Tiểu luận ứng dụng của vi sinh vật trong bệnh đái tháo đường

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
KHOA: MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN

BÀI TIỂU LUẬN

Chuyên đề

tề±

ỨNG DỤNG CỦẠ VISỊNH VÁT
TRONG BẸNH ĐAI THAO ĐƯƠNG

GVHD:Th.S Nguyễn Ngọc Tâm Huyên
Tên nhóm:
Trần Thị Kim Ngân Nguyễn Thị
Hồng Nhung Trịnh Bửu Hồng
Phương Cao Thị Thanh Thảo
Đinh Thị cẩm Thu Phan Thị
Ngọc Tuyển

MSV10149122
MSV10149137
MSV10149152
MSV10149176
MSV10149190
MSV10149236

TP.HCM, tháng 8 năm 2011.

MỤC LỤC
1. Khái quát.................................................................................................................4
1.1. Sơ lược về bệnh tiểu đường ............................................................................4
1.2 Sơ lược về Insulin...............................................................................................4
1.2.1. Nguồn gốc...................................................................................................4
1.2.2. Cấu tạo........................................................................................................5
1.2.3. Phân loại.....................................................................................................6
1.2.4. Cơ chế ........................................................................................................6
2. Quy trình sản xuất Insulỉn......................................................................................6
2.1. Quy trình sản xuất Insulin trước đây...............................................................6
2.1.1. Đặc điểm ....................................................................................................6
2.1.2. Nhược điểm................................................................................................7
2.2............................................................................................................................. Quy trình
sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để sản xuất Insulin...........................................7
2.2.1....................................................................................................................... Khái quát
quy trình công nghệ ADN tái tổ hợp.....................................................................7
2.2.1.1. Phân lập................................................................................................8
2.2.1.2. Tạo vector tái tổ hợp............................................................................8
2.2.1.3. Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào...................................................9
2.2.1.4................................................................................................................. Chọn lọc,
tạo dòng và biểu hiện của gen............................................................................10
2.2.2....................................................................................................................... Ý nghĩa sử
dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sản xuất Insulin.................................................11
2.2.3. Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ ADN.....................................11
2.2.3.1. Phương pháp 1....................................................................................11
2.2.3.2. Phương pháp 2....................................................................................14
2.2.4. Các phương pháp sản xuất Insulin bằng khác..........................................15
3. Ưu và nhược điểm của Insulỉn..............................................................................17
4. Nguyên tắc dử dụng và bảo quản Insulỉn..............................................................19
4.1. Nguyên tắc sử dụng........................................................................................19

1


4.2. Bảo quản Insulin.............................................................................................19
5. Kết luận và kiến nghị............................................................................................20
Tài liệu tham khảo......................................................................................................21

Như các bạn đã biết vi sinh vật là những sinh vật vô cùng nhỏ bé không thể trông thấy
bằng mắt thường. Tuy nhỏ, nhưng chúng lại có ảnh hưởng vô cùng to lớn đến đời sống của
chúng ta.
Với sự phát triển từng bước của ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử và di truyền học,
các nhà vi sinh vật học y học đã nghiên cứu, nuôi sống và giữ gìn vi sinh vật có ích trong
những điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng những hoạt động có ý nghĩa của nó để tạo ra các chế
phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,...giúp phòng điều trị bệnh cho người.
Ngày xưa cũng như ngày nay,có những căn bệnh có lịch sử rất lâu đời, phổ biến và gây
khó khăn,trở ngại cho việc điều trị bằng các dược phẩm hoá học, trong đó có bệnh tiểu
đường.Vậy có biện pháp nào khác giúp đỡ các bệnh nhân này? Câu trả lời là vi sinh vật.
Đối với bệnh tiểu đường, người ta dùng một loại vi sinh vật để điều trị đó là Insulin.Câu
hỏi đặt ra ở đây là Insulin co tác dụng gì, với những ưu nhược điểm nào. Sau đây,chúng ta hãy
cùng nhau bước vào tìm hiểu các vấn đề này nha!
cg 0 Sũ

