Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh ( Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
----------∗∗∗----------

VŨ THỊ HẠT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH
HƢỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN
GEN TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis) THÔNG QUA VI
KHUẨN Agrobacterium rhizogenes
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC
Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS.PHẠM BÍCH NGỌC
Th.S. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2012


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và
sâu sắc nhất đến TS. Phạm Bích Ngọc - Viện Công nghệ sinh học và
ThS. La Việt Hồng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, TS. Lê
Văn Sơn, đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới CN. Nguyễn Đình Trọng

cùng toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh
học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm
việc quý báu trong suốt quá trình em hoàn thành khóa luận này.
Và hơn hết, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những
người đã động viên và luôn bên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012
Sinh viên
Vũ Thị Hạt


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến
hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông
qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi
dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Bích Ngọc- Viện Công nghệ sinh học và
ThS. La Việt Hồng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2012
Sinh viên
Vũ Thị Hạt


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG - BIỂU
ĐỒ DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU......................................................................

1

1. Đặt vấn đề.................................................................
1

2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................
3

3. Yêu cầu của đề tài.....................................................
3

4. Ý nghĩa của đề tài.....................................................
3

NỘI DUNG..................................................................
4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................
4

1.1. Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh.................
4
1.2. Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào
thực vật.............
5
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong
nước.......................................
5
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài
nước......................................

5
1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp
chuyển gen vào tế bào thực vật
8
1.3.1. Các phương pháp chuyển gen trực
tiếp..............................
8
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen gián
tiếp.............................
11
1.3.2.1. Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes................
12


1.3.2.2. Các yếu tố ảnh
hưởng đến hiệu quả
biến nạp gen thông
qua
Agrobacterium rhizogenes...............................................................................
14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU................................................................................................................
16
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết
bị
16
2.1.1. vật liệu

16


k2.1.2. Hóa

16

chất.............................................................................................

16

2.1.3. Máy móc và thiết bị...............................................................................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................16
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật............................................17
2.2.2. Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes............18
2.2.3. Phương pháp nhuộm X – gluc...............................................................19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................
3.1. Ảnh hưởng của kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng và phát

19

triển của mô sâm Ngọc Linh tự nhiên..........................................................
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện biến nạp lên sự sinh trưởng và phát triển

21

của mô sâm Ngọc Linh...................................................................................22
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp.........................23
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp........
3.3. Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes

25

vào mô sâm Ngọc Linh bàng phương pháp nhuộm X – gluc..........................27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 27
1. Kết luận.......................................................................................................27
2. Kiến nghị.....................................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 28
Tiếng Việt........................................................................................................28
Tiếng Anh........................................................................................................29
Trang web tham khảo......................................................................................30
PHỤ LỤC....................................................................................................


DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch nhuộm X-gluc
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của cacbe và cefo tới sinh trưởng của mô sâm Ngọc
Linh
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến sự sống sót của mô sâm Ngọc
Linh
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót của
mô sâm Ngọc Linh

Danh mục biểu đồ
Biểu đồ 3.1. Số mô Sâm Ngọc Linh sống sót sau 3 tuần trên môi trường chứa
cefotaxim với nồng độ khác nhau
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến số mô sâm Ngọc Linh sống
sót sau 4 ngày

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót
của mô sâm Ngọc Linh


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh
Hình 1.2. Sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro
Hình 1.3. Nuôi cấy rễ tơ G. glabra
Hình 1.4. Cấu trúc plasmid Ri
Hình 3.1. Mô sâm Ngọc Linh úa vàng sau 3 tuần để trong tủ tối
Hình 3.2. Cơ chế nhuộm mô tế bào bằng X-gluc
Hình 3.3. Kết quả nhuộm gen gus bằng X-gluc


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Gus

: β-glucuronidase

AS

: Acetosyringone

SH

: Schenk & Hildebrandt

Cefo

: Cefotaxim

Vanco

: Vancomycin

Cacbe

: Carbecillin

X – gluc : 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronide


MỞ ĐẦU
Sâm

1. Đặt vấn đề

Ngọc

Linh

(Panax

vietnamensis) là loại dược liệu hết sức
quý hiếm, chỉ phân bố ở vùng núi cao
trong sơn hệ Ngọc Linh thuộc một số ít
huyện của Kon Tum và Quảng Nam. Vào
năm 1973, cây Sâm Ngọc Linh đầu tiên
được DS. Đào Kim Long và các nhà khoa
học phát hiện ở độ cao 1800 m ở vùng núi

