Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylimun BHN2

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI
2 KHOA SINH – KTNN
...............

ĐỖ THỊ NGA

TỐI ƢU HÓA MÔI TRƢỜNG DINH
DƢỠNG CHO VIỆC TẠO MÀNG BC TỪ
CHỦNG
VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM BHN2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật

GVHD: TS. Dƣơng Minh Lam
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, 2012


LỜ I CẢ M ƠN
Em xin gƣ̉ i lờ i cả m ơn chân thà nh tớ i TS. Dƣơng Minh Lam và
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễ
n Khắ c Thanh đã hƣớ ng dẫ n, chi bảo tận tình, giúp đơ và tạo điều kiện
cho để em thƣ̣ c hiệ n và hoà n thà nh tố t khó a luậ n nà y.
Em xin chân thà nh cả m ơn Ban Giá m Hiệ u trƣờ ng ĐHSP Hà Nội
2, khoa Sinh-KTNN, phòng thi nghiệm vi sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ
bộ môn vi sinh, ban bả o vệ đã tạ o điề u kiệ n giú p đỡ em.
Em xin cả m ơn sƣ̣ giú p đỡ quan tâm độ ng viên củ a bạ n bè ,
gia đì nh trong suố t quá trì nh hoà n thà nh khó a luậ n.
Em xin chân thà nh cả m ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Sinh viên

Đỗ Thị Nga


LỜ I CAM ĐOAN

Để đả m bả o tí nh trung thƣ̣ c của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tà i củ a tôi không sao ché p bấ t cƣ́ tà i liệ u sẵ n có nào.
2. Đề tà i củ a tôi không trù ng lặ p vớ i mộ t đề tà i nà o khá c.
3. Kế t quả thu đƣợ c trong đề tà i là do tƣ̣ bả n thân tôi nghiên cƣ́
u thƣ̣ c tiễ n đả m bả o tí nh chí nh xá c và trung thƣ̣ c.
Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Tác giả

Đỗ Thị Nga


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục các từ viết tắt
Danh mục hình và bảng biểu
MỞ ĐẦU.........................................................................................................2
1. Lý do chọn đề tài.........................................................................................2
2. Nội dung của đề tài......................................................................................3
3. Ý nghĩa của đề tài........................................................................................3
4. Mục tiêu của đề tài......................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................4

1.1. Vị tri và đặc điểm phân loại của A.xylinum trong sinh giới......................4
1.1.1. Vị tri phân loại của A.xylinum..............................................................4
1.1.2. Đặc điểm phân loại của A.xylinum.......................................................5
1.2. Nhu cầu dinh dƣơng của vi khuẩn A.xylinum..........................................7
1.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon...............................................................7
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật..................................................................8
1.2.3. Nguồn dinh dƣơng khoáng....................................................................8
1.2.4. Các chất kích thich sinh trƣởng.............................................................9
1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Bacterial cellulose........................10
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của Bacterial cellulose.............................................10
1.3.2. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose...................................................... 11
1.3.3. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum...........................12
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay.............................. 12
1.4.1. Trên thế giới.......................................................................................... 12
1.4.2. Tại Việt Nam.........................................................................................13


CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất.......................................................... 14
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 14
2.1.2. Hóa chất................................................................................................14
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................... 14
2.1.4. Môi trƣờng nghiên cứu.........................................................................15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................15
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh.............................................................................15
2.2.1.1. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng...................15
2.2.1.2. Phƣơng pháp hoạt hoá giống..............................................................16
2.2.1.3. Phƣơng pháp lên men tạo màng.........................................................16
2.2.2. Phƣơng pháp hoá sinh...........................................................................16
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tinh catalase.................................................................16

2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rƣợu êtylic thành acid acetic.................17
2.2.2.3. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic..............................................17
2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyển hoá glucose thành acid............................18
2.2.2.5. Phát hiện khả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton.......18
2.2.2.6. .6. Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer..............................................18
2.2.2.7. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose...............................................19
2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng tạo màng BC của môi trƣờng
tuyển chọn.......................................................................................................19
2.2.4. Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng tƣơi của màng BC........................19
2.2.5. Phƣơng pháp quy hoạch hóa toán học thực nghiệm (phƣơng pháp
Box – Wilson)..................................................................................................19
2.2.5.1. Thiết lập mô hình toán học.................................................................19
2.2.5.2. Tối ƣu hóa..........................................................................................23
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê......................................................24