2


GIỚI THIỆU CHUNG
Insulin được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Banting và Charles Best tìm ra năm
1921. Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có sự đóng góp rất quan trọng của các chú chó.
Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó và hậu quả là chúng bị đái tháo đường.
Họ đã cố gắng tinh chiết ra một hormone hóa học từ tụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu

đảo Langerhan. Sau đó, những chất này được tiêm vào chú chó bị đái tháo đường để thử
nghiệm và họ nhận thấy bệnh đái tháo đường bị đẩy lùi. Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất
và thường gây những tai biến nguy hiểm, một đội ngũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên
cứu và tạo ra được tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử
nghiệm trên người bệnh. Vào 11 tháng 1 năm 1922, Leonard Thomson-14 tuổi đã được điều trị
thành công ở bệnh viện Toronto bằng tinh chất này (insulin). Ông đã sống được đến ngày 20
tháng 4 năm 1935, thọ được 27 tuổi (sau 13 năm 3 tháng tiêm insulin).
Collip và MacLeod là những người đầu tiên đã dùng chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan
(Insulin) để tiêm cho Leonard Thomson tại Toronto (Canada) ngay sau khi Banting và Best
chiết suất được vài ngày Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã chứng minh rằng insulin là một
protein.
Năm 1955, Frederick Sanger-người đoạt giải Nobel đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin
người. Điều này đã cho phép các nhà khoa học tạo ra một gene insulin, dùng để tạo ra chủng vi
khuẩn biến đổi di truyền có khả năng sinh ra số lượng lớn insulin với độ tinh khiết cao.
Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại Công ty Genetech (Hoa
Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu
tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công.
MỘT SỐ VI SINH VẶT TRONG ĐỜI SỐNG

3. Nám Penicillia

1. KHÁI QUÁT:
1.1 Sơ lược về bệnh tiểu đường:
-Tiểu đường là một dạng bệnh do rối loạn chuyển hóa carbon hydrate khi hormone
insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện ở mức đường
máu luôn cao.


-Bệnh tiểu đường có 2 thể bệnh chính: bệnh tiểu đường loại 1 do tụy không tiết ra
insulin, loại 2 do tiết giảm insulin và đề kháng insulin.

-Biểu hiện: gia đoạn mới phát sinh, người bệnh thường đi tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm
và kèm theo chứng khô miệng, khát nước.
-Nguyên nhân phát sinh bệnh: do insulin tiết ra thiếu hoặc không đủ và tế bào có tính
mẫn cảm với insulin giảm thấp, dẫn tới sự rối loạn quá trình trao đổi đường, nước, chất
béo và chất điện giảm trong cơ thể.
1.2 Sơ lược về Insulỉn:
1.2.1 Nguồn gốc:
- Insulin là một hormon quan trọng, giúp cơ thể hấp thu glucose - một trong
những thành phần chính cung cấp năng lượng cho con người.
- Nguồn gốc của insulin:
A- Từ nguồn gốc động vật
• Từ tụy của bò hay lọn. Ngày nay, insulin được tinh chế bằng phương
pháp sắc kí độ tinh khiết hóa rất cao.
• Insulin người.
- Được sản xuất từ insulin động vật qua các phương pháp:
4 Bán tổng hợp từ insulin lọn.
4 Tái tổ hợp gen: là loại insulin trung tính đon thành phần, được sản xuất
bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sản
đạt đến độ tinh khiết hóa và chất lượng cao nhất, có cấu trúc giống hệt
insulin tự nhiên của người, do vậy ít tạo kháng thể và thời gian tác dụng
ngắn hon.
-

-


1.2.2 Cấu tạo:
- Là một protein gồm 51 aa tạo thành 2 chuỗi polypeptid. Ở hầu hết các loài,
chuỗi A gồm 21 aa, chuỗỉ B gồm 30 aa nối nhau bằng 2 càu nối S- S(disulíua)
- Trọng lượng phân tử khoảng :5800-6000 Dalton

Cấu trúc của phân tử insulin

C-Peptỉd

ỉ.

