Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen ở nấm sợi aspergillus bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Trần Thị Phƣơng

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ
DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI
Aspergillus BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Trần Thị Phƣơng

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ
DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI
Aspergillus BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn
TS. Trần Đức Long

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc tới TS. Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣởng Phòng
Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời đã tận tình chỉ bảo,
hƣớng dẫn và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Trần Đức Long đã nhiệt tình góp ý, cố
vấn cho em trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp.
Em cũng vô cùng biết ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh
học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình
chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong quá trình học tập.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ
sở vật chất và môi trƣờng làm việc để em có thể hoàn thành tốt nghiên cứu của
mình. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới học viên cao học Đỗ Thị Bình Xuân Lộc
đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện các thí nghiệm.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các em, các anh chị
Phòng Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và trong cuộc
sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017
Học viên

Trần Thị Phƣơng


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
5-FOA

5 - fluoroorotic acid

A. awamori

Aspergillus awamori

A. nidulans

Aspergillus nidulans

A. niger

Aspergillus niger

A. oryzae

Aspergillus oryzae

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

AS

Acetosyringone

ATMT

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (biến
nạp trung gian/nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens)

bp

base pair

CD

Czapek Dox

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

GRAS

Generally Recognized As Safe (đƣợc công nhận là an toàn)

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

IM

Induction medium (môi trƣờng cảm ứng)

kb

kilo base pairs

LB

Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trƣờng LB)


NST

Nhiễm sắc thể

OD

Optical Density (mật độ quang)

ORF

Open reading frame (khung đọc mở)

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato Dextrose Agar

PEG

Polyethylen Glycol

PSM

Phytase-screening medium (môi trƣờng sàng lọc sinh phytase)

RB

Right border (biên phải)

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA

T-DNA

Transfer DNA

Ti plasmid

Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u)

ura

Uracil

uri

Uridine

Vir

Virulence region (vùng độc lực)

WT

Wild-type (chủng tự nhiên)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1.

Tổng quan về nấm sợi....................................................................................3

1.1.1. Đặc điểm sinh học ......................................................................................3

1.1.2. Vai trò của nấm sợi.....................................................................................5
1.1.3. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus .............................................5
1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae ............................................................6
1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. oryzae .....................................6
1.2.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae .................................................8
1.2.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae ....................................................................8
1.3. Giới thiệu chung về A. niger ...........................................................................10
1.3.1. Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. niger.....................................10
1.3.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger .................................................12
1.3.3. Vai trò của nấm sợi A. niger.....................................................................12
1.4. Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi ....................................................14
1.4.1. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) .........................................14
1.4.2. Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) ...........................................15
1.4.3. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ......15
1.5. Hệ thống marker dùng cho chuyển gen ở nấm sợi .........................................25
1.5.1. Hệ thống marker chọn lọc các thể chuyển gen.........................................25
1.5.2. Hệ thống marker chỉ thị dùng trong chuyển gen ......................................28
1.6. Promoter biểu hiện gen ở nấm sợi ..................................................................30
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................33
2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................33
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................33
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ..................................................................................34
2.1.3. Các môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...............................................36


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................38
2.2.1. Thu bào tử nấm.........................................................................................39
2.2.2. Tách chiết DNAtổng số ............................................................................39
2.2.3. Thành phần của các phản ứng PCR..........................................................40
2.2.4. Xử lý enzyme giới hạn .............................................................................41

2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ...........................................43
2.2.6. Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .......................44
2.2.7. Sàng lọc các thể chuyển gen.....................................................................46
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................48
3.1. Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen ...................................................48
3.1.1 Chủng nấm A. niger N402đƣợc lựa chọn để xóa gen ...............................48
3.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. oryzae VS1 và RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil ......................................................................................................49
3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil .....................50
3.2.1. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG .......................................................................51
3.2.2. Xóa thành công gen pyrG ở A. niger N402 ..............................................52
3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil.....58
3.3.1. Tạo vector pEX2A....................................................................................58
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/ uracil đến sự phục hồi sinh trƣởng của
chủng xóa gen pyrG ...........................................................................................59
3.3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil
............................................................................................................................61
3.3.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A. niger N402 trợ
dƣỡng ..................................................................................................................64
3.4. Biểu hiện gen DsRed ở A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector
pEX2A ...................................................................................................................65
3.4.1. Mức độ tƣơng đồng của gen pyrG ở chi Aspergillus ...............................65
3.4.2. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae ...............................................66
3.5. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA từ A.
niger .......................................................................................................................72