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................25
3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 trên
các môi trƣờng khác nhau...............................................................................25
3.2. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển của chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2..............................................................................................26
3.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng dinh dƣỡng cho chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN2...............................................................................................................29
3.3.1. Thiết lập mô hình toán học tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy.......................30
3.3.2. Tối ƣu....................................................................................................39
3.4. Xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC ở quy mô
phòng thi nghiệm.............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 43
1. Kết luận....................................................................................................... 43
2. Kiến nghị..................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 44


DANH MỤ C CÁ C TƢ̀ VIẾ T TẮ T
A.xylinum :

Acetobacter xylinum

MC

:

Microbial cellulose

BC

:

Bacterial cellulose

PC

:

Plant cellulose

CFU :

Colony Forming Unit

OD

:

Optical Density

cs

:

Cộ ng sƣ̣


DANH MỤ C BẢ NG BIỂ U
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur
(1950)
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nƣớc dừa
Bảng 1.4. Các vitamin có trong nƣớc dừa
Bảng 1.5. Các acid amin có trong nƣớc
dừa Bảng 2.1. Ma trận thực nghiệm

Bảng 3.1. Khảo sát khả năng tạo màng của A.xylinum BHN2
Bảng 3.2. Động thái sinh trƣởng và tổng hợp cellulose của chủng A.xylinum
BHN2
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của
màng BC
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến

khối lƣợng tƣơi của

màng BC
Bảng 3.6. Các yếu tố và mức khảo sát
Bảng 3.7. Ma trận thực nghiệm
Bảng 3.8. Bảng kiểm tra sự thich ứng của mô hình
Bảng 3.9. Tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng dinh dƣơng


DANH MỤ C HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩ n A.xylinum BHN2
Hình 1.2. Khuẩ n lạ c củ a A.xylinum
BHN2 Hình 1.3.Sợi cellulose của màng
BC
Hình 1.4. Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.5. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Hình 2.1. A.xylinum BHN2 trên môi trƣờng thạch nghiêng
Hình 2.2. Hoạt tính calatase củ a A.xylinum BHN2
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của
màng BC
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến độ dày của màng BC
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của
màng BC
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của
màng BC
Hình 3.6. Màng BC thu đƣợc sau lên men chƣa xử
lý Hình 3.7.

Màng BC sau khi xử lý đem sấy khô

TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Acetobacter xylinum là loài vi khuẩ n có khả năng sinh tổng hợp
màng BC trên môi trƣờng dịch thể trong điều kiện nuôi cấy tĩnh hiệu quả nhất
trong tự nhiên. Màng BC có bản chất là sự kết hợp giữa cellulose và tế bào vi
khuẩn A.xylinum. Màng BC có cấu trúc hóa học và đặc tinh cơ học
giống với cellulose của thực vật nhƣng có thêm một số tinh chất hóa lý đặc
biệt nhƣ: độ bền học, đƣờng kinh sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tinh đàn hồi
lớn, khả năng polymer hóa rất lớn. Ngoài ra, màng BC còn là một hàng rào
c ản oxi và các sinh vậ t khá c, ngăn cả n sƣ̣ phân hủ y cá c cơ chấ t ở trong
tế bà o và ngăn cả n tá c độ ng củ a tia UV… Nhờ những thuộc tinh đặc biệt
trên mà màng BC đƣợc sử dụng ở rất nhiều các nƣớc phát triển, ứng dụng
rộng rãi trong các lĩnh vực: công nghệ thực phẩm sản xuất thạch dừa, công
nghiệp giấy sản xuất giấy chất lƣợng cao, lĩnh vực mỹ phẩm dùng làm mặt
nạ dƣơng da. Trong lĩnh vực y học, màng BC bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu
làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu nhân tạo. Một
trong các ứng dụng đã và đang đƣợc quan tâm hiện nay là sản xuất màng
BC điều trị bỏng và tổn thƣơng da [6]. Đặc biệt, hiện nay nhu cầu về
màng trị bỏng rất cao nhƣng đều phải nhập ngoại với giá thành rất lớn và
chất lƣợng không nhƣ mong muốn.
Công trình tập trung nghiên cứu môi trƣờng tối ƣu cho chủng
A.xylinum lên men tạo màng BC, xử li và bảo quản màng BC.
So với các nghiên cứu về A.xylinum trƣớc đó thì công trình của tôi đã
tìm ra đƣợc một số kết quả mới là: môi trƣờng tối ƣu cho chủng A.xylinum
cho màng dày, dai, nhẵn là glucose 19,347g; KH2PO4 1g; (NH4)2SO4 2,549g;
tiến hành xử lý, bảo quản màng trên quy mô phòng thi nghiệm.

