Nuôi cấy trên môi trường lỏng

III.NUÔI CẤY
3.1 MỤC ĐÍCH
3.2 PHÂN LOẠI
+ Nuôi cấy trên môi trường lỏng
+ Nuôi cấy trên môi trường đặc
3.3 QUY TRÌNH
3.3.1 Nuôi cấy trên môi trường lỏng
A. Nguyên lý
Một lớp chất phát quang nhạy cảm với oxy được gắn vào lớp silicon ở đáy tuýp
môi trường. Lượng oxy trong môi trường làm mờ đi sự phát quang hoặc phát quang rất ít.
Khi vi khuẩn sinh trưởng sẽ tiêu thụ oxy , hợp chất phát quang thoát ức chế sẽ phát
quang, mức độ phát quang tương ứng với mật độ vi khuẩn có trong môi trường, máy báo
dương khi mật độ vi khuẩn trong tuýp khoảng 105 - 106 /1ml.
B. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
 Vật liệu
• Mẫu thử

Tất cả các loại bênh phẩm ngoài trừ máu và phân

Bệnh Phẩm phải khử tạp

Bệnh phẩm không khử tạp( nếu
lấy vô trùng)

Đờm

Dịch màng phổi

Dịch phế quản

Dịch não tủy

Dịch dạ dầy

Dịch màng bụng

Nước tiểu

Dịch màng tim

Mủ từ các tổn thương hở

Dịch khớp

Tăm bông phết họng

Mủ từ ổ apxe lạnh kín

Tinh dịch, dịch âm đạo, máu kinh

Tủy xương

Tổn thương da

Mảnh sinh thiết từ tổn thương kín

Mô
Chất lượng và số lượng bệnh phẩm
Đờm: 3 – 5 ml có chất nhày mủ
Dịch: 20–40 ml.

Dịch não tủy, màng tim (5 – 10 ml)
Chứa trong túyp vô trùng 50 ml, vặn chặt nắp
Ghi đầy đủ thông tin theo quy định lấy mẫu ( tên tuổi khoa, loại xét nghiệm) trên
thân tuýp
b) Hóa chất – môi trường
•

Hóa chất
-

NaOH (khử tạp & tan đờm)

-

Natri citrat (giữ lại ion kim loại nặng để phát huy tác dụng của NALC)

-

NALC: N-acetyl L-cystein: Làm tan đờm


•

-

KH2PO4, Na2HPO4

-

Nước cất

-

Băng thử pH

-

Hóa chất sát khuẩn: cồn 70%, Presept, Javel hoặc 5% phenol

-

Hóa chất nhuộm ZN

Bộ môi trường lỏng MGIT BACTEC
-

Môi trường lỏng trong tuýp 7 ml gồm: Approximate Foomura, Middlebrook
7H9, nước tinh khiết…

-

Growth Supplement gồm hợp chất dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi
khuẩn lao gồm: Oleic acid, Albumin, Dextrose and Catalase.

-

PANTA: hỗn hợp kháng sinh gồm Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixic
Acid, Trimethoprim, Azlocillin.

c) Các vật liệu khác

-

Tuýp ly tâm: loại 50 ml có nắp xoáy
Pipet : loại thủy tinh (dùng lại) hoặc nhựa (dùng 1 lần)
Lam kính
Hộp lưu tiêu bản

-

Dụng cụ bảo hộ lao động cá nhân như áo choàng, khẩu trang, găng tay…

-

Các vật liệu khác như khay để mẫu, dụng cụ đựng chất thải…

-

Bút viết kính, sổ sách, biểu mẫu cần thiết…

d) Trang thiết bị
-

Tủ an toàn sinh học cấp II


-

Máy lắc (votex)
Hệ thống MGIT BACTEC.
Tủ lạnh, tủ mát

Nồi hấp ướt (02 cái: hấp bẩn và hấp sạch )
Cân (đĩa hoặc phân tích)
Máy ly tâm: đạt lực ly tâm 3000 x g, cối ly tâm rời có nắp đậy, thích hợp cho