3.5.1. Tạo vector pEX2C ....................................................................................72
3.5.2. Biểu hiện gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua
vector pEX2C .....................................................................................................73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................79
Kết luận ..................................................................................................................79
Kiến nghị................................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật và các vector dùng trong nghiên cứu ....................33
Bảng 2.2. Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu ............................................................35


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái của một số loài nấm mốc trên đĩa petri

3

Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của A. oryzae

7

Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc hiển vi của nấm A. niger

11

Hình 1.4. Cấu trúc của Ti plasmid

17

Hình 1.5. Mô hình vi khuẩn A. tumefaciens với hệ thống vector nhị thể

20

Hình 1.6. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở nấm sợi A. oryzae

29

Hình 1.7. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm sợi A. oryzae AUT1-PlD

30

Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. niger

47

Hình 3.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của 2 chủng A. oryzae VS1 và

48

RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.3. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm Aspergillus niger

51

Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra 3 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa

52

pyrG A1, A2, A3

Hình 3.5. Quy trình xóa gen pyrG ở nấm sợi A. niger sử dụng phƣơng

53

pháp ATMT
Hình 3.6. Kết quả xóa gen trên môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1%

53

uridine, 0,1% uracil và 0,2% 5-FOA
Hình 3.7. Kiểm tra khả năng sinh trƣởng của chủng đột biến trên các môi
trƣờng khác nhau

54


Hình 3.8. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG

55

Hình 3.9. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A

57

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/uracil đến khả năng sinh

59

trƣởng của chủng đột biến xóa gen pyrG
Hình 3.11. Kết quả tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A. niger N402

61

trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.12. Quy trình tối ƣu chuyển gen vào nấm A. niger N402 trợ dƣỡng

62

bằng vi khuẩn A. tumefaciens
Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. niger N402 trợ

64

dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.14. Sự tƣơng đồng của pyrG giữa các loài Aspergillus khác nhau

65

Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil

66

Hình 3.16. Kết quả chuyển gen DsRed vào A. oryzae chủng RIB40 và VS1

67

trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng RIB40 trợ dƣỡng

68

uridine/uracil
Hình 3.18. Xác nhận chuyển gen DsRed vào A. oryzae VS1∆pyrG sử

69

dụng vector pEX2A
Hình 3.19. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2C

72

Hình 3.20. Kết quả PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector

73

pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4


Hình 3.21. Kết quả chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C vào A. niger

73

N402 và A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.22. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm A. niger N402 trợ dƣỡng

75

uridine/uracil
Hình 3.23. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng
uridine/uracil

76


MỞ ĐẦU

Aspergillus là chi nấm sợi phổ biến trong tự nhiên và có vai trò quan trọng
trong sản xuất thực tiễn. Một số loài nấm thuộc chi này đã đƣợc Cục Quản lý Thực
phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (Generally Regarded as
Safe, GRAS) dùng trong sản xuất công nghiệp nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori,
A. sojae, … Trong đó, hai loài A. niger và A. oryzae với khả năng tiết mạnh enzyme
vào môi trƣờng nuôi cấy nên đã đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất nhiều
loại enzyme thƣơng mại cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp. Gần đây, hệ gen của A.
niger và A. oryzae đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn và là tiền đề cho cải biến di
truyền nâng cao hiệu suất biểu hiện các gen mong muốn ở hai loài nấm này.
Hiện nay, hai phƣơng pháp chuyển gen phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen
thông qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần là khá phức tạp với chi phí
cao và hiệu quả không ổn định ở những lần lặp lại. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,
ATMT) lần đầu tiên đƣợc áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều
ƣu điểm nhƣ dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu suất ổn định. Tuy nhiên, phƣơng
pháp chuyển gen ATMT vẫn chủ yếu sử dụng các gen kháng kháng sinh nên khó áp
dụng vào điều kiện sản xuất thực tế vì nguy cơ phát tán gen kháng thuốc vào môi
trƣờng. Chính vì vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dƣỡng
(marker trợ dƣỡng) là hƣớng tiếp cận an toàn, hiệu quả về chi phí và có tiềm năng
ứng dụng vào sản xuất thực tiễn.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cao cho nấm sợi
Aspergillus sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens và marker trợ dƣỡng, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gene ở nấm

sợi Aspergillus bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với những nội dung
chính nhƣ sau:

1


-

Tạo chủng A. niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG.