1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang trở thành một ngành kĩ thuật chủ
đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh với
những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp,
y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà lại
không liên quan tới vi sinh vật.
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khi bắt buộc,
hoá dƣơng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rƣợu, nƣớc ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trƣờng dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
Bacterial cellulose (màng BC). Đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với
phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer-1,4 glucopyranose không phân nhánh đƣợc tổng hợp từ một số loài vi
khuẩn khi nuôi cấy chúng trên môi trƣờng dịch lỏng. Hầu hết các nghiên cứu
đều chi ra rằng A.xylinum là loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có hiệu quả cao
nhất.
Màng BC do A.xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tinh cơ học
giống với cellulose của thực vật nhƣng có thêm một số tính chất hóa lý đặc
biệt nhƣ: độ bền học, đƣờng kinh sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn,
khả năng thấm hút nƣớc nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy BC
đƣợc ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ.
Với mong muốn tìm ra môi trƣờng dinh dƣơng tối ƣu cho chủng vi
khuẩn A.xylinum và những ứng dụng hữu ích của màng BC trên cơ sở kế thừa
những kết quả thu đƣợc của các tác giả đã nghiên cứu trƣớc tôi quyết định
chọn đề tài: “Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC từ
chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2”.


2. Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu chọn lựa môi trƣờng tối ƣu cho việc tạo màng BC của
chủng A.xylinum BHN2.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng một số chất dinh dƣơng
(hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng (NH4)2SO4, hàm lƣợng KH2PO4) đến khả
năng tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2. Từ đó tối ƣu môi trƣờng tạo
màng BC của chủng đã chọn.
3.2. Nghiên cứu một số phƣơng pháp xử lý và bảo quản màng BC.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Công trình cho phép lựa chọn môi trƣờng dinh dƣơng thích hợp cho
chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tạo màng BC có chất lƣợng tốt nhất.
Tìm mô hình xử lý và bảo quản màng thu đƣợc sau lên men trên quy
mô phòng thi nghiệm.


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của A.xylinum trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của A.xylinum
Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chinh thức theo hệ thống
danh pháp quốc tế 1990.
Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút đƣợc
sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xƣa tới nay. Ngay từ
thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng. Tuy
nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn còn nhiều tranh cãi.
Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans.
Năm 1957, theo “Bergey‟s manual of determinative bacteriology” ông
đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes .
Đến năm 1974, theo “Bergey‟s manual of determinative bacteriology”.

A.xylinum lại đƣợc coi nhƣ là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi
Acetobacter và đƣợc nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc.
Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại đƣợc sắp xếp vào những vị tri
khác nhau. Theo “Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey‟s
manual of systematic bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi
khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconobacter. Vi khuẩn
A.xylinum đƣợc xếp vào chi Acetobacter.
Tới nay, đã tồn tại nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi
khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng. Vấn đề này vẫn đang gây
nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo.


