
2.3.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt......................................................... 53
2.3.4.1. Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả
năng kéo dài chồi in vitro của 3 loài lan hài ............................................................ 53
2.3.4.2. Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 lên khả năng kéo dài
chồi in vitro của 3 loài lan hài ................................................................................... 54


vii

2.3.4.3. Thí nghiệm 9. Kéo dài chồi in vitro của 3 loài lan hài trong điều kiện
che tối hoàn toàn và khả năng sống sót của các đốt thân ngoài vườn ươm ............. 54
2.3.5. Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo ................................................ 55

2.3.5.1. Thí nghiệm 10. Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân ngoài
vườn ươm được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 loài lan hài ............. 55
2.3.5.2. Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến quá trình nhân
nhanh mô sẹo trên loài lan Vân hài .......................................................................... 55
2.3.5.3. Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA với BA và TDZ
đến quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo trên loài lan Vân hài ..................................... 56
2.3.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt ................. 57
2.3.6.1. Thí nghiệm 13. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng tạo PLB
trên loài lan hài ......................................................................................................... 57
2.3.6.2. Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với TDZ, BA và KIN lên
quá trình nhân nhanh PLB trên loài lan hài ............................................................. 57
2.3.6.3. Thí nghiệm 15. Ảnh hưởng của nguồn gốc PLB khác nhau lên khả
năng hình thành chồi trên loài lan hài ...................................................................... 57
2.3.7. Phương pháp hủy đỉnh .................................................................................. 59
Thí nghiệm 16. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh
lên khả năng tạo chồi bên của 3 loài lan hài ............................................................ 59
2.3.8. Phương pháp gây vết thương......................................................................... 60
Thí nghiệm 17. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết
thương đến khả năng kích thích tạo chồi bên của 3 loài lan hài .............................. 60
2.3.9. Ảnh hưởng của các hợp chất bổ sung lên quá trình sinh trưởng chồi
lan Vân hài in vitro .................................................................................................. 60
2.3.9.1. Thí nghiệm 18. Ảnh hưởng của nước dừa non đến quá trình sinh
trưởng của chồi lan Vân hài in vitro ......................................................................... 60
2.3.9.2. Thí nghiệm 19. Ảnh hưởng của bột khoai tây lên quá trình sinh trưởng
của chồi lan Vân hài in vitro ..................................................................................... 61


viii

2.3.9.3. Thí nghiệm 20. Ảnh hưởng của peptone lên quá trình sinh trưởng của

chồi lan Vân hài in vitro............................................................................................ 61
2.3.9.4. Thí nghiệm 21. Ảnh hưởng của bột chuối lên quá trình sinh trưởng của
chồi lan Vân hài in vitro............................................................................................ 62
2.3.10. Trồng cây con 3 loài lan hài ra điều kiện vườn ươm ................................. 62
Thí nghiệm 22. Ảnh hưởng của giá thể đến quá trình sinh trưởng cây con 3 loài
lan hài ........................................................................................................................ 62
2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu ............................................ 63
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 64
3.1. Phương pháp gieo hạt ...................................................................................... 64
3.1.1. Khả năng nảy mầm của 3 loài lan hài trên các môi trường khoáng khác
nhau ........................................................................................................................... 64
3.1.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng và
phát triển chồi của 3 loài lan hài nuôi cấy in vitro................................................... 67
3.2. Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh................................................ 70
Thời gian khử trùng của chồi non của 3 loài lan hài ngoài vườn ươm .................... 70
3.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt th n ............................................ 73
3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau lên sự kéo dài lóng thân
của 3 loài lan hài ngoài vườn ươm ........................................................................... 73
3.3.2. Ảnh hưởng của mẫu cấy có nguồn gốc từ các điều kiện chiếu sáng khác
nhau đến khả năng tái sinh chồi in vitro của 3 loài lan hài ..................................... 78
3.3.3. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân ngoài
vườn ươn của 3 loài lan hài ...................................................................................... 81
3.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt .......................................................... 85
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến khả năng
kéo dài chồi của 3 loài lan hài in vitro ..................................................................... 85
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan 3 loài lan
hài in vitro ................................................................................................................. 88