-

tuýp ly tâm 50 ml, đáy hình chữ V
Kính hiển vi

C. AN TOÀN
−

Tối thiểu nguy cơ nhiễm chéo, thao tác nhẹ nhàng tránh tạo hạt mù, chỉ mở một

−

tuýp bệnh phẩm trong 1 thời điểm.
Rót nhẹ nhàng dung dịch khử tạp, dung dịch đệm khi ly tâm, nước nổi sau ly tâm

hạn chế bắn tung tóe tạo hạt mù.
− Xử lý những mẫu AFB(+) riêng mẻ khác hoặc cuối cùng
− Sử dụng một pipet vô trùng cho mỗi bệnh phẩm, nên dùng pipet nhựa đã tiệt trùng
có chia vạch và chỉ dùng 1 lần.
Chuẩn bị lượng dung dịch khử tạp ít, dung dịch đệm được chia nhỏ chỉ dùng 1 ống

−

dung dịch đệm/1 mẫu bệnh phẩm.
D. TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị hóa chất

a) Dung dịch MycoPrept
Thành phần: NaOH: 20 g ; Natri Citrat: 14,5 g ; Nước cất: 1000 ml
Hòa tan NaOH và Natri Citrat trong nước cất.

-

0
Hấp 121 C / 15 phút
Chia nhỏ lượng để dùng dần ; Bảo quản ở nhiệt độ phòng; sử dụng < 1 tháng
Hủy khi phát hiện có sự vẩn đục, đổi màu.

b) Dung dịch NALC - NAOH (Chỉ sử dụng trong ngày)


-

Cân sẵn NALC theo lượng 50 mg, 100 mg, 200 mg... bảo quản ngăn mát 2 –
0
8 C

-

Tùy theo số mẫu đờm (tính trung bình 5 ml dung dịch khử tạp cho 1 bệnh phẩm,
mỗi 5 ml đờm cần 25 mg NALC)

-

Chuẩn bị dung dịch khử tạp theo bảng sau:

-

Dung dịch MycoPrep (ml)

NALC ( mg)

10

50

20

100

30

150

40

200

50

250

60

300

70

350


80

400

90

450

100

500

c) Chuẩn bị dung dịch đệm Phosphate, pH 6,8
- Dung dịch A:
Na2HPO4

9,47 g

Nước cất

1000 ml

- Dung dịch B:
KH2PO4
Nước cất

9,07 g
1000 ml

Trộn A và B theo tỉ lệ 1/1 thể tích. Kiểm tra pH ( 6,8 ÷ 0,2)
- Đóng ống 40 ml hấp 121 ºC/15 phút.
- Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hạn sử dụng 1 tuần.
d) Chuẩn bị dd bổ sung supplement

Hút 15 ml dd supplement vào lọ đựng PANTA/OADC. Trộn cho tan hoàn toàn.
Ghi ngày pha trên lọ. Bảo quản tối ở 2 – 8oC, sử dụng trong vòng 5 ngày.


Lưu ý: Nếu tỉ lệ nhiễm trùng cao, có thể giảm thể tích supplememt xuống 14 hoặc
13 ml.
e) Chuẩn bị tuýp MGIT cấy
-

Cấy 01 ống MGIT / 1 mẫu

-

Ghi số XN, tên BN, tuổi và ngày cấy

-

Thông tin phù hợp với phiếu XN và tuýp BP

-

Không chạm tay vào mã vạch

-

Thêm dung dịch bổ sung trước khi cấy (khi chờ khử tạp hoặc ly tâm)

-

Lắc đều lọ dd supplement trước khi sử dụng

-

Cho 0,8 ml supplement vào mỗi ống MGIT.

-

Thao tác vô trùng trong tủ ATSH

2. Quy trình nuôi cấy
a) Quy trình cấy áp dụng đối với bệnh phẩm đờm
1
2

Thêm dung dịch MycoPrep đã bổ sung NALC ngang bằng thể tích đờm
Vặn chặt nắp, votex đến khi đờm tan hoàn toàn (không quá 20 giây). Lộn ngược

3

tuýp để tiếp xúc toàn bộ mặt trong của tuýp.
Để đứng 15 phút (ở nhiệt độ phòng)

4

Thêm dd đệm đến vạch 40 - 45ml.