-

Tạo một số vector nhị thể dùng để chuyển gen và biểu hiện gen ở cả hai loài
nấm sợi A. niger và A. oryzae.

-

Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu cho nấm sợi A. niger sử dụng chủng trợ
dƣỡng uridine/uracil và marker trợ dƣỡng pyrG.

-

Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng gen chỉ thị huỳnh quang đỏ
DsRed.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm sợi

1.1.1. Đặc điểm sinh học
Nấm sợi (nấm mốc) là những vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử và
sống hoại sinh nhờ khả năng tiết enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong
môi trƣờng. Chúng phân bố rộng khắp trên trái đất và đóng vai trò quan trọng trong
tự nhiên cũng nhƣ trong đời sống của con ngƣời. Nấm thƣờng sinh trƣởng trên các
bề mặt cơ chất tạo thành các dạng sợi nhƣ lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông đƣợc
gọi là hệ sợi [23].

Hình 1.1. Hình thái của một số loài nấm mốc điển hình. (A) Aspergillus fumigatus.
(B) Penicillium rubens. (C) Trichoderma sparsum. (D) Aspergillus flavus. (E)
Aspergillus oryzae. (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100]
Từ một bào tử nảy mầm, sợi nấm sẽ phát triển và phân nhánh hình thành nên
khuẩn lạc nấm. Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trƣởng ở đỉnh sợi và phân
nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì nhƣ bông. Hệ sợi nấm cũng
có thể phát triển từ một đoạn sợi nấm sinh dƣỡng. Phần lớn sợi nấm có dạng trong
suốt. Tuy nhiên, ở một số loài, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc
đặc trƣng hoặc hệ sợi tiết ra sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển. Một số loài
có hiện tƣợng tiết ra các hợp chất hữu cơ tạo nên những tinh thể trên bề mặt hệ sợi

3


[3]. Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, đƣợc bao phủ bởi một lớp thành cứng, bên
trong chứa nguyên sinh chất có khả năng di chuyển. Chiều dài của sợi nấm thƣờng
không xác định, nhƣng đƣờng kính ống sợi tƣơng đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy
thuộc vào loài và điều kiện sinh trƣởng. Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa ra xung
quanh, phủ trên bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên các khuẩn lạc nấm dạng
tròn, đồng thời ăn sâu vào trong cơ chất [35].
Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trƣởng. Tuy nhiên,
ở một số loài, ánh sáng lại là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành bào tử.

Nấm sợi có khoảng giới hạn nhiệt độ tƣơng đối rộng. Giới hạn dƣới của một số loài
nấm sợi là từ 2oC - 5oC, giới hạn trên là từ 47oC - 53oC. Một số loài nấm có thể
sống sót dƣới điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt ở 0oC và 60oC. Khoảng nhiệt độ tối ƣu
cho sự phát triển của nấm sợi là từ 22oC - 37oC. Nhìn chung, các loài nấm sợi có thể
phát triển trong môi trƣờng axit. Một số loài phát triển tốt ở môi trƣờng pH nhỏ hơn
3, một số ít loài phát triển đƣợc ở điều kiện pH lớn hơn 9, nhƣng hầu hết các loài
nấm sợi phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 5 - 6,5. Vì là nhóm sinh vật hiếu khí bắt
buộc nên ôxi là yếu tố không thể thiếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của
nấm sợi [23, 35].
Nấm sợi có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính bao gồm sinh sản sinh dƣỡng bằng đoạn sợi nấm và sinh sản bằng
hình thành bào tử đính (conidia). Quá trình sinh sản hữu tính ở một số loài với sự
tham gia của giao tử đực và giao tử cái trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân,
dung hợp tế bào chất và quá trình giảm phân để hình thành bào tử đơn bội [3, 35].
Ngoài ra, ở một số loài nấm sợi còn có hình thức sinh sản cận hữu tính (parasexual).
Năm 1956, hình thức sinh sản này lần đầu tiên đƣợc mô tả bởi nhà di truyền học
ngƣời Ý Guido Pontecorvo trong các nghiên cứu về Aspergillus nidulans. Chu trình
sinh sản cận hữu tính này đƣợc bắt đầu khi một nhân đơn bội dung hợp vào tế bào
sinh dƣỡng của hệ sợi sau đó tiếp tục phân chia. Trong chu trình sinh sản cận hữu
tính có thể xảy ra trao đổi chéo giữa các vùng tƣơng đồng trên nhiễm sắc thể (NST).

