Nghiên cứu tạo interleukin 2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư

viện khoa học và công nghệ việt nam
viện công nghệ sinh học




Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nớc

Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp
dùng cho điều trị bệnh ung th

M số KC 04.33

Chủ nhiệm đề tài: PGs, ts. trơng nam hải













6702

24/12/2007

hà nội - 2007




Báo cáo tổng kết

Đề tài độc lập cấp Nhà nớc
M số: KC. 04. 33

Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái
tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung th













Chủ nhiệm Đề tài: PGS. TS. Trơng nam hải

01 / 2005 06 / 2007
Bộ Khoa học và Công nghệ
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Viện Công nghệ Sinh học
BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ÂÂÂ








BáocáotổngkếtKhoahọcvàKỹthuậtĐềtài

NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP
DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ






Mãsố:KC.04.33
Chủnhiệmđềtài:PGS.TS.TRƯƠNGNAMHẢI
Cơquanchủtrì:ViệnCôngnghệsinhhọc
Cơquanchủquản: ViệnKhoahọcvàCôngnghệViệtNam

Thờigianthự
chiện: 01/2005‐06/2007









Hà Nội - 2007
Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007.
Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33.
Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học.
BKHCN
V.CNSH
BKHCN
V.CNSH
VKHCNVN
V.CNSH

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
2




Lêi c¶m ¬n

Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu
thuộc 3 cơ quan nghiên cứu khoa học là (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo
dục và Đào tạo và (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế đã
tham gia thực hiện đề tài.
Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ
sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên và Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và
Sinh phẩm y tế đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và kinh phí cho
các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này.
Chủ nhiệm và tập thể cán bộ nghiên cứu thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn
Vụ Quản lý Khoa học và Công nghệ các ngành KT-KT của Bộ Khoa h
ọc và Công nghệ
và Ban chủ nhiệm chương trình KC. 04 đã tạo điều kiện thuận lợi về kinh phí và quản
lý trong suốt thời gian thực hiện đề tài.




CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI






PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
3
MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN 8
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP 9
BÀI TÓM TẮT 11
LỜI MỞ ĐẦU 15
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 17
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI 17
1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư 17
1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố 18
1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư 19
1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư 19
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 23
CHƯƠNG 2. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 26
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN 26
2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 26
2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2 26
2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau 27
2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp
mang gen IL-2 27
2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2. 27
2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2 27
2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.3.1. Vật liệu 29
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 30
CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 47
3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2 47
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2 47

3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA 48
3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2 49
3.1.4. Kết luận 50
3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2 51
3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys
125
bằng Ser
125
51
3.2.2. Gây hồi biến Ser
25
thành Leu
25
54
3.2.3. Kết luận 58
3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU 59
3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli 59
3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris 63
3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris 65
3.3.4. Kết luận 68

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
4
3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH
VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ
THỐNG LÊN MEN 5L, 14L 69
3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác 69
3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L. 73
3.4.3. Kết luận 74

3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN
CỨU TÍNH CHẤT 75
3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực 75
3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm
tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot
76
3.5.3. Kết luận 77
3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 78
3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2 79
3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2 79
3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 80
3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris 82
3.7.4. Kết luận. 83
3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 84
3.8.1. Kết quả nghiên cứu 84
3.8.2. Kết luận 97
3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 98
3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 98
3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2 98
3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 98
3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 98
3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm 99

3.9.6. Kết luận 99
CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 100
4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 100
4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ 102
4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ 104
4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG 104
4.5. ĐÀO TẠO 105

4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ 105
4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 106
4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 106
4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 107
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 110
5.1. KẾT LUẬN 110
5.2. ĐỀ NGHỊ 111
TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
5

MỤC LỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư 18
Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2 20
Hình 3. Sự tác động của Proleukin
R
IL-2 lên tế bào ung thư 23
Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ 28
Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam 47
Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 48
Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I 48
Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI 49
Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được 50
Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen 50
quốc tế với số đăng ký NP_000577 50
Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 52
Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I 53
Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2 54

Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900 56
Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN 57
Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) 58
Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% 60
Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 61
Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5% 61
Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được
nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS 62
Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích
2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. 63
Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein 63
có kích thước 32 kDa 63
Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN. 64
Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 64
Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 66
Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris 67
Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 67
Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN 70
Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein 71
Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 71
Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện 72
Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2 73

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
6
Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5% 73
Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 755
Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 755
Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5% 766

Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian 78
bảo quản khác nhau 78
Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro 79
Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm 81
Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động 82
của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ) 82
Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp) 85
Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư 86
Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường 86
Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư 87
Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: 87
Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới
tác động của AOM: 88
Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng 88
thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10) 88
Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang
chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) 89
Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180 90
sau 12 ngày cấy truyền (b) 90
Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180: 91
Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp 92
Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm 92
Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) 93
Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN 93
Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ 94
Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính 94
hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). 94
Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000) 95
Tế bào chết theo kiểu hoại thư 95
Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) 95

Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm 96




Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
7

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện 8
Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô 77
Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp 80
Bảng 4. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm 81
Bảng 5. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của mẫu ở nồng độ thử khác nhau 82
Bảng 6. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL-2 thử nghiệm 82
Bảng 7. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm 85
Bảng 8. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm 90
Bảng 9. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm 96
của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180 96
Bảng 10. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài 102
Bảng 11. Sản phẩm khoa học của đề tài 102
Bảng 12. Danh sách các học viên được đào tạo 105
Bảng 13. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ 105
Bảng 14. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế 105
Bảng 15. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục 106
Bảng 16. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh 108

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
8

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN


Số
TT
Họ và tên
Học hàm, học vị
Chức vụ, đơn vị
Trách nhiệm
trong đề tài
Chương mục
trong báo cáo
1
PGS. TS.
Trương Nam Hải
Phó Viện trưởng,
Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,
Viện CNSH
Chủ nhiệm đề tài
Chủ đề mục
Toàn bộ nội
dung báo cáo
2
PGS. TS.
Phan Văn Chi
Phó Viện trưởng,

Trưởng phòng Hoá sinh protein,
Viện CNSH
Chủ đề mục
3 TS. Phạm Thị Bích Hợp
Phó Phòng Công nghệ lên men
Viện CNSH
Chủ đề mục
4
PGS. TS
Đỗ Khắc Hiếu
Trưởng phòng Tế bào động vật,
Viện CNSH
Chủ đề mục
5 TS. Đinh Duy Kháng
Trưởng phòng Vi sinh phân tử,
Viện CNSH
Chủ đề mục
6
PGS. TS
Trần Công Yên
Trường Đại học khoa học tự
nhiên, ĐHQGHN
Chủ đề mục
7
GS. TS.
Nguyễn Đình Bảng
Trung tâm Quốc gia Kiểm định
Vaccin và sinh phẩm y học
Chủ trì đề tài
nhánh

8 Trần Bình Duyên
Công ty CP dược TW
Mediplantex
Chủ trì đề tài
nhánh
Chưa thực
hiện
9
GS. TS. Nguyễn Bá
Đức
Bệnh viện K Hà Nội
Chủ trì đề tài
nhánh
Chưa thực
hiện

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
9

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN
VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP
1. Nội dung: Tạo dòng gen IL-2
Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Phan Văn Chi, NCS Lê Thị Bích
Thảo, Th.S Đặng Thành Nam, Th.S Nguyễn Nam Long, CN. Bùi Thị Huyền.
2. Nội dung: Tạo đột biến gen IL-2

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN.Vũ Minh Đức,
CN. Đặng Tr
ần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh, NCS. Phùng Thu Nguyệt.
3. Nội dung: Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau
Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, PGS. TS Phan
Văn Chi, PGS. TS Đinh Duy Kháng, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng,
KS. Lê Quỳnh Giang, Th.S Nguyễn Tiến Minh, NCS. Phạm Minh Tuấn.
4. Nội dung: Nghiên cứu điều kiện lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang
gen IL-2 ở quy mô 5 và 14 lít.
Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ
sinh học
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, TS. Phạm Thị
Bích Hợp, Th.S Trần Thị Hường, CN. Vũ Minh Đức, Th.S Nguyễn Văn Hiếu,
Th.S Hồ Tuyên, Th.S Lại Thanh Tùng, Th.S Phan Thị Hồng Thảo, CN. Phạm
Thanh Huyền, CN. Phạm Kim Dung, KTV. Phan Văn Chí.
5. Nội dung: Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính
chất của nó.
Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học
Những người tham gia thực hiệ
n: PGS. TS Trương Nam Hải, CN. Vũ Minh Đức,
CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh.
6. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro
Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học.
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Đỗ Khắc Hiếu, TS. Đỗ Thị Thảo.


Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

10
7. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật thí nghiệm
Cơ quan tham gia: Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN.
Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trần Công Yên, PGS. TS Nguyễn
Thị Quỳ, ThS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, CN Bùi Thị Vân Khánh, CN. Nguyễn
Thuỷ Chung, CN. Lê Thị Thanh, CN. Vũ Đình Quang, CN. Kiều Thị Thu Hà.
8. Nội dung: Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2
Cơ quan tham gia: Trung tâm Quốc gia Kiểm định vacxin và sinh phẩm y học
Những ngườ
i tham gia thực hiện: GS. TS Nguyễn Đình Bảng, TS. Nguyễn Thị
Kim Hương.


Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
11

BÀI TÓM TẮT

Trong những năm gần đây, bệnh ung thư đang trở thành một trong những
nguyên nhân gây tử vong cao ở nước ta do sự ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm
cùng nhiều nguyên nhân khác. Do vậy việc điều trị các bệnh ung thư là rất cấp thiết,
tuy nhiên giá thành các loại thuốc điều trị ung thư thường cao và phải nhập ở nước
ngoài. Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học ở Vi
ệt Nam, việc sản xuất
các protein tái tổ hợp phục vụ cho y học ngày càng được quan tâm. Xuất phát từ nhu
cầu thực tiễn cần sản xuất thuốc ở trong nước dùng cho điều trị bệnh ung thư, Đề tài
KC.04.33 đã được xây dựng để bước đầu tạo ra các sản phẩm protein tái tổ hợp
Interleukin-2 dùng trong điều trị bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn. Đề
tài

đã được các cán bộ nghiên cứu từ 3 cơ quan phối hợp để thực hiện triển khai và thu
được các kết quả chính như sau:
1. Tạo dòng gen IL-2 và tạo đột điểm của gen IL-2
Bằng các kỹ thuật di truyền chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ tế bào
lách của người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2. Tuy nhiên để tạo ra IL-2 giống
như dạng thương phẩm (Proleukin IL-2), chúng tôi đã tiến hành tạo các độ
t biến điểm
của gen IL-2 như: i) Làm mất điểm glycosyl hóa Alanine-Proline-Threonine ở đầu N
của IL-2 bằng cách biến đổi thành Alanine-Methionine-Alanine để giảm tính độc của
IL-2 đối với tế bào, ii) đột biến gốc Cys
125
thành Ser
125
để hạn chế khả năng tạo sai cầu
disulfide trong phân tử IL-2, iii) hồi biến Ser
25
thành Leu
25
để giúp cho phân tử IL-2 có
cấu trúc giống như dạng thương phẩm Proleukin IL-2.
2. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau
Các gen IL-2 cải biến và dạng tự nhiên đã được nhân lên và gắn vào các vector biểu
hiện như pET32c (+), pPIC9, pPICzα để đưa vào các hệ biểu hiện trong E. coli và P.
pastoris. Kết quả biểu hiện gen cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công các protein
lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa và protein dạng đơn rhIL-2 với kích
thướ
c khoảng 15,4 kDa. Chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng
90 mg/l IL-2, cao hơn 2000 lần so với dự tính và chủng nấm men P. pastoris có khả
năng tổng hợp IL-2 cao gấp 100 lần so với dự tính khoảng 5 mg/ml.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
12
3. Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô 5 và 14 lít.
Các chủng vi sinh tái tổ hợp E. coli và P. pastoris mang gen IL-2 đã được nuôi cấy
trong các hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 và 14 lít. Kết quả lên men trong cả
hai hệ thống đều cho xấp xỉ sinh khối khoảng 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg
protein lai Trx-IL2/lít.
4. Tách chiết và tinh chế IL-2 tái tổ hợp
Protein lai Trx-rhIL2MN tạo ra trong vi khuẩn E. coli đã được tinh sạch bằng sắc
ký ái lực và phần protein lai Trx được loại bỏ bằng enzyme enterokinase. Các thành
phần không mong muốn như chí nhiệt tố (pyrogen) đã được loại ra khỏi IL-2 tái tổ hợp
bằng bộ kit chuẩn. Protein tái tổ hợp được tổng hợp có độ tinh sạch cao đạt 99% và độ
đặc hiệu 100% với kháng thể kháng IL-2 của người.
5. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro
Hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tổng hợp trong E. coli đã được xác
định bằng phép thử
sinh học trên tế bào nuôi cấy in vitro CTLL-2 đạt khoảng 2,7 x 10
6
U/mg, tương đương với mẫu của Trung Quốc sản xuất (2,9 x 10
6
U/mg). Trong khi đó,
hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men cao hơn đạt 4x10
6
U/mg. Cả hai dạng IL-
2 tái tổ hợp đều có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào CTLL-2.
6. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật gây ung thư thực nghiệm
Kết quả nghiên cứu thử nghiệm IL-2 của VN trên chuột gây ung thư thực nghiệm đường
tiêu hóa ruột cho thấy IL-2 tái tổ hợp đã làm giảm 43,5% sinh khối u báng đường ruột, đạt

hiệu lực kháng u (+) và có thể làm tăng thời gian sống của chuộ
t lên 51,3% so với đối chứng.
Đây là những kết quả sơ bộ ban đầu về nghiên cứu tác động điều trị của IL-2 trên mô hình tế
bào động vật, tuy nhiên nó đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam sản xuất có hoạt tính
đối với u báng ở chuột gây ung thư thực nghiệm.
7. Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2
Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp đã được g
ửi sang Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và
Sinh phẩm y học để đánh giá theo quy trình chuẩn (SOP) của Tổ chức Y tế thế giới.
Kết quả cho thấy chế phẩm IL-2 do đề tài tạo ra được đánh giá là an toàn, đảm bảo điều
kiện vô trùng, có tính chất lý hóa phù hợp, hiệu giá tương đương với sản phẩm do
Trung Quốc sản xuất và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
13