1.1.2. Đặc điểm phân loại của A.xylinum
* Đặc điểm hình thái - tế bào học

(actaorl.com.br)

Hình 1.1. Vi khuẩ n A.xylinum BHN2
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kich thƣớc khoảng
2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào đƣợc bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tich luỹ
4,5% acid acetic trong môi trƣờng. Khi nồng độ acid acetic quá cao vƣợt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn. Vi khuẩn A.xylinum
thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khi bắt buộc, hoá dị dƣỡng. Tế bào của
chúng thƣờng tìm thấy trong giấm, dịch rƣợu, nƣớc ép hoa quả, trong đất.
* Đặc điểm nuôi cấy

Hình 1.2. Khuẩ n lạ c củ a A.xylinum BHN2

Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc


trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trƣờng. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trƣờng một lớp màng BC. Ngƣợc lại trong điều
kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kich thƣớc không đều
nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣơng tạo ra những đặc tinh hình
thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14].
* Đặc điểm sinh lý – sinh hoá
0

Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 35 C, pH = 4 – 6 [4]. Vì
A.xylinum có khả năng chịu đƣợc pH thấp nên ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm
acid acetic vào môi trƣờng nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [11].
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A.xylinum bao gồm: oxy
hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; phản ứng catalase dƣơng tinh;
không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer; chuyển hoá glucose thành acid;
chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; không sinh sắc tố nâu; tổng hợp
cellulose [11].
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur
(1950)
STT
1
2
3

Đặc điểm

Hiện tƣợng

Oxy hoá ethanol

Chuyển hoá môi trƣờng chứa Bromphenol

thành acid acetic

Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

Hoạt tinh catalase

Hiện tƣợng sủi bọt khi

+

Sinh khối không phát triển

_

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men

+

Sinh trƣởng trên môi
trƣờng Hoyer

Kết quả
+

Chuyển hoá
4

glycerol thành
dihydroxyaceton

5

Chuyển hoá glucose

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc

thành acid

trên môi trƣờng chứa CaCO3

+


6
7

Kiểm tra khả năng

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

sinh sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn A.xylinum
1.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tinh chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử
enzim, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp
chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh
vật. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC:
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Nguồn cacbon
Monosaccharide

Năng suất
tổng hợp
cellulose

Nguồn cacbon
Disaccharide

Năng suất
tổng hợp

cellulose

D-Glucose

100

Lactose

16

D-Fructose

92

Maltose

7

D-Galactose

15

Sucrose

33

D-Xylose

11

Cellobiose

7-11

D-Arabinos

14

D-Sorbose

11


1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên
liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử
aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên
+

sinh chất [4]. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4 .
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ.
Do đó khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ
vô cơ là (NH4)2SO4 , NH4NO3; nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao
nấm men [4]. Môi trƣờng cơ bản cho các nghiên cứu về BC là môi trƣờng do
Hestrin và Scharamm thiết lập [29].
1.2.3. Nguồn dinh dƣỡng khoáng
Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố
khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần
của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dƣỡng phospho, ngƣời ta sử dụng các loại
phospho vô cơ nhƣ KH2PO4, K2HPO4,…[4]. Việc bổ sung phosphat (nhất là

phosphat kali) vào các môi trƣờng dinh dƣơng còn có tác dụng tạo ra tính
đệm của môi trƣờng [4]. Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lƣợng cũng có vai
trò ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của vi khuẩn A.xylinum và quá trình hình
thành màng BC nhƣ Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong
số các nguyên tố vi lƣợng thì vi khuẩn A.xylinum không thể sinh trƣởng và
phát triển bình thƣờng đƣợc.
Đối với A.xylinum nguyên liệu chủ yếu hiện nay đƣợc sử dụng là nƣớc
dừa già, dịch hoa quả, ri đƣờng… thì khi nuôi cấy không cần phải bổ sung các
nguyên tố vi lƣợng nữa [4].