4


Đặc điểm này đƣợc sử dụng để lập bản đồ gen hoặc gắn thêm những gen mới vào
trong các nhóm gen liên kết của loài [18].
1.1.2. Vai trò của nấm sợi
Nấm sợi có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên và đời sống của con ngƣời.
Nhờ khả năng sinh trƣởng tốt trên cả những môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng và khả
năng tổng hợp những hợp chất hữu cơ quan trọng, nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi

trong nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp. Các sản phẩm tạo ra từ nấm
sợi vô cùng phong phú, từ axit hữu cơ đến các enzyme hay các chất chuyển hóa
phức tạp đƣợc ứng dụng nhiều mặt trong cuộc sống. Nấm sợi đƣợc coi là các nhà
máy tế bào lý tƣởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme. Khoảng 40% enzyme
thƣơng mại trên thị trƣờng có nguồn gốc từ nấm sợi. Chúng đóng vai trò quan trọng
trong các ngành công nghiệp then chốt nhƣ công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y
dƣợc, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15]. Phần lớn các enzyme này đƣợc sản xuất
từ các loài thuộc chi Aspergillus và Trichoderma bởi chúng có khả năng tiết một
lƣợng lớn enzyme, protein vào môi trƣờng. Nhiều loài nấm mốc đã đƣợc công nhận
là an toàn tiêu biểu nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori, A. sojae [9, 15, 34]. Ngoài
các enzyme, nấm sợi còn đƣợc dùng làm nhà máy sản xuất các axit hữu cơ. Các axit
hữu cơ chủ yếu đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm sợi là axit citric, axit gluconic, axit
itaconic với sản lƣợng hàng nghìn tấn mỗi năm. Các axit này đƣợc sử dụng trong
các ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may và y dƣợc [15]. Trong các hệ
sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ và không thể thiếu trong các
chu trình chuyển hóa vật chất. Ngoài ra, nấm còn đƣợc sử dụng làm sinh vật mô
hình trong di truyền học, hóa sinh học và nhiều lĩnh vực khác. Bên cạnh đó, cũng có
một số loài nấm gây hại nhƣ Aspergillus fumigatus gây bệnh cơ hội ở ngƣời,
Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay một số loại nấm sợi gây hỏng rau quả
sau thu hoạch và gây bệnh cây trồng [14].
1.1.3. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus
Aspergillus là một chi nấm sợi phổ biến phân bố trên toàn cầu. Hiện
Aspergillus có khoảng trên 250 loài với các đại diện tiêu biểu nhƣ A. niger, A.

5


oryzae, A. nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30]. Các loài trong
chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao về hình thái nên khó để phân biệt một
cách chính xác và đều có khả năng sinh sản vô tính bằng hình thành bào tử. Bào tử