Ngọc Linh thuộc Kon Tum. Tới năm 1988,
TS. Hà Thị Dụng và GS. Grushvisky đã
xác định đây là một loài sâm mới trên thế
giới và đặt tên khoa học là Panax
vietnamensis Ha et Grushv, mà mọi người
thường gọi là sâm Việt Nam [10], [12].
Theo các nghiên cứu khoa học, sâm
Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm,
kích thích hệ miễm dịch, chống lão hóa,
phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan,
tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao
huyết áp ở người huyết áp thấp...Hợp
chất hóa học saponin chứa trong sâm Ngọc
Linh là thần dược với sức khỏe con người
khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán
trên thị trường với giá cao, vào năm 2005
và năm 2008 1kg tươi sâm Ngọc Linh –
Quảng Nam có giá 12-15 triệu đồng, nhưng
lúc khan hiếm có thể lên tới 25-30 triệu
đồng; trong khi đó 1kg tươi sâm Triều
10


Tiên chỉ có

đề tài khoa học được thực hiện với mục

giá

đích bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh

khoảng

4 triệu đồng
[15].

như:

Hiện

i) nghiên cứu nhân giống cây sâm

nay 1kg sâm

Ngọc Linh, nghiên cứu về điều kiện

Ngọc

Linh

trồng trọt. Tuy nhiên việc nhân giống

có giá lên tới

sâm Ngọc linh ngoài tự nhiên rất khó

60

khăn do hạt không đảm bảo tỉ lệ sống

triệu

đồng. Do lợi

sót và đặc tính di truyền.

ích quá lớn
sâm

Ngọc

Linh

trở

thành

đối

tượng

săn

tìm của con
người

và

hậu quả dẫn
tới

năm

1993

sâm

Ngọc

Linh

được

xếp

đầu

bảng

trong

sách

đỏ thực vật
Việt Nam có
nguy

cơ

tuyệt chủng.

Chính vì vậy
mà có nhiều
11


ii)nghiên cứu nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh thông qua kĩ
thuật phát sinh phôi vô tính. Đây được xem là giải pháp tối ưu tạo
nguồn cung cấp cây giống sâm quanh năm, không những bảo tồn sâm
Ngọc Linh mà còn tiến tới sản xuất sâm Ngọc Linh thương phẩm với
quy mô lớn. Tuy nhiên thời gian nuôi trồng kéo dài cũng xảy ra tình
trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian được phép thu hoạch.
Do vậy các chế phẩm từ sâm Ngọc Linh cũng được sản xuất rất ít, thậm
chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu.Trước thực trạng trên một giải
pháp tối ưu được đưa ra là tạo nguồn dược phẩm ổn định bằng công nghệ sinh
khối tế bào sâm Ngọc Linh [5].
Công nghệ sinh khối tế bào thực vật đơn giản là nuôi vô tính các dòng
tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sử dụng cho việc tách chiết các
hoạt chất. Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra mô sẹo từ những tế bào,
mô đã bị biệt hóa ở thực vật, sau đó chúng được làm giảm hoặc mất tính biệt
hóa và được thuần hóa trên môi trường nuôi cấy và cuối cùng là tăng khối
lượng trên hệ thống các bình nuôi cấy lớn (Bioreactor).
Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc
mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết phải bổ sung các chất
điều tiết sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong
các trở ngại lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dư của các chất điều
tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản
phẩm và sức khỏe người sử dụng. Tuy nhiên việc này hoàn toàn có thể khắc
phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ.
Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Điều đặc biệt là rễ tơ

có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản


phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh
cao, kĩ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinh
khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp
hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp [11]. Xuất phát từ những lý do trên tôi
đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả
chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình chuyển gen tạo rễ
tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834.
3. Yêu cầu của đề tài
- Sử dụng chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 biến nạp vào cây sâm
Ngọc Linh.
- Xác định ảnh hưởng của một số chất kháng sinh và một số điều kiện biến
nạp tới hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp một phương pháp mới trong nghiên cứu sản
xuất sinh khối sâm Ngọc Linh quy mô phòng thí nghiệm.
- Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp tài liệu nghiên cứu về ảnh hưởng của một số
yếu tố (chất kháng sinh, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, thời
gian đồng nuôi cấy...) tới khả năng tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua vi
khuẩn A. rhizogenes.