COOH

Kette

A
TT S
M
R

au

/

10

Jw
S

lũ {
LÍ

Insuỉin
p-Kette
CLU

ALAleụ-TV(1 Lrw VAl

5
1

íừ

Ú
LÍ

U

Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin

Mặc dù trình tự các aaxitamỉn khác nhau giữa các loài nhưng một số đoạn nhất định của phân
tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó có chứa 3 cầu nối disulíua, cả hai đầu của chuỗi A và các
nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B. Sự tương đồng trong tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc
3 chiều của Insulỉn ở các loài khác nhau rất giống nhau. Insuỉỉn chiết rút từ động vật có hoạt
tính sinh học cao hơn các loài khác


CẤU TRÚC KHÔNG GIAN CỦA INSULIN

CÁU TRÚC KHÔNG GIAN
CỦA INSULIN
1.2.3 Phân loại:
-Có 4 loại insulin:
=4 Insulin có tác dung nhanh
4- Insulin tác dụng bán chậm (tmng bình)

4- Insulin tác dụng chậm 4Insulin hốn hợp
1.2.4 Cơ chế:
- Thời gian bán hủy 3-5 phút
- Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi enzym proteinase tại dạ dày
- Hấp thu tốt bằng đường tiêm. Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí
tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận động
- Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận, cơ. Trong đó 50% tại gan
- Đào thải qua thận
2. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN:
2.1 Quy trình sản xuất Insulỉn trước đây:
2.1.1. Đặc điểm quy trình:
Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G. Bantingvà Charles H.
Best )phát hiện ra insulin và vai trò của chúng từ thí nghiệm về những chú chó,
từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin
được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy
nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò
(hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí
trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng)
khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo


hay bò. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều
khó khăn. Sau đó, các phutmg pháp bán tổng họp insulin nguời từ insulin heo và
bò đã đuợc phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide
(transpeptidation) sử dụng trypsin.
Nhuợc điểm của việc sản xuất Insulin dùng trong lâm sàng chủ yếu có nguồn gốc
động vật ( bò và lợn). Tụy của động vật này sẽ đuợc dùng để tách chiết insulin , vì
thế cần một luợng lớn tụy mới có thể sản xuất một luợng nhỏ insulin. Việc insulin
đuợc sản xuất trực tiếp từ tụy động vật thuờng có cấu trúc không hoàn toàn giống
với insulin nguời, hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin nguời ,

khả năng hấp thụ kém, có thể gây ra những phản ứng phụ. Mặt khác trong quá
trình tách chiết, không thể loại bỏ hết đuơc những tác nhân gây bệnh của động vật,
quá trình tách chiết này đòi hỏi kỷ thuật cao, chi phí đắt, không thể sản xuất với
qui mô rộng lớn, giá thành cao.
2.1.2. Nhược điểm quy trình sản xuất Insulỉn chiết xuất từ động vật:
- Insulin động vật (bò và lợn) có cấu trúc không hoàn toàn giống cấu trúc Insulin
ở người
- Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin của người’
- Khả năng hấp thụ kém
- Có thể gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể người( gây dị ứng)
- Trong quá trình tách chiết, không loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh từ đông vật
- Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao
- Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin)
-Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn
-Giá thành cao.
2.2 . Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ họp để sản xuất Insulỉn:
2.2.1. Khái quát về công nghệ AND tái tổ họp:
- Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ
gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào
trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein,
enzym,...), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn
- Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ
thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ họp
- Kỹ thuật AND tái tổ hợp gồm các buớc cơ bản sau:
7


»4 Tách chiết tạo ra AND, ARN theo mong muốn (phân lập gen)
4- Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn và
enzym nối)

'4- Chuyển ( biến nạp) AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen

4- Sàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen đuợc chuyển vào trong tế bào
chủ, tạo số luợng lớn đoạn AND theo mong muốn để sử dụng vào mục đích
khác nhau.
2.2.1.1.