Aspergillus nhẹ, xốp có khả năng phát tán dễ dàng trong không khí. Khi gặp bề mặt
chất rắn hoặc lỏng, chúng đƣợc giữ lại và sẽ nảy mầm khi gặp điều kiện phù hợp.
Chính khả năng này khiến chúng phân bố rộng khắp trên thế giới [14]. Hai đại diện
tiêu biểu của chi Aspergillus là A. oryzae và A. niger. A. oryzae đƣợc sử dụng rộng
rãi trong công nghiệp sản xuất tƣơng, soyu, rƣợu sake ở các nƣớc Châu Á, đặc biệt
là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippine và Việt Nam. A. niger đƣợc sử
dụng phổ biến trong sản xuất axit citric phục vụ cho các ngành công nghiệp chế
biến thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, dệt may với sản lƣợng 1,6 triệu tấn mỗi năm. Bên
cạnh đó, A. oryzae và A. niger cũng đƣợc sử dụng để khai thác enzyme protease,
amylase, phytase và một số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp quan trọng khác [14, 15].
Các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus rất phù hợp cho các nghiên cứu về kiểm soát
biểu hiện gen và quá trình tiết protein ở tế bào sinh vật nhân thực do có thể dễ dàng
phân lập và tạo ra các chủng đột biến [16].
1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae
1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. oryzae
Aspergillus oryzae hay còn có tên gọi khác là nấm Koji. Đây là loài nấm phổ
biến của chi Aspergillus đƣợc sử dụng lâu đời trong ngành công nghiệp lên men ở
các nƣớc châu Á tiêu biểu là Nhật và Trung Quốc. Aspergillus oryzae thuộc phân
nhóm Flavi của chi Aspergillus trong họ Trichocomaceae. A. oryzae khi nuôi cấy
trên môi trƣờng thạch có dạng hệ sợi, màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang
màu vàng nhạt đến xanh. Hệ sợi phát triển mạnh, bao gồm những sợi mỏng, trong
suốt, đƣờng kính 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều. Từ những sợi nằm ngang này hình
thành nên những sợi khí sinh mang cuống sinh bào tử (cơ quan sinh sản vô tính).
Cuống sinh bào tử của A. oryzae thƣờng dài từ 1 - 2 mm, phía đầu cuống sinh bào
tử phình lên gọi là thể bình, từ thể bình này mọc lên những tế bào nhỏ, thuôn dài

6


đƣợc gọi là tế bào hình chai. Đầu các tế bào chai này phân chia thành những bào tử

đính (conidia). Bào tử của A. oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau tạo
thành màu đặc trƣng của khuẩn lạc [43, 62] Hình thái và cấu trúc khuẩn lạc của nấm
mốc A. oryzae đƣợc mô tả chi tiết ở Hình 1.2.

Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của A. oryzae [41]
(A, B) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa CYEA, MEA. (C) Cuống sinh bào tử.
(D, E) Hình thái và cấu trúc hiển vi của cuống sinh bào tử. (F) Bào tử A. oryzae
A. oryzae phân bố rộng khắp trên toàn thế giới, đặc biệt là các nƣớc nhiệt
đới. Vì là sinh vật hiếu khí bắt buộc nên A. oryzae thƣờng đƣợc tìm thấy ở những
nơi giàu ôxi, trên bề mặt nhiều loại cơ chất cung cấp dinh dƣỡng cần thiết cho
chúng. Chúng có thể sinh trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất nhƣ
mảnh vụn thực vật, lá cây, gỗ mục, các loại hạt…. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng,
phát triển của A. oryzae là 30oC - 40oC [49].

7


1.2.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae
Hệ gen đầy đủ của chủng quốc tế A. oryzae RIB40 đƣợc công bố năm 2005,
gồm 8 nhiễm sắc thể (NST) và hệ gen ty thể, kích thƣớc ƣớc tính đạt 37,6 Mbp với
khoảng 1207 gen, lớn hơn 25% - 30% so với hệ gen của một số loài thuộc cùng chi
Aspergillus. So với loài chuẩn dùng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm là A.
nidulans và loài gây bệnh cơ hội ở ngƣời A. fumigatus thì hệ gen của A. oryzae lớn
hơn lần lƣợt là 29% - 34% [63]. Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen cũng diễn ra ở các
loài có quan hệ gần gũi với A. oryzae là A. niger và A. flavus, đặc biệt là A. flavus
có hệ gen tƣơng đồng với A. oryzae đến 99,5%. Hệ gen của A. oryzae lớn hơn là do
thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa [62, 87]. Theo các nghiên cứu gần đây,
các loài A. oryzae, A. fumigatus và A. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99, 90 gen mã
hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% hệ gen (genome). Tất cả những gen mã hóa
cho protease có mặt trong hai loài A. fumigatus và A. nudilans đều có mặt trong A.