ix

3.4.3. Sự kéo dài chồi in vitro trên 3 loài lan hài trong điều kiện che tối hoàn
toàn và khả năng sống sót của các vị trí đốt thân ngoài vườn ươm ......................... 94
3.5. Phương pháp nh n giống thông qua mô sẹo ................................................ 99
3.5.1. Khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu chồi non ngoài vườn ươm được
kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 loài lan hài........................................ 99
3.5.2. Ảnh hưởng của TDZ và 2,4-D đến quá trình quá trình nhân nhanh mô
sẹo trên loài lan Vân hài ......................................................................................... 101
3.5.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA với BA và TDZ đến quá trình tái
sinh chồi từ mô sẹo lan Vân hài .............................................................................. 102
3.6. Phương pháp nh n giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt ............... 104
3.6.1. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng PLB trên 3 loài lan hài ....... 104
3.6.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp của 2,4-D với TDZ, BA, KIN đến quá trình
nhân nhanh PLB trên 3 loài lan hài ........................................................................ 105
3.6.3. Ảnh hưởng của nguồn gốc PLB khác nhau đến khả năng hình thành chồi
trên 3 loài lan hài .................................................................................................... 107
3.7. Nh n giống bằng phương pháp hủy đỉnh .................................................... 109
Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo
chồi bên của 3 loài lan hài ...................................................................................... 109
3.8. Phương pháp g y vết thương ........................................................................ 113
Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương đến khả
năng kích thích tạo chồi bên của 3 loài lan hài ...................................................... 113
3.9. Ảnh hưởng của các hợp chất bổ sung đến quá trình sinh trưởng chồi
lan Vân hài in vitro ................................................................................................ 115
3.9.1. Ảnh hưởng của nước dừa non lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân
hài in vitro ............................................................................................................... 115
3.9.2. Ảnh hưởng của bột khoai tây lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân
hài in vitro ............................................................................................................... 116
3.9.3. Ảnh hưởng của peptone lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in
vitro ......................................................................................................................... 118

x

3.9.4. Ảnh hưởng của bột chuối lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài
in vitro ..................................................................................................................... 119
3.10. Trồng c y con 3 loài lan hài ra điều kiện vườn ươm ................................ 121
Ảnh hưởng của giá thể đến quá trình sinh trưởng cây con 3 giống lan Vân hài,
lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ngoài vườn ươm ............................................... 122
3.11. Quy trình tái sinh và nh n giống lan hài ................................................... 128
3.11.1. Quy trình tái sinh và nhân giống lan hài bằng phương pháp cắt đốt trên 2
giống lan Vân hài và lan hài Hồng .......................................................................... 128
3.11.2. Quy trình tái sinh và nhân giống lan hài bằng phương pháp tạo mô sẹo
từ lát cắt ngang lóng thân lan Vân hài..................................................................... 129
3.11.3. Quy trình tái sinh và nhân giống lan hài bằng phương pháp gây vết
thương trên 3 loài lan hài. ....................................................................................... 130
3.11.4. Quy trình tái sinh và nhân giống tối ưu (phương pháp hủy đỉnh) trên 3
loài lan hài ............................................................................................................... 131
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 132
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 132
4.2. Đề nghị............................................................................................................. 133
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN ............... 135
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 136
PHỤ LỤC


TRANG TIN VỀ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Tên đề tài luận án: “Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây
lan hài (Paphiopedilum sp.)”
Chuyên ngành: Khoa học cây trồng; Mã số: 62.62.01.10