5

Ly tâm với lực ly tâm 3000 x g /15 phút


6

Chắc bỏ hết nước nổi vào bocan có sẵn chất khử nhiễm. Thêm 1ml dung dịch
đệm, trộn đều để tạo huyền dịch.

7

Cấy 0,5 ml vào 1 tuýp MGIT (đã bổ sung 0,8 ml PANTA - Supplement).

8

Phết 1 tiêu bản nhuộm ZN

9

Cho tuýp môi trường vào máy

b) Quy trình cấy áp dụng đối với bệnh phẩm không xử lí
Dịch não tủy, dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch màng tiim, dich khớp....
1

Ly tâm lấy cặn (3000 x g/15 p)

2

Cấy 0,5 - 1 ml vào môi trường MGIT

3

Phết 1 tiêu bản nhuộm ZN
Lưu ý: Nếu nghi ngờ dịch không vô trùng xử lý như nước tiểu

c) Dịch phế quản
1
2
3
4

Thêm dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:1, trộn đều
Ly tâm (3000 x g/15p) lấy cặn
Chắc bỏ nước nổi, thêm 1 ml dung dịch đệm
Xử lý như đờm

3 . Nhập ống vào máy MGIT BACTEC
1. Mở ngăn kéo muốn nhập
2.Nhấn phím có biểu tượng tuýp cấy có hình mũi tên chỉ xuống
3. Đặt mã vạch tuýp cấy vào vị trí quét mã vạch bên góc trên máy cho đến khi có tiếng
bíp


4. Đặt tuýp cấy vào vị trí đèn LED sáng xanh trong ngăn được kéo ra

5. Lặp lại các bước từ 3 đến 5 để nhập hết tuýp cấy còn lại
6. Đóng ngăn kéo lại khi nhập hết tuýp cấy.
4 . Diễn giải và báo cáo kết quả
a)Diễn giải kết quả từ máy MGIT
Máy báo hiệu kết quả:
- Dương tính: dấu cộng màu đỏ và âm thanh báo bíp bíp
- Âm tính: dấu trừ màu xanh
- Máy báo lỗi: Đèn nháy màu vàng (dấu chấm than)
Lấy tuýp ra khỏi máy
- Khi có đèn báo, mở ngăn kéo có đèn báo
-

Lấy tuýp có đèn báo đỏ hoặc xanh ra khỏi vị trí giếng

-

Quét mã vạch

-

Đóng ngăn kéo

 Các tình huống máy báo kết quả
 Máy báo dương

* Trong vòng 24 – 72 h: thường nhiễm trùng
* AFB: 8 – 12 ngày

 Máy báo âm

* Sau 6 tuần


* Quét mã vạch, lấy tuýp âm, kiểm tra nếu có hiện tượng vi khuẩn mọc, làm tiêu
bản loại trừ trường hợp máy lỗi không báo dương.
 Máy báo lỗi: sau khi có sự cố xảy ra

b) Nhận định kết quả
Các phương pháp đánh giá kết quả
-

Quan sát hiện tượng đục của ống MGIT
Làm tiêu bản nhuộm soi Ziehl – Neelsen
Định danh :
* Test nhanh phát hiện kháng nguyên
* Niacin phát hiện Nicotinic
* Sinh học phân tử (HAIN – CM/AS)

Các tình huống máy báo dương
 Quan sát ống MGIT
-

Nếu môi trường đục: thường do nhiễm trùng
Có các hạt vụn màu trắng ngà ở đáy tuýp, khi lắc lên, hạt vụn vẩn lên nhưng môi
trường trong ống MGIT vẫn trong: khả năng mẫu cấy dương tính.
Lưu ý: tất cả tuýp báo dương, làm smear trên tiêu bản trứng nhuộm Ziehl –
Neelsen tìm Cord factor.
 Làm tiêu bản nền trứng nhuộm ZN