oryzae nhƣng có những gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có mặt ở A. oryzae mà
không tồn tại ở hai loài còn lại. Ngoài ra, A. oryzae cũng sở hữu một số gen mã hóa
cho các protease có khả năng hoạt động trong môi trƣờng axit mà theo dự đoán
chúng có thể đƣợc hình thành trong quá trình thuần hóa của con ngƣời [62].
1.2.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae
A. oryzae đƣợc sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc
biệt là công nghiệp thực phẩm lên men. Ngay từ thời cổ xƣa, các quốc gia châu Á
nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản đã sử dụng chúng để tạo nên các sản phẩm lên men nổi
tiếng nhƣ nƣớc tƣơng, miso, soyu, rƣợu sake và nhiều sản phẩm khác [50, 104]. A.
oryzae đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm là do đặc tính sinh
trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn enzyme thủy phân nhƣ amylase, glucoamylase,
protease, … trong quá trình sinh trƣởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho sản phẩm.
Một ứng dụng đặc biệt của A. oryzae trong công nghệ lên men truyền thống ở Nhật
là công nghệ lên men cơ chất rắn (gạo, đậu tƣơng và cám gạo) tạo điều kiện cho sự
phát triển hiếu khí của A. oryzae. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi

8


trƣờng rắn giúp tăng khả năng tiết enzyme và các chất chuyển hóa mà thƣờng sẽ
không xảy ra trong quá trình lên men lỏng [50, 63]. Ở Việt Nam, kỹ thuật làm tƣơng
đã đƣợc hình thành từ xa xƣa và cho đến ngày nay vẫn đƣợc sử dụng ở rất nhiều nơi
đặc biệt là các tỉnh miền Bắc. Phƣơng pháp lên men truyền thống sử dụng nấm mốc
A. oryzae đƣợc đánh giá là an toàn hơn so với phƣơng pháp lên men sử dụng hóa
chất phân giải sinh ra nhiều độc tố đặc biệt là 3-MCPD (3-monochoropropane-1,2diol) [5]. Tuy nhiên, phƣơng pháp lên men truyền thống cũng có mặt hạn chế do
quá trình phơi mốc tự nhiên có thể không đảm bảo an toàn. Trong quá trình phơi
mốc, ngoài chủng mốc an toàn là A. oryzae thì các nguyên liệu có khả năng bị
nhiễm mốc A. flavus sinh độc tố aflatoxin - một trong những chất gây ung thƣ gan
hàng đầu. Hình thái của A. flavus gần nhƣ giống hệt với A. oryzae nên rất khó có
thể để phân biệt hai loài này trong tự nhiên. Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại

diện cho hai loài, nhận thấy hệ gen của hai chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus
NRRL3357 có độ tƣơng đồng 99,5% DNA và 98% protein [87]. Nấm sợi A. oryzae
khác với A. flavus ở việc mất khả năng sinh độc tố aflatoxin do trong quá trình tiến
hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan
đến sinh tổng hợp aflatoxin [20].
Không chỉ đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, A. oryzae còn đƣợc
sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất enzyme, và các sản phẩm
chuyển hóa thứ cấp. Các loại enzyme đƣợc sản xuất từ A. oryzae nhƣ glucoamylase,
α-amylase và một số protease với giá trị kinh tế cao đƣợc sử dụng trong công
nghiệp sản xuất bánh kẹo và đồ uống [98]. Đây cũng là loài cung cấp enzyme
protease sản lƣợng lớn phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm và sản xuất
các chất tẩy rửa [8].
Hiện nay, những hiểu biết về hệ gen của A. oryzae cùng với sự phát triển
vƣợt bậc của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật di truyền, đã cho
phép chúng ta nghiên cứu chi tiết vai trò của các gen và biểu hiện chúng một cách
chủ động trong loài nấm sợi an toàn này.