Họ tên nghiên cứu sinh: Vũ Quốc Luận
Khóa đào tạo: 2010 - 2014
Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
(2) TS. Đỗ Khắc Thịnh
Cơ sở đào tạo: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung luận án:
Trong đề tài này, các phương pháp khác nhau đã được áp dụng nhằm đánh giá hiệu quả
của từng phương pháp lên quá trình tái sinh và nhân giống tối ưu trên đối tượng hoa lan hài.
Kết quả cho thấy, các phương pháp nuôi cấy in vitro có hiệu quả hơn so với phương pháp nhân
giống truyền thống.
Trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau, chồi non ex vitro được kéo dài tốt nhất trong
điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh và có sự phân đốt rõ rệt thu được trên 2 giống lan Vân
hài và lan hài Hồng với chiều dài chồi (9,11 và 11,00 cm). Trên giống lan hài Tam Đảo, chồi có
sự kéo dài nhưng sự kéo dài các lóng thân là chưa rõ ràng (3,82 cm). Các chồi này sau đó được
khử trùng, cắt thành từng đốt và cấy lên môi trường SH lỏng với giá thể bông gòn, có bổ sung 1
mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8. Kết quả thu được chồi non tái sinh tối ưu
bằng phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân với tỷ lệ (48,45%; 44,90%; 25,3%) trên 3
giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo.
Phương pháp nhân giống tối ưu thu được từ phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên
trên cả 3 giống lan Vân hài và lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61;
5,48; 6,00 chồi/mẫu) trên môi trường SH lỏng với giá thể bông gòn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L
TDZ, 30 g/L sucrose.
Những kết quả mới của luận án:
Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chồi non lan hài ex vitro nuôi cấy dưới điều kiện
chiếu sáng LED và chiếu sáng ngắt quãng đã tạo ra sự phân đốt rõ rệt và nguồn vật liệu này đã
khắc phục được những khó khăn trong quá trình tạo mẫu in vitro ban đầu. Tạo callus từ lát cắt


ngang của lóng thân trên đối tượng lan Vân hài và phương pháp cắt đốt trồng trực tiếp ra vườn
ươm trên đối tượng lan hài Hồng.

Trong quá trình nghiên cứu, đề tài đã đưa ra thêm một phương pháp nhân giống mới trong
nghiên cứu in vitro trên đối tượng lan hài (phương pháp hủy đỉnh).
Xây dựng được quy trình tái sinh và nhân giống tối ưu trên đối tượng lan hài.
Tập thể Người hướng dẫn

Nghiên cứu sinh

PGS.TS. Dương Tấn Nhựt

NCS. Vũ Quốc Luận


xii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
100B

: 100% ánh sáng LED xanh

100R

: 100% LED đỏ

2,4-D

: acid 2,4-Dichlorophenoxyacetic

30R:70B

: 30% ánh sáng LED đỏ + 70% ánh sáng LED xanh

50R:50B

: 50% ánh sáng LED đỏ + 50% ánh sáng LED xanh

70R:30B

: 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh

90R:10B

: 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh

AC

: Than hoạt tính

B5

: Môi trường Gamborg, 1968

BA

: Benzyl adenine

BG

: Bông gòn

CGL

: Cầu giấy lọc

CS

: Cộng sự

CW

: Nước dừa

D

: Điều kiện tối

ĐC

: Đối chứng

Fr

: Ánh sáng đỏ xa (Far-red) có bước sóng 730 nm

GA3

: acid gibberellic

Gr

: LED xanh lá cây

KIN

: Kinetin

LED

: Light-emitting diode

MS

: Môi trường Murashige và Skoog, 1962


xiii

NAA

: Acid -napthaleneacetic

P.

: Paphiopedilum

PLB

: Protocorm-Like Body

R

: Ánh sáng đỏ (Red) có bước sóng 650 nm

SH

: Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972

TDZ

: Thidiazuron

VW

: Môi trường Vacin và Went, 1949

W

: LED trắng

Y

: LED vàng


xiv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các nhóm lan hài Việt Nam xếp theo các thứ hạng bảo tồn của
IUCN ..................................................................................................... 13
Bảng 2.1

Các trị số năng lượng của photon ........................................................... 26

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng
của chồi lan Vân hài sau 90 ngày nuôi cấy ........................................... 68
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng
của chồi lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy ........................................ 69
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng của
chồi lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy.......................................... 69
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng
thân ngoài vườn ươm giống lan Vân hài ............................................... 75
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng
thân ngoài vườn ươm giống lan hài Hồng ............................................. 76
ả

6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng
thân ngoài vườn ươm giống lan hài Tam Đảo ....................................... 76

Bảng 3.7. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan Vân hài
in vitro ................................................................................................... 86
Bảng 3.8. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan hài
Hồng in vitro.......................................................................................... 88
ả

Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan hài
Tam Đảo in vitro ................................................................................... 88

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan Vân hài in vitro ... 91
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro . 91
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in
vitro........................................................................................................ 92