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh cùng họ Araliaceae, cùng chi Panax với sâm Triều
Tiên, thuộc loại cây thân thảo, cao 80 - 100 cm. Thân rễ nằm ngang trên hoặc
dưới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang rễ con và củ. Thân rễ có sẹo, nhiều đốt. Các
thân mang lá.
Tương ứng với một thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm.
Trên đỉnh của thân mang lá là các lá mọc vòng, có 5 - 7 lá chét với phiến lá
hình trứng ngược. Hoa mọc giữa các lá thẳng với thân. Quả dài độ
0,8 - 1,0 cm, rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, màu đỏ khi chín. Cây mọc dưới tán
rừng. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ củ, cũng có thể dùng lá và rễ
con [12].

Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis)
theo www.vncreatures.net

Hình 1.2. Sâm Ngọc Linh
trong nuôi cấy in vitro

Rễ củ sâm Ngọc Linh chứa tới 50 loại saponin (sâm triều Tiên có
khoảng 25 loại saponin) và cập nhật những kết quả nghiên cứu mới nhất cho
thấy danh sách saponin của sâm Ngọc Linh lên tới 52 loại. Như vậy, sâm Việt
Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự


một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới.
Riêng trong lá sâm Ngọc Linh cũng đã phân lập được 13 chất saponin [9].
Thời gian sinh trưởng loại cây này chậm, cần tới 5 năm mới có thể bắt
đầu thu hoạch được củ sâm và cần tới 7 - 10 năm mới thu được sâm chất
lượng tốt.

1.2. Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Những năm gần đây cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước ta
hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản sản xuất các sản
phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển.
Trong nỗ lực tạo nguồn dược phẩm ổn định từ sâm Ngọc Linh phải kể
đến thành công của nhóm nghiên cứu của Học Viện Quân Y trong nghiên cứu
tạo sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. Nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện quy
trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo đến
nuôi cấy trong Bioreator 15 lít.
Tại Việt Nam, cũng đã có một số tác giả nghiên cứu thành công tạo rễ
bất định từ mô sẹo và nhân sinh khối rễ đó để thu hoạch. Nghiên cứu chỉ ra
thời gian thu hoạch được rễ sâm Ngọc Linh như trên chỉ mất khoảng bốn
tháng mà vẫn đảm bảo được hàm lượng saponin thiết yếu của sâm.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính
toàn năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực
phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp,... vừa tạo ra ngyên liệu, vừa giúp bảo tồn
nguồn gen quý hiếm.
Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế
cao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:


(i) các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi
cấy tế bào Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ
cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được
hàm lượng Berberin đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể
thu được sau 4 tuần nuôi cấy).
(ii)các chất khác dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu

(Anthocyanin,crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành, và mùi tỏi).
(iii)

các chất khác như shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và

Paclitaxel. Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor
10 000 lít trong sản xuất reserpine trong thời gian 30 ngày, tương
đương với lượng hàng năm cả thế giới thu được từ cây rễ đó.
Với nhân sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ
huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất quý.
Hiện nay, một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn
Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong
sản xuất các sản phẩm chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh
tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương,
các loại mỹ phẩm.
Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ Nhân sâm với
bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này được làm
nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên
thị trường. Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ
nuôi cấy sinh khối rễ tơ [4].


Bảng 1.1. Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ
Họ thực vật
Araliaceae
Apocynaceae
Asteraceae
Cucurbitaceae
Fabaceae
Ginkgoaceae

Nyssaceae

Hợp chất

Cây thuốc
Panax

Các

ginseng

ginsenosid

Rauwolfia

Ajmalicin,

micrantha

Ajmalin

Saussurea

Jaceosidin

medusa
Gynostemma

Gypenosid

pentaphyllum

(Saponin)

Pueraria

Puerarin

phaseoloides
Gingko biloba
Camptotheca
acuminate

Tác dụng

chính

Ginkgolid

Camptothecin

Bổ, tăng lực, chống stress
Hạ huyết áp
Kháng ung thư
Một số tác dụng sinh học
Hạ nhiệt, co thắt, hạ áp,
chống loạn nhịp
Phòng chống bệnh tim
mạch và tuổi già