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


AOM Azoxymethane
DNA Axit deoxyribonucleic
Amp Ampicilin
RNA Axit ribonucleic
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
BMGY Buffered Minimal Glycerol Media
BMMY Buffered Minimal Methanol Media
Bp Base Pair
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

Cys Cystein
CNSH Công nghệ sinh học
dNTP 2’-deoxyribonucleotide 5’-triphosphate
dO
2
dissovle oxygen
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylen diamin tetra acid acetic
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EST Electrospray Ionization
FDA Food and Drug Administration
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
Fw Forward (xuôi chiều)
GFX Glass Fiber matrix
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IL Interleukin
IPTG Isopropyl β-D-thiogalactosidase
kDa Kilo Dalton
LB Luria and Bertani
LBA Luria-Bertani Ampicilin
Leu Leucine
Lys Lysine

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
14
MS/MS Mass spectrophotometry
NBT Nitro Blue Tetrazolium
NCBI National Center for Biotechnology Information
OD Optical Density

P. pastoris Pichia pastoris
PMSF Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride
rhIL2MM Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Methionin
rhIL2MN Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Natural
RT-PCR Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction
Rv Reverse (ngược chiều)
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Ser Serine
TBS Tris – Buffer Saline
Trx- Thioredixin
Xgal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactosidase
YPD Yeast Peptone Dextrose

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
15

LỜI MỞ ĐẦU

Ung thư là sự phát triển và phân chia không bình thường của các tế bào do bị
đột biến gen ở tế bào soma. Theo cảnh báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO), với hơn
10 triệu trường hợp xuất hiện mới hàng năm, bệnh ung thư đang trở thành một trong
những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Ở Việt Nam hàng năm nước ta có
khoảng 150 000 bệnh nhân bị ung thư
và khoảng 1/3 số bệnh nhân đã bị chết vì các
bệnh ung thư (theo số liệu thống kê tại bệnh viện K, Hà nội và Trung tâm U bướu
thành phố Hồ Chí Minh). Do vậy việc điều trị bệnh ung thư đang trở nên cấp thiết và
quan trọng trong mục tiêu chăm sóc sức khỏe cộng đồng của nước ta.
Hiện nay các phương pháp điều trị bệnh ung thư thường đang được s
ử dụng là

phương pháp chiếu xạ, giải phẫu hay sử dụng hoá chất trong quá trình trị liệu. Tuy
nhiên các phương pháp này thường gây nên các tác dụng phụ do tính không đặc hiệu có
thể giết cả các tế bào ung thư lẫn tế bào thường và ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của
bệnh nhân ung thư. Do vậy phương pháp điều trị ung thư bằng miễn dịch trị liệu đã
được ứ
ng dụng một cách có hiệu quả để có thể tiêu diệt một cách chọn lọc các tế bào
ung thư. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng các cytokine để kích hoạt hệ thống
miễn dịch các tế bào T, NK nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính trong
thời gian ngắn. Đây là phương pháp mới được áp dụng ở Việt Nam trong những năm
gần đây để điều trị cho các b
ệnh nhân ung thư. Liệu pháp điều trị ung thư bằng miễn
dịch đã bước đầu thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế bào máu, ung thư
thận, ung thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, u hắc
tố Hiện nay, Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug
Administration – US FDA) đã chính thức cho phép sử dụng Interleukin-2 (IL-2) để
điều trị hai loại ung thư, đó là ung thư hắc t
ố (melanoma) và ung thư thận ác tính.
Ngoài ra, hiện nay IL-2 còn được thử nghiệm với nhiều loại ung thư khác.
IL-2 là một cytokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hoá các tế bào miễn dịch. IL-2
kích thích sự tăng sinh các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như tế bào T, tế
bào NK để tấn công và tiêu diệt các tế bào ung thư. Theo một số công trình nghiên cứu
cho thấy IL-2 có thể tăng cường hoạt hoá hệ thống miễn dịch c
ủa các bệnh nhân bị ung