9


1.3. Giới thiệu chung về A. niger
1.3.1. Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. niger
Năm 1867 nấm sợi A. niger lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi nhà thực vật học
ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem. A. niger thuộc phân nhóm Nigri
(còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen) của chi Aspergillus, họ Trichocomaceae.
Đây là loài điển hình và phổ biến nhất của chi Aspergillus phân bố rộng khắp các
vùng địa lý trên thế giới [30]. Nấm phát triển nhanh, chịu nhiệt, chịu lạnh tốt nên có
thể bắt gặp ở bất cứ nơi đâu, từ trong đất, nƣớc, không khí, mảnh vụn thực vật, hoa
quả thối rữa đến cả trên tƣờng nhà [93]. Dƣới kính hiển vi có thể quan sát thấy sợi
nấm trong suốt, có vách ngăn, phân nhánh liên tục, đƣờng kính hệ sợi 2,5 - 8µm.

Cuống sinh bào tử dài 300 - 400µm, đƣờng kính 40 - 70µm, không màu, một đầu
gắn với bọng hình cầu có màu sẫm hơn. Bọng cầu đƣợc bao phủ bởi thể bình sơ cấp
có màu trong suốt tới nâu, có vách ngăn. Trên tầng thể bình sơ cấp là thể bình thứ
cấp, đính bào tử hình cầu có gai nhọn với đƣờng kính 3,5 - 5µm. Sợi nấm mới phát
triển có màu trắng, sau đó đƣợc bao phủ bởi bào tử có màu nâu hoặc đen tạo nên
màu sắc đặc trƣng [23, 67]. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A.
niger đƣợc mô tả chi tiết trong Hình 1.3.

10


Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc hiển vi của nấm A. niger [45, 53]
(A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa môi trƣờng Czapek-Dox, (B) Rìa ngoài
khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử.
(E) Bào tử của nấm sợi A. niger
Nấm sợi A. niger sinh trƣởng tối ƣu ở nhiệt độ từ 28oC - 37oC, nhƣng nó có
khả năng chịu lạnh xuống tới 6oC và sống sót ở nhiệt độ lên đến 47oC. Trong
khoảng nhiệt độ tối ƣu, các bào tử của A. niger dễ dàng nảy mầm và phát triển
mạnh. Ở 30oC, bào tử trƣơng nở, kết hợp với các vật liệu thành tế bào trên toàn bộ
bề mặt tập trung về một cực để hình thành nên đỉnh sợi nấm. Sợi nấm tăng sinh ở
đỉnh sợi, phát triển chiều dài rồi phân nhánh tạo ra các sợi nhỏ hơn. Các sợi nhỏ lại
tiếp tục phân nhánh để tạo nên mạng hệ sợi lan trên khắp bề mặt cơ chất. Ở điều
kiện bất lợi (> 40oC) các bào tử không nảy mầm mà trƣơng nở tích nƣớc, đồng thời
tập trung các vật liệu thành tế bào trên khắp bề mặt tạo nên một lớp thành vững

11


chắc để bảo vệ bào tử khỏi điều kiện bất lợi bên ngoài. Khi gặp điều kiện thuận lợi,
bào tử này sẽ nảy chồi và trực tiếp phát triển thành hệ sợi nấm. Đặc điểm này giúp