Phân lập gen:
* Tách chiết AND:tùy theo nguồn axit nucleic,có những kiểu tách chiết
khác nhau:
- Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ
protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch AND bằng hóa chất, dung môi, dịch
chiết thích hợp.
- Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết AND nhu trên.
Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm nhu lông, tóc, thịt, máu,
nuớc bọt., mô thân , rễ, lá....
* Tách chiết ARN: quy trình tuơng tự tách chiết AND, dịch chiết sau khi
làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết tủa thu ARN.
* Định luợng AND, ARN: sản phẩm sau khi tách chiết cần có độ tinh sạch
và hàm luợng đủ cho nghiên cứu, dùng phuơng pháp đo quang phổ để xác
định chỉ số hấp phụ, tù đó đánh giá độ tinh sạch và hàm luợng cần thiết.
Hoặc dùng phuơng pháp điện di trên gel thạch xác định băng AND, ARN,
suy ra độ tinh sạch và hàm luợng cần thiết cho nghiên cứu.

2.2.1.2. Tạo vector tái tổ họp:
► Vector tách dòng: là phân tử AND có kích thuớc nhỏ, có khả năng gắn các
gen cần thiết, tự tái bản, tồn tại trong tế bào chủ và đặc biệt phải mang tín hiệu
nhận biết trong tế bào chủ đã mang vector tái tổ hợp -Các loại vector tách dòng
thường dùng :
❖ Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có trong tế bào chất của

vi khuẩn.
❖ Phagơ : phần lớn là phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho
cài các gen khác nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhập vào vi
khuẩn có khả năng và có khả năng sao chép nhanh.
8


❖ Virut của tế bào nhân thực : virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut
herpes...được sử dụng trong tách dòng và chuyển gen ở tế bào động
vật, thực vật
► Enzym cắt giói hạn: là enzym có khả năng nhận biết một đoạn trình tự trên
phân tử AND và cắt AND ở những điểm đặc hiệu. Đồng thời cắt gen từ hệ gen
nào đó, cắt vector tách dòng hoặc vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn các đoạn
gen cần thiết.
► Enzym nối Lỉgasa: là những enzym quan trọng trong tế bào, chúng xúc tác
hình thành các liên kết photphodieste để nối các đoạn axit nucleic với nhau.
-Có 3 loại enzym nối quan trọng trong Công nghệ di truyền: enzym E.Coli AND
tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T4 AND và enzym T4 ARN tách chiết từ
phage T4. Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính adaptor ) cho các enzym đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn ADN do các
enzym cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu sol. Các adaptor đặc trưng riêng cho mỗi
loại enzym.
Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâu nối
trộn lẫn sẽ tạo ra sản phẩm AND tái tổ hợp
2.2.1.3. Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen:
- Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp
AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) - tế bào chủ có thể là vi khuẩn, tế bào động vật,
tế bào thực vật; nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ nhân bản AND tái tổ hợp,
tạo sinh khối lớn.
- Những tế bào chủ chính thường dùng:
❖ Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, ít tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng

AND tái tổ hợp nhanh.
❖ Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro; loại tế
bào này thường dùng vào mục đích cụ thể; như nghiên cứu điều hòa hoạt động
của gen, đột biến gen...
- Những phương pháp chủ yếu được dùng để đưa AND tái tổ họp vào tế bào
nhận:
❖ Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( không có thành
Xelulose) trong môi trường thích hợp
❖ Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm)
9


tạo lỗ thủng nhỏ trên tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào
chủ
❖ Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ hoặc tế bào
trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi 4-8 tế bào
❖ Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển
( súng bắn gen) vào hệ gen của tế bào chủ. Vi đạn là các hạt Volữam hoặc vàng
trộn với gen cần chuyển và phụ gia, vi đạn được bắn vào viên đạn lớn hơn, khi
bắn, viên đạn lớn được giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn.
2.2.I.4. Chon loc, tao dòng và sư biểu hiên của gen:
Việc chọn lọc đúng dòng tế bào như ý không đơn giản và tốn nhiều công sức. Khi
xác nhận ADN tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúng gen cần thiết thì
chúng được sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho gen biểu hiện
♦> Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau khi biến nạp
ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác nhau. Chúng được
nuôi cây thành những dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn không
nhận được plasmit, dòng nhận được plasmit không có gen lạ và dòng nhận đúng
plasmit tái tổ hợp).
Do đó muốn nhận đúng và tách đúng dòng gen từ thư viện ADN, người ta sử