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
16
thư biểu mô thận và u hắc tố. Ngày nay với sự phát triển của kỹ thuật di truyền phục vụ
cho y dược, các sản phẩm cytokine của người có thể được tổng hợp dưới dạng tái tổ
hợp để điều trị các bệnh ung thư. Hãng Amgen Pharmaceutical của Mỹ cũng đã phát

triển sản phẩm thuốc Proleukin-2 để điều trị cho các bệnh nhân bị ung thư biể
u mô
thận ác tính và ung thư hắc tố. Ngoài ra do có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch
nên ngoài việc điều trị ung thư thì IL-2 tái tổ hợp (rhIL2) còn có thể được sử dụng
trong điều trị bệnh nhân bị nhiễm virus HIV. Tuy nhiên rhIL2 thường được sử dụng
phối hợp với các chất khác như Interferon-α, flourouracil, cis-retinic acid…
Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta hướng nghiên cứu tạo thuốc IL-2 dạng tái tổ hợp
dùng cho
điều trị ung thư vẫn chưa được tiến hành. Phương pháp miễn dịch trị liệu cần
phải được triển khai ứng dụng ở các bệnh viện Trung ương để có thể theo kịp nền y
học hiện đại của thế giới. Do vậy, ở nước ta hiện nay Bộ Y tế rất khuyến khích việc tự
sản xuất thuốc trong nước để chữa tr
ị cho bệnh nhân ung thư. Với trang thiết bị và nhân
lực của phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học
thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam có thể thực hiện các nghiên cứu về chế
tạo protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và khả năng về kỹ thuật và nhân lực, trong
chương trình khoa học KC.04, Vi
ện CNSH phối hợp cùng 3 cơ quan nghiên cứu đầu
ngành trong cả nước để tiến hành đề tài KC.04.33 “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái
tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư’’.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
17

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI

1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư
Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình
điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế
bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u. Các khối u này có
thể là lành tính (tumor) hoặc có thể biến thành ác tính (cancer). Đặc điểm củ
a tế bào
ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào
bình thường cần phải có và chúng trơ với các tín hiệu chết theo chương trình của tế
bào bình thường (apoptosis). Các tế bào ung thư cũng có thể lan sang các mô xung
quanh và lan truyền trong cơ thể để tạo nên khối u thứ cấp. Quá trình này gọi là di
căn. Để phát triển thì cả hai quá trình hình thành các loại khối u trên đều cần tạo ra
các mạch máu mới, do đó mà gần
đây một trong những liệu pháp chữa trị khối u đang
được các nhà nghiên cứu quan tâm là tạo ra các chất ức chế quá trình tạo các mạch
máu của khối u đang phát triển.
Nguyên nhân của ung thư được xác định là do đột biến. Thế nhưng các đột biến
gây ung thư khác với đột biến của bệnh di truyền ở hai điểm sau. Các đột biến dẫn
đến ung thư chủ yếu là do đột biến t
ế bào soma, còn các đột biến ở bệnh di truyền
xảy ra ở các tế bào mầm (the germ cells). Tuy nhiên cũng có trường hợp một số đột
biến ở bệnh nhân bị bệnh di truyền đã tạo tiền đề cho sự phát triển một số dạng ung
thư. Điểm khác thứ hai là ung thư không thể hình thành do đột biến đơn, mà nó là
hậu quả của sự tích luỹ từ ít nhất 3 cho đến 20 độ
t biến xảy ra trong các gen điều
khiển quá trình tăng sinh tế bào, phụ thuộc vào loại ung thư. Chính vì thế mà ung thư
hay xảy ra ở người cao tuổi, vì cần có sự tích luỹ các đột biến gen. Điều này cũng
giúp một phần lý giải tỷ lệ người bị bệnh ung thư cao gắn liền với ô nhiễm môi
trường, hút thuốc lá

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
18








Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư (
1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố
Trong các loại ung thư có thể được điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, 2 dạng
ung thư là u hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính bước đầu đã được điều trị có
kết quả nhờ interleukin-2 [10, 11, 26].
Thận là một phần trong hệ tiết niệu. Chức năng chính của nó là lọc máu và sản
xuất nước tiểu để loại bỏ
chất thải ra ngoài cơ thể. Khi ung thư thận phát triển, nó có
thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, đại tràng, hoặc tuyến tuỵ. Tế bào ung
thư thận có thể tách khỏi khối u ban đầu và di căn tới các bộ phận khác của cơ thể. Các
triệu chứng của ung thư thận là đái ra máu, có khối u ở vùng thận. Các triệu chứng ít
gặp hơn như mệt mỏi, chán
ăn, đau ở vùng thắt lưng không khỏi, sốt lặp đi lặp lại nhiều
lần. Ung thư thận tăng lên theo độ tuổi, bệnh thường xuất hiện nhiều nhất là trong độ
tuổi 50-70. Nó xảy ra ở nam giới nhiều gấp đôi nữ giới. Nguyên nhân của ung thư thận
là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia
xạ… Ung thư
thận được điều trị chủ yếu bằng hormon, hoá chất, liệu pháp miễn dịch.
U hắc tố là một loại ung thư khá thường gặp và đang có tần suất mắc bệnh tăng