cho bào tử của A. niger đƣợc bảo vệ lâu dài dƣới điều kiện khắc nghiệt [23].
Ngoài khả năng chịu lạnh, chịu nóng tốt, A. niger còn có giới hạn pH rất
rộng từ 1,5 - 9,8. Điều này cho phép chúng sinh trƣởng tốt ở cả môi trƣờng có độ
axit thấp dƣới mức chuẩn của nhiều loài. pH tối ƣu cho loài nấm này phát triển là
khoảng 4 - 6,5. Độ ẩm tối thiểu cần thiết cho sinh trƣởng của A. niger là 23%. Nấm
mốc A. niger không cần ánh sáng cho sự sinh trƣởng và phát triển [23].
1.3.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger
Kích thƣớc hệ gen của các chủng A. niger dao động trong khoảng 33,9 đến
38,5 Mb với khoảng 13000 gen, trong đó 6000 - 8000 gen hoạt động [24]. Năm
2007, trình tự hệ gen của A. niger chủng CBS 513.88 đã đƣợc công bố. Theo đó,
kích thƣớc hệ gen của CBS 513.88 là 33,9 Mb, với 14165 khung đọc mở trong đó
có 55% gen tham gia mã hóa cho các sản phẩm protein. Trong số 14165 khung đọc
mở có 3002 trình tự mã hóa cho các sản phẩm liên quan đến chuyển hóa. Dữ liệu
này cho thấy A. niger là một nhà máy đầy tiềm năng cho các ngành công nghiệp
sinh học [82].
1.3.3. Vai trò của nấm sợi A. niger
Nấm sợi A. niger giữ vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm,
đặc biệt là công nghệ lên men [23]. Nó đƣợc đánh giá là vi sinh vật tiềm năng trong
sản xuất amylase. Amylase là một enzyme phổ biến chiếm 25 - 35% lƣợng enzyme
thƣơng mại trên thị trƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình thủy phân tinh bột trong sản
xuất bánh mì, bia và trong việc loại bỏ keo từ vải. Có nhiều nguồn cung cấp enzyme
này nhƣ động vật, thực vật và vi sinh vật nhƣng amylase có nguồn gốc từ nấm
đƣợc ƣa chuộng hơn cả do có khả năng hoạt động ở môi trƣờng pH thấp. Ngoài ra,
A. niger còn có khả năng sản xuất invertase xúc tác sự thủy phân của sucrose tạo
thành glucose và fructose, pectinase đƣợc ứng dụng trong tiền xử lý các loại nƣớc
ép trái cây để loại bỏ cặn cũng nhƣ làm giảm vẩn đục trong rƣợu vang, α-

12

galactosidase chống đầy hơi khó tiêu có trong thành phần thuốc dạ dày. Các enzyme
protease có nguồn gốc từ nấm A. niger đƣợc sử dụng để sản xuất các phụ gia
Clarity-FERM sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bia để giảm hàm lƣợng
gluten lúa mạch, sử dụng trong rã đông thịt và giảm độ đàn hồi của các protein
gluten trong bánh mì [84]. Cellulase sản xuất bởi A. niger đƣợc sử dụng trong công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung
môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công
nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh [6]. Một enzyme khác có vai trò quan
trọng trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi đƣợc sản xuất thƣơng mại bởi nấm mốc
A. niger là enzyme phytase. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic
(phytate) ở dạng khó tiêu có mặt trong ngũ cốc và hạt chứa dầu thành dạng photpho
vô cơ có thể sử dụng đƣợc. Bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi có thể giúp vật
nuôi dạ dày đơn dễ dàng hấp thụ phospho đồng thời làm giảm sự bài tiết phytate
qua phân, từ đó hạn chế đƣợc ô nhiễm môi trƣờng. Phytase còn giúp giải phóng
canxi và các nguyên tố vi lƣợng khác, giảm lƣợng phospho vô cơ sử dụng; do đó
giảm chi phí thức ăn cho vật nuôi [1, 102].
Ngoài khả năng tiết ra một phổ rộng các loại enzyme công nghiệp, A. niger
còn đƣợc coi là một nhà máy tế bào chuyên sản xuất các loại axit hữu cơ. A. niger
lần đầu tiên trở thành sinh vật sản xuất axit citric năm 1919. Axit citric là chất phụ
gia giúp tăng hƣơng vị, giảm độ ngọt của các sản phẩm trong ngành công nghiệp
thực phẩm và nƣớc giải khát. Sắt citrate đƣợc sử dụng làm chất bảo quản máu trong
công nghiệp dƣợc phẩm. Ngoài ra, axit citric còn đƣợc dùng trong thuốc tẩy, thuộc
da, mạ điện và nhiều ứng dụng khác. Axit citric đƣợc sản xuất quy mô công nghiệp
chủ yếu nhờ sự lên men của các loài Aspergillus đặc biệt là A. niger và A. wentiti
do chúng tạo ra lƣợng lớn axit citric và rất ít tạo ra sản phẩm phụ không mong
muốn. Năm 2000, sản lƣợng axit citric toàn cầu đạt 900000 tấn. Đến năm 2007, sản
lƣợng axit citric toàn cầu ƣớc đạt 1,6 triệu tấn và đƣợc sản xuất chủ yếu bởi A.
niger. Một axit hữu cơ khác cũng đƣợc sản xuất thƣơng mại bởi nấm A. niger là axit

13