dụng phương pháp:
- Lai axit nucleic: làm tan tại chỗ các khuẩn lạc vi khuẩn trên giấy lọc
nitrocellulose và ADN thoát ra gắn với mẫu thử axit nucleic có mang
dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu. Nếu hiện tuợng bắt cặp bổ sung xảy ra có
nghĩa là gen đã đuợc chuyển vào tế bào nhận
- Phát hiện kiểu hình: đòi hỏi dòng mục tiêu phải có biểu hiện ra ở dạng
protein dễ phát hiện bằng các phép thử.
- Phản ứng miễn nhiễm: khi tế bào nhận đuợc plasmit có gắn đoạn ADN
lạ thì tế bào vi khuẩn mất hoạt tính kháng tetracyclin, do đó khuẩn lạc chỉ mọc
đuợc trên môi truờng có ampicilin, không mọc đuợc trên môi truờng có
tetrecyclin. Đây là dòng tế bào càn chọn
❖ Sự biểu hiện của gen đuợc tạo dòng: nói chung gen lạ sau khi đuợc
đua vào tế bào nhận, muốn gen có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector
có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã phù hợp trên cơ sở là cơ chế điều hòa biểu
biểu hiện của gen. Các vector này gọi là vector biểu hiện.
1
0


2.2.2. Ý nghĩa của sử dụng công nghệ AND tái tổ họp để sản xuất ỉnsulỉn:
Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một buớc nhảy vọt trong việc chữa trị
bệnh tiểu đuờng. Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ này
để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế, khi sử dụng công nghệ này, giá thành sản
phẩm hạ khá nhiều mà chất luợng sản phẩm vẫn bảo đảm, chính là nhờ ý nghĩa sản
xuất sinh khối cao của tế bào nhân tham gia quy trình con nghệ ADN tái tổ hợp.
2.2.3. Quy trình sản xuất Insulỉn bằng công nghệ AND tái tổ họp:
Tổng hợp Insulin nguời là một quá trình sinh hóa gồm nhiều buớc, gồm hai phuơng
pháp
2.2.3.1. Phương pháp 1: Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo
một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoàn

chỉnh.
^ Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã
ho á proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11.
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuy của người. Dùng
phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein. Do hầu hết
các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với
đuôi polyA đó.
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch
mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác,
Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.
Food hi^h in su-gar

in su Hin retease

#ADAM
H8. Tách mARN cửa gen tổng hợp proinsuỉin iừ mẫu nghiền tuỵ của người Ạ Bước
1
1


2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp,
- Cắt gen mã hoá proinsuhn và plasmit bằng một loại enzym giới hạn. Nối bằng
ADN ligase của phageT4. Trong thành phần của vector biểu hiện phải có các
promoter mạnh giúp gen biểu hiện được trong vi khuẩn.
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulỉn ra
ngoầỉ tế bào chất.
Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
- Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá ỉnsulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một promoter

mạnh. Bỉến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coỉỉ.
Ạ Bước 3; Bỉến nạp plasmỉt táỉ tổ hợp vào E.coỉi nhờ phương pháp trộn với dung
dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung đỉện.

1
2


Baclerial cell

íacz ộene

Hu man

€>

Míx the DNAs; they jũín t>y bas« f>aìríng. 'The Products are recombinant plasmlds
and many nonrecoinbinanl plasnniidsRecombiaartt DMA piasmíds
o Introduce the DNA ínto tnaclerial Cells thai
have a mutation .in Iheỉr DWn /acZ g«ne.