1.2.4. Các chất kích thích sinh trƣởng
Các vitamin pyridoxine, acid nicotinic, p–aminobenzoic acid (pABA),
biotin đƣợc xác định là cần thiết cho sự tăng trƣởng tế bào và tổng hợp
cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngƣợc lại [23].
Nƣớc dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu đƣợc sử dụng để nuôi cấy
A.xylinum thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành
phần hoá học trong nƣớc dừa có khác nhau. Lƣợng đƣờng khử tổng và
protein trong nƣớc dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng
thứ 9, sau đó giảm dần). Đƣờng ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose
hay sorbitol. Ngoài ra, nƣớc dừa có nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin…
phù hợp cho quá trình sinh trƣởng và hình thành màng BC của vi khuẩn
A.xylinum [14].
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nƣớc dừa
STT

Thành phần

Khối lƣợng

STT

Thành phần

Khối lƣợng

1

Chất khô

4.71

8

Fe

0.01

2

Đƣờng tổng số

2.08

9

Cu

0.04

3

Tro

0.02

10

P

3.7

4

K

3.12

11

S

3.4

5

Na

1.5

12

Protein

0.55

6

Ca

2.9

13

Dầu béo

0.74

7

Mg

3.0

14

Ti trọng

1.02

Bảng 1.4. Các vitamin có trong nƣớc dừa
STT

Vitamin

Hàm lƣợng (g/l)

1

Acid ascorbic

3

2

Penthothennic

0.052

3

Acid nicotinic

0.064

4

Acid folic

0.03

5

Riboflavin

0.00001


Bảng 1.5. Các acid amin có trong nƣớc dừa
STT

Acid amin

Hàm lƣợng(%

STT

Acid amin

Hàm lƣợng(%

khối lƣợng/

khối lƣợng/

amin tổng số)

amin tổng số)

Acid glutamic

14.5

Tyrosine

2.83

Arginine

12.75

Alamine

2.41

Leucine

4.18

Histidine

2.05

Lysine

4.51

Phenyl alanin

1.23

Proline

4.12

Senine

0.91

Aspartic

3.6

Cystein

1.17

1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Bacterial cellulose
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của Bacterial cellulose
Cellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhƣng cấu
trúc và đặc tinh của nó lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kich thƣớc 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc vandesvan tạo thành
dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thƣớc bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trƣởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất
hiện, chính vì thế mà màng BC đƣợc mở rộng.

Hình 1.3. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.4. Sợi cellulose của thực vật
1.3.2. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc đƣợc
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [11], [12].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [13].

Hình 1.5. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum


1.3.3. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn A.xylinum
Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng nhƣ
một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn A.xylinum trƣớc các nhân tố có hại
của môi trƣờng. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn
bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A.xylinum đƣợc bao bọc
bởi BC sống sót sau 1 giờ xử li bằng tia cực tim. Khi tách BC ra khỏi tế bào,
khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chi còn 3% [29].
Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đơ cho các tế bào vi khuẩn đồng
thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng một cách dễ dàng
hơn so với khi ở trong môi trƣờng lỏng không có mạng lƣới cellulose [21].
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay
1.4.1. Trên thế giới
Vi khuẩn A.xylinum BHN2 và màng BC đã thu hút đƣợc sự chú ý của
nhiều nhà khoa học trên thế giới và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công

nghệ môi trƣờng, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm…[31]. Các
nghiên cứu hiện nay về màng BC trên thế giới đã tập trung vào vấn đề sản
xuất trên quy mô công nghiệp và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các
lĩnh vực khác nhau.
Mở đầu là S. Hestrin; M. Scharmn và cs [21], [26], [25], sau là một loạt
các nghiên cứu tƣơng tự về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng
A.xylinum; ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣơng và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình sinh tổng hợp cellulose [18], [20], [22]. Nghiên cứu của R.M.
Brown và cs, K.Zaar cơ chế tổng hợp màng BC, con đƣờng chuyển hóa
cacbon trong vi khuẩn A.xylinum [17].
Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt là màng trị


bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thƣơng hở, vết bỏng và đã thu đƣợc kết
quả tốt nhƣ Wan và Millon đã đƣợc đăng ký bản quyền về làm màng BC từ
A.xylinum dùng trị bỏng [27].
1.4.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu và ứng dụng về A.xylinum và
màng BC. Các công trình nghiên cứu mới chi quan tâm tới quá trình tạo
màng, đặc tinh và cấu trúc của màng. Về ứng dụng thực tiễn, mới chi đƣợc
ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và đƣợc ứng dụng
trong sản xuất thạch dừa [7], [11], [15], [16].
Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trƣởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học
Y Dƣợc, Thành phố Hồ Chi Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo
thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phƣơng pháp lên
men. Nó có khả năng thấm nƣớc cao, kết dinh chặt và trơ về mặt hóa học nên
nó có vai trò nhƣ màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [29].
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả nhƣ Huỳnh Thị Ngọc Lan,
nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A.xylinum và hoạt

chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành
vết thƣơng của hỗn hợp Chistosan tan trong nƣớc – Bacterial cellulose –
Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phƣơng Linh,
Lê Thị Mỹ Phƣớc và Nguyễn Quốc Hiển [10].
Tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến
hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lƣợng tốt và ứng dụng
vào trị bỏng bƣớc đầu đã đạt đƣợc thành công [14].
Hiện nay mới chi có một số công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của môi
trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng Acetobacter.


CHƢƠNG 2
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 đƣợc phân lập từ màng của các
nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên
men theo phƣơng pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh, Khoa
Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất
Nguồn đƣờng: glucose, saccarose, ethanol, fructose, sorbitol...
Nguồn nitơ: Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4
Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt
Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH
Một số loại thuốc nhuộm: tim gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol
Nƣớc dừa, agar…
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thi nghiệm tôi đã sử dụng những dụng cụ

thiết bị nhƣ: nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức), box cấy vô trùng
(Haraeus, Đức), cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ), micropipep
(Gilson, Pháp), tủ lạnh (Tawasi, Nhật), kính hiển vi quang học (olympus CX41
, Nhật), hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam
kinh, la men, đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.


2.1.4. Môi trường nghiên cứu
Thành phần

MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

MT6

1. Glucozo

20 g

20 g

20 g

20 g

20 g

20 g

2. Agar

20 g

0

0

0

0

0

3. (NH4)2SO4

3g

3g

3g

3g

3g

3g

4. KH2PO4

2g

2g

2g

2g

2g

2g

5. MgSO4. 7 H2O

2g

2g

2g

2g

0

2g

6. Axit axetic

2%

2%

2%

2%

5 ml

2,5 ml

7. Rƣợu etylic

2%

2%

2%

2%

0

2%

8. Pepton

0

5g

0

5 g

0

5g

9. Nƣớc mia ép

0

0

0

200 ml

0

0

10. Nƣớc dừa

0

0

0

0

0

1000 ml

11. Nƣớc máy

1000 ml

1000 ml

1000 ml

800 ml

1000 ml

0

Chú ý: Axit axetic và rƣợu etylic đƣợc bổ sung sau khi đã khử trùng môi trƣờng
Trong đó: MT1 là môi trƣờng phân lập.
MT2 là môi trƣờng nhân giống cơ bản.
MT3…MT6 là môi trƣờng nghiên cứu khả năng tạo màng.

(cung cấ p bở i phò ng thí nghiệ m Vi sinh , Khoa Sinh – KTNN, Trƣờ ng ĐHSP Hà Nộ i 2)

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập, đƣợc sơ bộ xác định là A.xylinum
0

đƣợc cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 30 C. Sau đó
0

giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4 C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và
giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [3], [6].


Hình 2.1. A.xylinum BHN2 trên môi trƣờng thạch nghiêng

2.2.1.2. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trƣờng tiêu
0

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121 trong 20 phút. Sau đó
đem xử lý trong đèn tim 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào
và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [5].
2.2.1.3. Phương pháp lên men tạo màng
0

Sử dụng môi trƣờng lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110 C

trong 20 phút để tránh phân rã đƣờng. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tim trong
15 phút. Bổ sung vào môi trƣờng 5% giống hoạt hoá. Nuôi cấy ở điều kiện
tĩnh trong 4 - 8 ngày.
2.2.2. Phƣơng pháp hoá sinh
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi
bọt khi thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase (catalase +).
Ngƣợc lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tinh catalase (catalase -). Ngoài
ra có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã
đƣợc tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 5000 vòng/10phút, quan sát
hiện tƣợng nhƣ trên [3].