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của điều kiện che tối đến sự kéo dài chồi in vitro lan Vân
hài .......................................................................................................... 96


xv

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của điều kiện che tối đến sự kéo dài chồi in vitro lan hài
Hồng ...................................................................................................... 97
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của điều kiện che tối đến sự kéo dài chồi in vitro lan hài
Tam Đảo ................................................................................................ 97
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của vị trí đốt thân đến khả năng sống sót và phát triển
ngoài vườn ươm sau 12 tháng ............................................................... 98
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ngoài vườn ươm
được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 loài lan hài sau 75
ngày nuôi cấy....................................................................................... 100
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa auxin và cytokinin đến quá trình tái
sinh chồi từ mô sẹo trên giống lan Vân hài. ........................................ 103
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của sự kết hợp của 1 mg/L 2,4-D với TDZ, BA, KIN đến
quá trình nhân nhanh PLB của 3 loài lan hài. ..................................... 107
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương
kích thích sự tạo chồi bên lan Vân hài trên môi trường lỏng với giá thể
bông gòn .............................................................................................. 114
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương
kích thích sự tạo chồi bên lan hài Hồng trên môi trường lỏng với giá
thể bông gòn. ....................................................................................... 114
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương
kích thích sự tạo chồi bên lan hài Tam Đảo trên môi trường lỏng với
giá thể bông gòn. ................................................................................. 115
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của nước dừa non đến quá trình sinh trưởng in vitro của
chồi lan Vân hài ................................................................................... 116

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của bột khoai tây đến quá trình sinh trưởng in vitro của
chồi lan Vân hài ................................................................................... 117
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của peptone đến quá trình sinh trưởng in vitro của chồi lan
Vân hài................................................................................................. 119


xvi

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của bột chuối đến quá trình sinh trưởng in vitro của chồi
lan Vân hài ........................................................................................... 120
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót, sinh trưởng và phát
triển của cây con lan Vân hài ngoài vườn ươm sau 24 tháng ............. 123
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót, sinh trưởng và phát
triển của cây con lan hài Hồng ngoài vườn ươm sau 24 tháng ........... 123
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót, sinh trưởng và phát
triển của cây con lan hài Tam Đảo ngoài vườn ươm sau 24 tháng ..... 124


xvii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Hình thái cây và hoa lan hài (Paphiopedilum) ........................................ 8

Hình 1.2.

Các loài lan hài đã được xác định tại Việt Nam .................................... 11

Hình 1.3.

Các loài lan hài đã được xác định tại Việt Nam .................................... 12

Hình 2.1.

Nguồn mẫu chồi non ngoài vườn ươm sử dụng trong nghiên cứu
tái sinh in vitro ...................................................................................... 44

Hình 2.2.

Chồi non của 3 loài lan hài được nuôi trong các điều kiện chiếu
sáng khác nhau ...................................................................................... 45

Hình 3.1.

Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự nảy mầm
của hạt 3 loài lan hài sau 90 ngày nuôi cấy ........................................... 66

Hình 3.2.

Tỷ lệ nảy mầm của 3 loài lan hài trên 5 môi trường khoáng khác
nhau sau 90 ngày nuôi cấy..................................................................... 66

Hình 3.3.

Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng
chồi 3 loài lan hài nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy .................... 69

Hình 3.4.

Chồi non in vitro của 3 loài lan hài tái sinh trên môi trường SH sau
90 ngày nuôi cấy ................................................................................... 71

Hình 3.5.

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh
chồi non lan Vân hài sau 90 ngày nuôi cấy ........................................... 72

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh
chồi non lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy ......................................... 72

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh
chồi non lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy................................... 73

Hình 3.8.

Chồi lan Vân hài ngoài vườn ươm được nuôi trong các điều kiện
chiếu sáng khác nhau sau 120 ngày....................................................... 75

Hình 3.9.