H9. Tách và biến nạp Pỉasmic tái tổ hợp vào
Reramt*ir«at
E. Coli
bacterĩa
Sau quá trình biến nạp, cần chọn lọc được
những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn. Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy
trình và gen đánh dấu trên vector được sử dựng. Thông thường là sử dụng laoỉj gan
kháng sinh Ampixilỉn hoặc Tetraxilỉn để chọn lọc. Sau đó kiểm tra dòng chọn lọc theo
nhiều cách khác nhau bằng cách giải đoạn trình tự nucleotic của đoạn gen cài vào vector

tái tổ hợp và so sánh với trình tự gốc.
#Bưửc 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa
vào nồi lên men. Nuôi chúng trong các nồi lên men
với các điều kiện tối ưu. Sử dụng các phương pháp
nuôi cấy liên tục, theo đổ các chất dinh dưỡng liên
tục được bổ sung để đảm bảo sự tăng trưởng của vi
khuẩn theo hàm mũ. Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi
khuẩ được nhân lên qua nguyên phân. Như vậy, chỉ
sau một thời gian ngắn, sinh khối sẽ tăng
^ Bưức 5: Tiền tinh sạch
Sau khỉ lên men càn tách tế bào và khử trùng nhỉệt.
- Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để
tách lóp màng lỉpỉt.
Ạ Bước 6t Hoạt hoá.

1
3


Do hệ thống E.colỉ có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không có khả năng hoạt hoá
insulin.
Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4,
sau đó dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được
mới có hoạt tính cần thiết.
Hình ll:Hoạt hoáproinsulin thành insulin hoàn chỉnh

4 Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin.

Bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch gắn enzym.
Độ tinh sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trình sản

xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh thể ho á.
2.2.3.2. Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Hình 12: Các tỉnh thể ỉnsulỉn

Phương pháp này sẽ tránh được việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến
proinsulin thành insulin.


Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A và B. Xác định
trình tự ADN để qua đó tổng họp và tách hai dòng gen này.
Mỗi ADN đuợc chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tucmg tự nhu sản xuất
proinsulin.
Cuối cùng hai chuỗi A và B đuợc trộn với nhau và hình thành cầu nối
đisulíua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định.

SynthtMc
DNA
oncoding
B châln

Synthetlc
DNA
encọdmg
A Chain

Hình 13.Sản xuất insulin tái tồ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt
Hình 14: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
2.2.4 Các phương pháp sản xuất khác:
• Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng thay thế cho vi khuẩn E.Coli để sản xuất
insulin. Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần như hoàn

chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo. Điều đó làm giảm tối đa tính phức


tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch. Sản xuất insulin dựa trên
công nghệ gene và công nghệ sinh học mang lại rất nhiều lợi ích và
tính năng vuợt trội hơn so với việc thu nhận từ động vật. Insulin đuợc
sản xuất trên nhiều hệ thống khác nhau nhu tế bào E. coli, tế bào
Saccharomyces và ngay cả tế bào thực vật, đều có những thành công
đáng kể. Tuy nhiên khi tạo ra insulin trên các hệ thống trên gặp một
số hạn chế. Novo Nordisk là một trong những công ty hàng đầu thế
giới bán insulin với chất luợng đáng tin cậy, công ty này sản xuất
insulin thuơng mại trên hệ thống tế bào Saccharomyces. Nhóm nghiên
cứu của Novo Nordisk tạo insulin trong hệ thống tế bào nấm men
nhung là Pỉchỉa cho thấy hệ thống này có nhiều uu điểm hơn so với hệ
thống Saccharomyces.
Hiện nay Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đang nghiên cứu
tạo ra insulin theo phuơng pháp này. Đối tuợng đuợc chọn để sản xuất insulin là tế bào
nấm men Pichia. Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, nhóm thực hiện tổng hợp gene mã
hóa cho insulin. Hiện tại nhóm đang tiến hành nhân dòng gene mã hóa cho insulin trên
plasmid mang pBluescript. Plasmid pBluescript mang gene mã hóa cho insulin sẽ đuợc
chuyển nạp vào E. coli. Khi thành công quá trình nhân dòng gene mã hóa cho insulin,
gene mã hóa cho insulin sẽ đuợc biểu hiện trong tế bào Pichia. Kiểm tra quá trình biểu
hiện protein bằng kháng thể chuyên biệt. Tiến hành thu nhận và tinh sạch protein tái tổ
hợp. Buớc đầu kiểm tra hoạt tính insulin trên chuột thí nghiệm.
• Giả insulin :
Cải tiến phuơng thức hoạt động của insulin trong cơ thể nguời bằng cách thay đổi trình
tự axitamin của nó và tạo ra chất tuơng tự. Insulin giả ít kết dính với nhau hơn và
khuếch tán vào máu dễ dàng hơn. Quy trình sản xuất Insulin giả cũng tuơng tự nhu quy
trình sản xuất insulin trên
• phuơng pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phuơng pháp sản xuất này biểu hiện

chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherỉchỉa coli, sau đó thu chuỗi A
và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulíur. Phuơng pháp này có hiệu quả
sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một phuơng pháp cải tiến hơn, phuơng pháp
này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt nhu phuơng pháp cũ,
tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide c khỏi hai chuỗi A và B bằng
trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin.
• Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này


biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin,
được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin ỉn vitro bằng trypsin tạo
thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình
thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này
được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy.
• Mới đây nhất, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương pháp mới.
Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm
superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E.coli.
Bằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình
thành các cầu nốii. Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin
và carboxypeptidase B.
• Các nhà khoa học Anh và Mỹ cho biết họ có thể sử dụng tế bào gốc lấy từ máu trong
dây rốn của trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại 1 khôi phục khả năng sản
xuất insulin trong cơ thể.
•

Ưu thế của phưong pháp mối
Insulin tạo ra gần như hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin ở người.
Tạo ra một số lượng lớn Insulin trong một thời gian ngắn.
Năng suất cao.
Nguồn nguyên liệu dễ tìm ,không nguy hại đến môi trường.

Trong quá trình tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật và chuẩn hóa trong phòng thí nghiệm.
ít tốn kém chi phí.
Giá thành rẻ.

3. ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA INSULIN:
Insulỉn tác dụng nhanh
Ưu điểm:
- Là loại duy nhất dùng trong cấp cứu do tác dụng hạ đuờng huyết nhanh chóng.
- Có thể trộn lẫn với insulin chậm tùy theo mục đích và nhu cầu điều trị.
- Có thời gian tác dụng ngắn và mạnh để làm giảm đuờng huyết sau khi ăn.
Nhược điểm : Thời gian tác dụng ngắn nên phải tiêm nhiều lần trong ngày (4 mũi tiêm dưới
da, thực tế không dùng riêng insulin tác dụng nhanh để điều trị mà phải kết hợp thêm insulin
tác dụng bán chậm hoặc chậm).


Insulỉn tác dụng bán chậm (dịch tiêm đục như sữa)
Đe làm giảm bớt số lần tiêm trong ngày, người ta đã sản xuất ra loại insulin có tác dụng dài
hơn gồm 2 loại insulin là NPH (Neutral Protamine Hagedom) hay IZS (Insulin Zinc
Suspension) hay lent để sử dụng trong chế độ điều trị với 2 hay 3 mũi tiêm trong ngày.
Ưu điểm: của các loại insulin tác dụng tmng bình là có nhiều loại với thời gian tác dụng khác
nhau tùy thuộc vào yêu cầu điều trị và sự thuận lợi của bệnh nhân.
Nhược điếm: có thể gây đau khi trộn với insulin nhanh.
Insulỉn trộn sẵn (dịch tiêm đục như sữa)
Là loại insulin trộn lẫn giữa 2 loại nhanh và trung bình theo tỷ lệ nhất định.
- Có tỷ lệ 30% insulin nhanh và 70% insulin trung bình.
- Có tỷ lệ 50% insulin nhanh và 50% insulin trung bình. Ngoài ra còn tiến hành trộn theo
những tỷ lệ khác mà trong đó loại nhanh chiếm 10- 20- 40%.
Ưu điểm: tiện dùng, phù hợp hơn với sinh lý mà không đòi hỏi phải tự trộn lấy liều khi dùng
riêng từng loại nhanh chậm.
Nhược điểm: vì tỷ lệ pha trộn là cố định nên khó điều chỉnh cho phù hợp với từng tình huống