Kháng ung thư, kháng
virus

Hình 1.3. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
a: Nuôi cấy rễ tơ bằng hệ thống
bioreactor
b,c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30
ngày nuôi cấy

(theo o/content/vol11/issue2/full/6)


1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp chuyển gen vào tế bào thực vật
Kĩ thuật chuyển gen ở thực vật là kĩ thuật đưa một hoặc nhiều gen lạ
vào hệ gen của tế bào chủ. Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp
nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang
gen chuyển.
Nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng để đưa gen vào tế bào
động vật và thực vật. Kĩ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(micro injection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. các phương pháp
phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid - DNA
(liposome), vector vius, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium…Tùy thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn
phương pháp chuyển gen phù hợp [6].
1.3.1. Các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm ( mild sonication)
Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen trực tiếp vào các tế bào trần.
Huyền phù tế bào trần được trộn với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong
muốn và gen chọn lọc. Sau đó, cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập
trong huyền phù tế bào trần 3 mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20 kHz

theo từng nhịp ngắn 110 mili giây. Tổng thời gian tác động khoảng 500- 900
mili giây. Tế bào trần sau khi xử lý siêu âm được nuôi trong các môi trường
chọn lọc để tách các tế bào đã nhận được DNA và tái sinh thành cây [2].
Chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện (electroporation)
Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp
xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời
gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho DNA
bên ngoài có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị môt huyền
phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần
chuyển vào thực vật.


Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao (200- 400 V/cm) trong khoảng
thời gian 4-5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ
thủng tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập gắn vào hệ gen
của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvet chuyên dụng. Sau quá
trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường chọn lọc để tách các
protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cấy in vitro, tái sinh cây và
chọn lọc cây chuyển gen [6].
Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)
Bắn gen là phương pháp linh hoạt để chuyển gen vào nhân, ty thể và
lục lạp, mở ra rất nhiều triển vọng đối với việc chuyển gen vào các cây một lá
mầm và các cây hạt trần, các đối tượng thực vật mà việc tạo ra cây chuyển
gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium không hiệu quả. Phương pháp này cho
phép chuyển gen vào hầu hết các mô, cơ quan thực vật, không chỉ ở cây mô
hình mà ở ngay cả những cây giá trị.
Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ (vi
đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5
– 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bào
thực vật. Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích

thước 0,5- 0,9 cm. Đĩa kim loại này được gắn vào một đầu viên đạn lớn
(macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước
vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi
với vận tốc cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới
thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớn
tới 130m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô,
tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Gen cần chuyển có thể tham gia
vào bộ gen của tế bào. Mục tiêu của công tác chọn tạo giống bằng chuyển gen
là phải chọn lọc được các thể có mặt các gen chuyển vào nằm trong bộ gen


của tế bào. Có như vậy thì đặc tính này mới có thể di truyền lại cho các thế hệ
sau. Việc chọn lọc này rất công phu và khó khăn. Gần đây, người ta đã cải tiến
súng bắn gen theo hướng không sử dụng viên đạn lớn mà sử dụng bộ phận nén
khí mạnh tạo áp lực đẩy vi đạn. Thường sử dụng luồng khí Heli áp lực cao.
Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có thuận lợi do dễ tiến hành và đặc biệt
đối tượng nhận gen có thể đa dạng (ở mô, phôi, tế bào và tế bào trần) [6].
Chuyển gen bằng phương pháp hóa học
Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen
vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG). Ở
nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa
mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý
2+

nồng độ cao của Ca hoặc ở nồng độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển
nạp vào trong tế bào trần [6].
Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen
không qua nuôi cấy in vitro. Phương pháp chuyển gen qua ống phấn được
Ray Wu và các cộng sự ở trường Đại học Cornell (Mỹ ) đề xuất năm 1998

trên đối tượng cây lúa. Nguyên tắc của phương pháp là DNA ngoại lai chuyển
vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen là
vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt đầu đưa tinh trùng vào thụ tinh.
Theo các tác giả cho biết tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá
trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy sự chuyển
gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không
hình thành thể khảm [2].
Chuyển gen bằng vi tiêm (micro injection)
Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết
bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Kĩ thuật


này có ưu điểm là: lượng DNA được biến nạp là tùy ý và xác định, DNA
được đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm chí là nhân tế bào. Có thể áp dụng
đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kĩ
thuật khác không thể thực hiện được và có thể biến nạp vào các loài cây
trồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm. Tuy nhiên phương
pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa được
DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi các kĩ thuật viên có
kĩ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [6].
1.3.2. Các phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp
Chuyển gen nhờ virus
Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ xâm
nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Tuy nhiên để trở thành vector chuyển
gen thì virus cần có những tiêu chuẩn sau:
 Genome virus là DNA chứ không phải RNA.
 Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ thành tế
bào.
 Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào.
 Có phổ kí chủ rộng.

 Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể.
Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, do
virus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây
chuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính. Điều này
không phải thực hiện được với tất cả các loài cây. Đây chính là một nhược
điểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [6].
Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được chuyển vào tế bào thực
vật nhờ cơ chế đặc trưng thông qua loài vi khuẩn đất gram (-) là
Agrobacterium làm trung gian [6].


Ưu điểm :
- Số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thấp. Do vậy giảm
thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khă năng chuyển gen
bền vững, hiệu quả chuyển gen cao.
- Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm.
- Kĩ thuật đơn giản dễ thực hiện.
- Không đòi hỏi kĩ thuật đắt tiền. Nhược
điểm:
Phương pháp này sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm. Nhưng
hiệu quả chuyển gen ở các cây một lá mầm còn thấp, trong khi, nhiều cây một
lá mầm là cây lương thực quan trọng như: lúa, ngô, lúa mì…
Tuy nhiên, gần đây các phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium
đã thành công ở một số cây hòa thảo một lá mầm như: lúa. Trong trường hợp
này người ta dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp
hoặc trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất dẫn dụ acetosyringone.
1.3.2.1. Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí,
khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu chứng

bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ. Agrobacterium thuộc họ
Rhizobiacae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens,
Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi.
Trong đó A. tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài được nghiên cứu nhiều
nhất gây ra bệnh khối u (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí
tổn thương của thực vật hai lá mầm.
A.rhizogenes gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm. A.rhizogenes mang Ri
(root-inducing) plasmid, và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây
bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm [8]. Khi tế bào thực vật bị


thương tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một
đoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ.
Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng lượng phân
tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Dựa
vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ - nguồn cacbon và nitơ cho vi
khuẩn, Ri-plasmid được chia làm hai nhóm chính: agropine và mannopine và
một số nhóm phụ được tìm thấy và phân loại sau này như: cucumopine và
mikimopine. Trong đó các chủng thuộc nhóm agropine (A4, 15834,
LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn so với các chủng thuộc nhóm
mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này được sử dụng chủ yếu
trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật [3].
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là
vùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều có kích
thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA này
sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang
các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2), vùng TL-DNA bao gồm
18 khung đọc (ORFs) trong đó có bốn loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA,
B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc
nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu

trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng
khuyết gen rolD [3].
Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm
ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây
nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ đặc điểm
sinh trưởng, phân nhánh mạnh và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ
bình thường. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả,
khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ
tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [3].


Hình 1.4. Cấu trúc plasmid Ri
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua
Agrobacterium rhizogens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một
loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả
năng tái sinh hoàn chỉnh cây chuyển gen từ các tế bào và mô mang gen
chuyển nạp. Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì
tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn, các yếu tố
liên quan đến thực vật và một số yếu tố khác. Các yếu tố liên quan đến vi
khuẩn bao gồm chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt
tính của gen vir khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector. Các yếu
tố liên quan đến thực vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng
phân bào của tế bào đích… [6]. Mật độ vi khuẩn cũng ảnh hưởng tới hiệu
quả chuyển nạp T- DNA. Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng
chuyển T- DNA của các gen vir. Tăng khả năng biểu hiện của các gen vir
đạt được bằng cách gây tiền cảm ứng vi khuẩn với hợp chất phenol như
acetosyringone (AS).
Ngoài ra, pH của môi trường lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp đến
sự chuyển nạp T-DNA vào tế bào thực vật. Khả năng cảm ứng gen vir tăng

khi giá trị pH dao động từ 5,2- 5,8.


Nhiệt độ thích hợp cho chuyển nạp T- DNA phụ thuộc vào loài và mô
o

thực vật. Ở cây một lá mầm, nhiệt độ đồng nuôi cấy thường là 24 -25 C, một
o

o

số trường hợp là 28 C. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (<23 C) có khả năng
chuyển T- DNA và chuyển gen bền vững đã được đánh giá.