Chồi non ngoài vườn ươm được nuôi trong các điều kiện chiếu
sáng khác nhau sau 120 ngày ................................................................ 77

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở
giai đoạn ngoài vườn ươm đến quá trình tái sinh in vitro lan Vân

hài sau 45 ngày nuôi cấy ....................................................................... 79


xviii

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở
giai đoạn ngoài vườn ươm đến quá trình tái sinh in vitro lan hài
Hồng sau 45 ngày nuôi cấy ................................................................... 80
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở
giai đoạn ngoài vườn ươm đến quá trình tái sinh in vitro lan hài
Tam Đảo sau 45 ngày nuôi cấy ............................................................. 80
Hình 3.13. Chồi lan hài tái sinh in vitro từ nguồn mẫu được nuôi cấy trong
điều kiện chiếu sáng khác nhau sau 45 ngày nuôi cấy .......................... 81
Hình 3.14. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân
ngoài vườn ươm lan Vân hài sau 45 ngày nuôi cấy .............................. 83
Hình 3.15. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân
ngoài vườn ươm lan hài Hồng sau 45 ngày nuôi cấy ............................ 83
Hình 3.16. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân
ngoài vườn ươm lan hài Tam Đảo sau 45 ngày nuôi cấy ...................... 84
Hình 3.17. Chồi non 3 loài lan hài tái sinh in vitro trên các giá thể khác nhau
sau 45 ngày nuôi cấy ............................................................................. 84
Hình 3.18. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau lên quá trình kéo
dài chồi 3 loài lan hài in vitro sau 120 ngày nuôi cấy ........................... 87
Hình 3.19. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan hài in vitro sau
120 ngày nuôi cấy................................................................................. 92
Hình 3.20. Cây con in vitro được nhân giống bằng phương pháp cắt đốt sau
90 ngày nuôi cấy................................................................................... 94
Hình 3.21. Kéo dài chồi in vitro lan hài Hồng và cắt đốt trồng trực tiếp ra
vườn ươm .............................................................................................. 98
Hình 3.22. Ảnh hưởng của TDZ và 2,4-D đến quá trình quá trình nhân nhanh

mô sẹo sau 75 ngày nuôi cấy trên giống lan Vân hài. ......................... 102
Hình 3.23. Nhân giống lan Vân hài thông qua mô sẹo từ lát cắt ngang của
lóng thân. ............................................................................................. 104


xix

Hình 3.24. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng PLB trên 3 loài lan
hài ........................................................................................................ 105
Hình 3.25. Ảnh hưởng của nguồn mẫu được cảm ứng từ 3 phức hợp chất điều
hòa sinh trưởng đến khả năng hình thành chồi từ các cụm PLB của
3 loài lan hài ........................................................................................ 108
Hình 3.26. Nhân giống 3 loài lan hài thông qua phát sinh PLB có nguồn gốc
từ hạt .................................................................................................... 108
Hình 3.27. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh
đến khả năng tạo chồi bên của giống lan Vân hài sau 90 ngày nuôi
cấy........................................................................................................ 111
Hình 3.28. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh
đến khả năng tạo chồi bên của giống lan hài Hồng sau 90 ngày
nuôi cấy ............................................................................................... 111
Hình 3.29. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh
đến khả năng tạo chồi bên của giống lan hài Tam Đảo sau 90 ngày
nuôi cấy ............................................................................................... 112
Hình 3.30. Nhân giống 3 loài lan hài bằng phương pháp hủy đỉnh sau 90 ngày
nuôi cấy ............................................................................................... 112
Hình 3.31. Nhân giống 3 loài lan hài bằng phương pháp gây vết thương sau
60 ngày nuôi cấy.................................................................................. 115
Hình 3.32. Chồi lan Vân hài nuôi cấy trên môi trường có thêm các hợp chất
bổ sung sau 90 ngày nuôi cấy .............................................................. 121
Hình 3.33. Ảnh hưởng của giá thể khác nhau đến quá trình sinh trưởng của

cây con ở giai đoạn vườn ươm sau 24 tháng. a. Lan Vân hài; b.
Lan hài Hồng; c. Lan hài Tam Đảo. .................................................... 125
Hình 3.34. a. Cây con của 3 loài lan hài sinh trưởng trên giá thể dớn Đài
Loan; b. cây con được lấy ra khỏi giá thể ........................................... 126


xx

Hình 3.35. Cây trưởng thành của 3 loài lan hài sinh trưởng và phát triển ngoài
vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên; a. Lan Vân
hài; b. Lan hài Tam Đảo; c. Lan hài Hồng .......................................... 127