cụ thể: ăn bữa no nếu tăng liều cả insulin nhanh và chậm sẽ gây hạ đường huyết muộn. Trong
khi lẽ ra chỉ tăng từ 2 đến 6 đơn vị loại insulin nhanh.
Insulỉn tác dụng chậm (dịch tiêm đục như sữa)
Ưu điểm: Chỉ cần một mũi tiêm có tác dụng trong cả 24 giờ trong ngày.
Có thể dùng trong kỹ thuật 4 mũi tiêm/ ngày, 3 mũi nhanh vào trước các bữa ăn và một mũi
vào lúc đi ngủ (22 giờ)
Nhược điểm: Tại chỗ: đỏ, đau nơi tiêm.
Hạ đường huyết không lường trước do tác dụng kéo dài chồng chéo với các mũi tiêm khác.
Thường không làm giảm được đường máu sau ăn do thời gian hấp thu vào máu chậm
4.

NGUYÊN TẮC sử DỤNG VÀ BẢO QUẢN INSULIN:
4.1 Nguyên tắc sử dụng:
Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại 2 có thể chọn dùng insulin có hiệu quả trung
bình, trước bữa ăn sáng khoảng 30 phút tiêm dưới da (1 lần trong ngày, lượng thuốc bắt


đầu khoảng 4-8u) cũng có thể sử dụng hỗn hợp insulin hiệu quả trung bình kết hợp với
insulin hiệu quả nhanh trước bữa ăn sáng, cách mấy ngày lại điều chỉnh lượng thuốc.
Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại 1: dùng phương pháp ở trên thường không đạt
được mục đích khống chế bệnh cần phải dùng phương pháp trị liệu cường hóa insulin
4.2 Bảo quản:
•Giữ các lọ hay ống bút insulin còn nguyên nắp trong tủ lạnh. Không để insulin kết
đông.
•Sau khi mở, insulin có thể được giữ ở nhiệt độ nhà (dưới 30°) trong 1 tháng và sau đó
loại bỏ.
•Insulin có thể được di chuyển an toàn trong túi hay túi xách.
•Insulin có thể bị hư do nhiệt độ quá cao. Không để nơi nhiệt độ trên 30° hoặc ở ngoài
ánh sáng mặt trời.
Không dùng insulin nếu:

•Insulin màu trong chuyển sang đục.
•Quá hạn sử dụng.
•Insulin đã đông cứng hoặc tiếp xúc với nhiệt độ cao.
•Có đóng cục hay lợn cợn trong insulin.
•Thấy có cặn insulin bên trong lọ và không tan ra được khi lắc (tròn) nhẹ lọ.
•Lọ đã mở quá 1 tháng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ:
KẾT LUẬN:
Khả năng ứng dụng của vi sinh vật trong y tế là vô cùng vô tận.những khám phá của con
người về vi sinh vật đã mang lại những lợi ích to lớn, tạo ra những chế phẩm hỗ trợ đặc
biệt và cải thiện sức khoẻ con người.Từ đó cho thấy nhu cầu sản xuất Insulin bằng vi sinh
vật ngày càng tăng,nó thay thế cho các cách tổng hợp Insullin truyền thống là lấy từ tế
bào động vật.Biện pháp này làm giảm chi phí rất nhiều so với phương pháp cũ, đồng thời
lại thân thiện với môi trường KIẾN NGHỊ:
Khuyến khích ứng dụng,phát triển công nghệ sản xuất insulin bằng vi sinh vật:
1. Nhà nước nên đầu tư hợp lý các chi phí cho các công trình nghiên cứu.
2. Thường xuyên mở các hội thảo để cùng thảo luận và đưa ra ý kiến cũng như các
phương phap hiệu quả hơn.
3. Truyền thông để mọi người biết đến để có cách thực hiện và điều trị phù hợp nhất.
4. ngày càng tự hoàn thiện chất lượng cũng như giá thành để mọi tầng lớp có thể sử
dụng.
5. Tăng cường hợp tác với các cơ quan nước ngoài để áp dụng và chuyển giao nhanh


công nghệ cũng như kết quả nghẽn cứu.


TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1- />2-

/>file=article&name=News&sid=l
149
2- />3- />
hoc/2659-insulin- va-cong-nghe-san-xuat-insulin-tren-the-gioi
4- />