nhanh nhất trong một số loại ung thư hiện nay. Các nhà nghiên cứu dự đoán tần suất
mắc bệnh tiếp tục tăng trong 20 năm tới. Nguyên nhân làm tăng tần suất mắc bệnh
ch
ưa được xác định. Một số yếu tố có thể có liên quan, như thói quen phơi nắng và
những thay đổi mang tính chất toàn cầu như thủng tầng ozon và sự ô nhiễm môi
trường. U hắc tố có thể gặp ở mọi lứa tuổi người trưởng thành. Theo thống kê thì u hắc
tố có tính chất gia đình. Cắt bỏ khối u là lựa chọn điều trị dành cho u hắc tố. Sau khi
Sự phân chia của tế bào bình thường
Tế bào bị phá hủy
Sự phân chia của tế bào ung thư

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
19
giải phẫu các bệnh nhân được chỉ định dùng các chất như interferon-α, interleukin-2
được sử dụng để điều trị bổ trợ nhằm chống di căn.
1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư
Cho đến nay ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và đứng đầu trong
những bệnh gây tử vong. Các phương pháp điều trị chính hiện đang được dùng là giải
phẫu, chiếu xạ hay hóa ch
ất. Các phương pháp này có thể được sử dụng phối hợp để
tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có thể sử dụng các
phương pháp này để điều trị các loại ung thư. Đặc biệt, phương pháp chiếu xạ hay hoá
chất do tính không đặc hiệu nhiều khi giết cả tế bào ung thư lẫn các tế bào bình
thường, ảnh hưởng không tốt đến toàn bộ
cơ thể.
Một liệu pháp khác cũng đã được sử dụng để điều trị ung thư có hiệu quả là liệu
pháp miễn dịch có sử dụng các chất cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ
thể người nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính. Liệu pháp này bước
đầu đã thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế

bào máu, ung thư thận, ung
thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, sarcom mô mềm
ở chi, u lympho, u hắc tố.
1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư
Interleukin là một trong các nhóm cytokine đóng vai trò quan trọng trong hệ
thống miễn dịch. Interleukin được phân loại bao gồm có 33 nhóm IL khác nhau ký
hiệu từ IL-1 đến IL-33. Các IL này có vai trò trung gian trong việc liên kết với các
thụ thể đặc hiệu để điều khiển quá trình hoạt động của tế bào, quá trình apoptosis và
các quá trình phân chia của tế bào. Mỗ
i nhóm IL có vai trò khác nhau trong hệ
thống miễn dịch và chúng có thể được tạo ra bởi các loại tế bào khác nhau.
Interleukin-2 (IL-2) là một lymphokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hóa của
các tế bào T. IL-2 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1975 như là một nhân tố
kích thích sự tăng sinh của các tế bào T và đây là một trong số các cytokine được
nghiên cứu kỹ nhất bởi chức năng quan trọng của nó trong hệ thống miễn dịch. Kể
từ
đó đến nay đã có hơn 150 công trình nghiên cứu khoa học về vai trò của IL-2
trong điều trị các bệnh ung thư đã được công bố từ năm 1990 đến nay. Những công
trình nghiên cứu khoa học này đã đem lại cho các nhà khoa học những hiểu biết

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
20
quan trọng về việc sử dụng IL-2 trong điều trị các bệnh ung thư bằng liệu pháp miễn
dịch, đặc biệt là ung thư biểu mô thận ác tính và ung thư hắc tố.
Gen mã hoá cho IL-2 lần đầu tiên được tách dòng vào năm 1983 và cấu trúc tinh
thể của protein này đã được mô phỏng vào năm 1992. IL-2 là một glycoprotein có
trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa gồm 153 amino acid, nó có cấu trúc dạng cầu với 4
chuỗi xoắn α-helices được cuộ
n theo cấu trúc điển hình họ cytokine kiểu 1.

Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2
Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín
hiệu tiết dài 20 amino acid và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid. Các
kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy có 3 vùng trên phân tử hIL2 có vai trò quyết
định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i) vùng tận cùng đầu N (các gốc
amino acid 1-20), ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121-133) và iii) cầu
disunfide giữa các gốc Cys
58
và Cys
105
. Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các
đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 gốc amino acid ở đầu C có thể làm mất
99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2. Phân
tích trình tự amino acid cho thấy hIL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các vị
trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys
58
và Cys
105
tạo cầu disulfide. Việc hình thành
chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh học của hIL-2. Các kết quả

nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến các gốc Cys
105
làm phá huỷ cầu disunfide do
vậy làm giảm 8-10 lần hoạt tính của hIL-2, trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys
58

làm hoạt tính của hIL-2 giảm tới 250 lần. Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys

tại vị trí

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
21
125 chỉ ảnh hưởng rất ít tới hoạt tính hIL-2 và sự thay đổi gốc Cys
125
thành Ser
125

không ảnh hưởng tới hoạt tính của hIL-2 (Liang SM. et al). Do vậy đột biến thay đổi
Cys ở vị trí 125

thành Ser có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disunfide không mong
muốn giữa gốc này với Cys
58
hoặc Cys
105
. Ngoài ra, tại đầu N của protein hIL-2 có
điểm glycosyl hoá được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu
tiên. hIL-2 trong tự nhiên tồn tại ở dạng glycosyl hoá có tính thấm cao với màng tế bào
do vậy gây nên độc tính của protein này trong cơ thể bệnh nhân. Vì vậy, để tạo ra IL-2

dạng thương phẩm, protein tái tổ hợp IL-2 phải chứa các đột biến điểm làm mất điểm
glycosyl hoá để làm giảm tính thấm và tính độc c
ủa IL-2 đối với tế bào và đột biến thay
thế Cys
125
thành Ser
125
nhằm ngăn cản sự tạo thành sai cầu disulfide để đảm

bảo cấu
trúc của protein tự nhiên.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư
có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân. Theo nghiên cứu của
Rosenberg 1980 tại National Cancer Institute (NCI, Spain) cho thấy, khi điều trị cho
các bệnh nhân ung thư thận ác tính bằng IL-2 với các liều lượng khác nhau có thể
làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20%, ngoài ra IL-2 còn có vai trò quan
trọng trong việ
c điều trị các bệnh ung ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư
phổi, ung thư buồng trứng…Trong những năm tiếp theo từ năm 1990, các nhà khoa
học đã tiếp tục nghiên cứu để làm tăng hoạt động của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều
phương pháp trị liệu khác như hoá trị liệu và miễn dịch trị liệu, kết quả là khoảng 5-
10% các bệnh nhân được
điều trị có thể sống sót sau 10 năm. Đây là một trong rất
nhiều nỗ lực lớn của các nhà khoa học trên thế giới trong việc nghiên cứu và ứng
dụng IL-2 trong việc điều trị các căn bệnh nan y này.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu sâu
về vai trò của IL-2 trong hệ miễn dịch với vai trò có thể nhận biết các kháng nguyên
lạ như các tế bào ung thư và phát triển các ph
ương pháp trị liệu mới chống lại
những thay đổi của tế bào như ức chế các nhân tố phát triển khối u và các tín hiệu

dẫn truyền, cảm ứng quá trình tự chết của tế bào (appotosis), liệu pháp miễn dịch sử
dụng các cytokine, sử dụng vaccine chống ung thư và các liệu pháp gen. Phương
pháp điều trị miễn dịch trị liệu bằng IL-2 có thể kết hợp với các yế
u tố miễn dịch
khác như TNF, melatonin, Interferon (IFN)-alpha, IFN-beta, LAK- lymphokine-

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33
Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
22
activated killer và TIL để có thể tăng cường hiệu quả sử dụng IL-2 trong điều trị
ung thư [55, 72].
Ngày nay cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại và các
thành tựu của kỹ thuật di truyền, các protein tái tổ hợp sử dụng cho mục đích y học
ngày càng được quan tâm.
Hãng Amgen Pharmaceutical (Mỹ) đã phát triển sản phẩm Proleukin
R
IL-2
(aldesleukin) để điều trị trên các bệnh nhân ung thư hắc tố và ung thư biểu mô thận.
Tên hoá học của sản phẩm là des-alanyl-1, Ser-125 human interleukin-2. Sản phẩm
Proleukin
R
IL-2 là một lymphokine được tạo ra bởi kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Bằng
các kỹ thuật di truyền, gen IL-2 đã được thay đổi ở một số gốc amino acid như: mất
điểm glycosyl hoá ở vị trí alanin thứ nhất và thay thế amino acid Cys 125 bằng Ser
để đảm bảo cấu trúc không gian và hoạt tính sinh học của IL-2 tái tổ hợp. Các
nghiên cứu in vitro của Proleukin
R
IL-2 trên các dòng tế bào người cho thấy sản
phẩm này có thể làm i) tăng cường quá trình phân chia tế bào lymphokine, do đó
thúc đẩy sự tăng cường hệ thống miễn dịch; ii) tăng cường tính độc của lymphokine

để nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư, iii) cảm ứng các tế bào giết như LAK
và thúc đẩy hoạt động của các tế bào NK, iv) kích thích sự tạo thành các nhân tố của
hệ thống miễn dịch là Interferon-gamma. Sự thử nghi
ệm chế phẩm Proleukin
R
IL-2
trên mô hình động vật và trên cả những bệnh nhân bị ung thư cho thấy chúng có khả
năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, có hoạt tính sinh học, không bị kết
tủa và sử dụng dễ dàng nên thường được sử dụng nhiều trong điều trị bằng phương
pháp miễn dịch trị liệu [28]. Trong số 255 bệnh nhân bị ung thư biểu mô thận và
270 bệnh nhân bị ung thư hắ
c tố ở Mỹ đã được điều trị bằng Proleukin
R
IL-2 tái tổ
hợp cho thấy có Proleukin
R
IL-2 có thể làm kìm hãm quá trình phát triển của các tế
bào khối u sớm nhất chỉ sau 4 tuần trị liệu. Đối với ung thư biểu mô thận ác tính,
kết quả điều trị cho thấy nếu bệnh nhân có phản ứng với Proleukin
R
IL-2 thì tế bào
ung thư sẽ được kiểm soát hoàn toàn và tế bào ung có thể biến mất, 76% bệnh nhân
có thể chữa khỏi ung thư sau 7 năm. Đối với ung thư da ác tính nếu bệnh nhân có
đáp ứng với Proleukin
R
IL-2 thì khoảng 59% bệnh nhân đã khỏi bệnh hoàn toàn sau
5 năm. Đây là những kết quả nghiên cứu rất quan trọng cho y học, góp phần làm
giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhân bị ung thư biểu mô thận và ung thư hắc tố trên

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007
23
thế giới. Hiện nay chế phẩm Proleukin
R
IL-2 có đang được bán rộng rãi trên thị trường Anh
và Mỹ. Ngoài ra Proleukin
R
IL-2 còn có khả năng kích thích hoạt động của hệ miễn dịch,
do vậy chúng có thể được sử dụng trong điều trị cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV. Các kết
quả so sánh giữa 2 nhóm bệnh nhân bị HIV được điều trị bằng thuốc chống HIV kết hợp
với Proleukin
R
IL-2 và một nhóm được điều trị chỉ bằng thuốc chống HIV, không kết hợp
Proleukin
R
IL-2 đã cho thấy, các bệnh nhân được điều trị bằng Proleukin
R
IL-2 và thuốc
chống HIV có khả năng kéo dài sự sống hơn nhóm bệnh nhân còn lại. Không giống như
các sản phẩm thuốc khác, Proleukin
R
IL-2 không tấn công trực tiếp vào virus HIV mà
chúng hoạt hóa các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như các tế bào T-( tế bào T4
và T8), các đại thực bào, và các tế bào giết tự nhiên (NK) để giúp cơ thể chống lại sự tấn
công của virus này. Sản phẩm đã được đánh giá là an toàn và hiệu quả trong việc điều trị
ung thư và HIV do nó có khả năng tăng cường hệ miễn dịch của cơ th
ể và giúp cho hệ
miễn dịch có thể điều khiển được sự sản sinh của các tế bào ung thư và virus HIV [27].
Hiện nay chế phẩm Proleukin
R

IL-2 đang được bán rộng rãi trên thị trường Anh và Mỹ.
Trung Quốc thời gian gần đây cũng đã sản xuất IL-2 tái tổ hợp để điều trị ung thư. Ví dụ:
thuốc RecoSun là IL-2 tái tổ hợp của người đã được chế tạo và sử dụng tại Trung Quốc.






Hình 3. Sự tác động của Proleukin
R
IL-2 lên tế bào ung thư
(
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Theo số liệu thống kê ở các bệnh viện lớn của nước ta như Bệnh viện K, Trung
tâm u bướu thành phố Hồ Chí Minh thì số bệnh nhân bị ung thư đã tăng lên đáng kể
trong những năm gần đây. Trong số 150000 trường hợp bị ung thư xuất hiện mới hàng
năm ở nước ta thì có khoảng trên 50000 bệnh nhân đã bị tử vong vì căn bệnh này. Bệnh
ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong lớn, vượt qua cả tỷ lệ tử vong về

ProLeukine IL-
2 kích thích sự
tăng sinh của tế
bào T

ProLeukine IL-2
tế bào T
Tế bào T
Tế bào T đặc hiệu
Tế bào ung thư

Tấn công
tế bào
ung thư