1

MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, lan hài là một trong những loài lan khó nhân giống vô tính

nhất, cho tới nay, có rất ít công bố về nhân giống vô tính in vitro thành công trên
đối tượng lan hài [32], [65], [80]. Đây là loài lan có giá trị kinh tế cao, một số giống
lan hài quý hiếm có giá 10000 USD/cây như loài Paphiopedilum volonteanum [6].
Lan hài có đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm ngoài tự nhiên, nhân giống bằng
phương pháp tách cụm thường mất từ 2 - 5 năm chỉ thu được 2 - 3 cây mới từ cây
mẹ [121], [105] và tỷ lệ hạt nảy mầm trong tự nhiên rất thấp, do đó, rất hiếm gặp
cây con ngoài tự nhiên [22]. Hiện nay, để thu được cây con với số lượng lớn người
ta tiến hành gieo hạt lan hài in vitro. Vì vậy, những nỗ lực trong việc nhân giống vô
tính là những vấn đề đặc biệt quan tâm và thách thức đáng kể cho việc nghiên cứu

loài lan khó tính này.
Ở Việt Nam có nhiều loài lan hài quý hiếm và đặc hữu có giá trị thương mại
cao (P. delenatii, P. callosum, P. gratrixianum…). Tuy nhiên, tất cả những loài này
đang có nguy cơ bị tuyệt chủng do nạn khai thác quá mức và môi trường sống thu
hẹp. Các công bố về tái sinh và nhân giống cây lan hài thu được kết quả rất hạn chế
vì các tác giả vẫn chưa tìm được phương pháp nhân giống tối ưu, môi trường phù
hợp, các điều kiện tác động khác ảnh hưởng đến quá trình tái sinh và nhân giống
trên các loài lan này. Do vậy, đề tài “Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên
cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (Paphiopedilum sp.)” được thực hiện
nhằm giải quyết các vấn đề trên. Việc tìm hiểu các kỹ thuật để tái sinh và nhân
giống có ý nghĩa rất lớn cho công tác nhân giống, đóng một vai trò quan trọng góp
phần làm giảm sự khai thác trái phép ngoài tự nhiên, đồng thời có ý nghĩa trong
việc bảo tồn cũng như làm cơ sở cho quá trình lai tạo giống sau này.


2

2.

Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1.

Mục tiêu
Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan

hài (Paphiopedilum sp.). Phương pháp thực hiện đơn giản, dễ dàng áp dụng vào
thực tế, cho hệ số nhân giống cao, cây con sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh
trong nuôi cấy in vitro và ex vitro.
2.2.

Yêu cầu của đề tài
Tìm ra các phương pháp thích hợp nhằm gia tăng tỷ lệ tái sinh của mẫu cấy

in vitro ban đầu và đánh giá tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật kết hợp
với các phương pháp nhân giống khác nhau như: phương pháp gây vết thương,
phương pháp cắt đốt, phương pháp hủy đỉnh… nhằm mục đích gia tăng hệ số nhân
giống lan hài cao hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống.
3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1.

Ý nghĩa khoa học của đề tài
Có ý nghĩa trong nghiên cứu về sinh lý thực vật, nhân giống vô tính thực vật,

khoa học cây trồng. Tìm ra phương pháp tái sinh từ chồi non ngoài vườn ươm trên
đối tượng lan hài mà các công trình nghiên cứu từ trước tới nay đều gặp khó khăn
trong quá trình tạo mẫu ban đầu, khắc phục được các khó khăn trong vấn đề nhân
giống và tìm ra được phương pháp nhân giống tối ưu.
3.2.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Đưa ra hướng tuyển chọn nguồn mẫu ban đầu phù hợp như: thu mẫu ban

đầu, thao tác rửa mẫu cấy, khử trùng mẫu cấy dễ dàng nhằm nâng cao khả năng tái
sinh của mẫu cấy trong quá trình tạo mẫu in vitro. Xây dựng được quy trình nhân
giống đơn giản với hệ số nhân giống cao và ổn định, tạo nguồn nguyên liệu cho việc
sản xuất giống thương mại. Tìm ra các yếu tố tác động đến quá trình tái sinh và

nhân giống lan hài như: nguồn mẫu ban đầu, môi trường nuôi cấy, giá thể, chất điều
hòa sinh trưởng, phương pháp áp dụng cho từng giai đoạn trong quá trính nuôi cấy.
Tạo được số lượng lớn cây giống phục vụ cho ngành trồng hoa trên quy mô công