 Chuẩn bị tiêu bản gắn albumin trứng

1 Rửa sạch 1 quả trứng gà, lau cồn
2 Đập 2 lỗ nhỏ ở đầu quả trứng, chắt lấy lòng trắng trứng cho vào tuýp sạch.


3 Hút 1 ml lòng trắng trứng, 9 ml nươc muối sinh lý (NACl 0,9 %) vào tuýp sạch có
4
5
6
7
8

nắp xoáy
Votex rất nhẹ ở mức thấp nhất khoảng 4 -5 phút
Nhỏ 1 giọt huyền dịch trứng lên giữa lam kính sạch
Dàn đều tạo tiêu bản có kích thước 1x2 cm
Để tiêu bản khô hoàn toàn, xếp vào hộp tiêu bản
Bảo quản ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong 1 tuần tránh nhiễm nấm

 Làm smear trên tiêu bản trứng nhuộm ZN tìm Cord factor.

1. Hút cặn ở đáy (+), nhỏ 1 giọt lên nền albumin, dàn nhẹ
2. Để khô tự nhiên trong tủ ATSH
3. Cố định tiêu bản
4. Nhuộm tiêu bản theo quy trình nhuộm ZN
 Quan sát tiêu bản nhuộm ZN
- Soi định danh bằng vật kính x 10 tìm Cord factor. Soi vật kính x 100 khi cấn quan sát chi

tiết. Trên tiêu bản có thể gặp các hình ảnh sau và biện pháp xử lý:
+ AFB có dạng như cuộn thừng, vụn thành đám, kết dải nhỏ sắc nét hoặc rải rác
trong vi trường. Tiến hành định danh bằng phương pháp sắc ký miễn dịch tìm

kháng nguyên MPT64.
+ AFB lẫn với vi khuẩn khác hoặc nấm: phải khử nhiễm, cấy chuyền sang LJ để
theo dõi và định danh.
+ Vi khuẩn khác hoặc nấm: tuýp cấy ngoại nhiễm, xin lại cấy khác để cấy lại
+ Các loại tế bào: ủ ấm và theo dõi tiếp
+ Không thấy gì: Có thể tiêu bản bị bong trôi, làm lại tiêu bản khác, hoặc máy báo
sai dương, ủ ấm và theo dõi tiếp.



•

Định danh vi khuẩn lao (MTB)

Định danh bằng Niacin
+ Cấy chuyển sang môi trường đặc (LJ)
+ Thời gian cấy chuyển 2 - 3 tuần

•

Định danh bằng MPT 64:
Nguyên lý
Thử nghiệm sắc kí miễn dịch phát hiện kháng nguyên MPT 64 đặc trưng của M.

tuberculosis complex bằng cách nhỏ mẫu cấy dương tính vào giếng thử, kháng nguyên
MPT 64 (nếu có trong mẫu cấy) sẽ kết hợp với kháng thể kháng MPT 64 gắn trên thanh
thử tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên, phức hợp này di chuyển tới vùng phản
ứng và được giữ lại bởi kháng thể cố định thứ 2. Nếu mẫu cấy có mặt kháng nguyên MPT
64, vùng phản ứng sẽ xuất hiện vạch màu hồng - đỏ.
Cấu tạo thanh thử: Trên bề mặt thanh thử có giếng thử “S” để nhỏ mẫu, cửa sổ đọc kết

quả có 2 ký tự T “Test Line -vạch thử nghiệm” và C “Control Line – vạch chứng”. Cả 2
vạch T và C không xuất hiện trước khi thực hiện thử nghiệm. Sau khi thử nghiệm vạch
chứng luôn xuất hiện nếu tiến trình xét nghiệm được thực hiện đúng và thanh thử ở tình
trạng tốt. Vạch thử nghiệm xuất hiện khi có đủ kháng nguyên MPB64 của vi khuẩn lao.
Nếu trong mẫu thử không có kháng nguyên MPT64 hoặc có hàm lượng thấp sẽ không có
vạch màu xuất hiện trong vùng T.
•

Các bước tiến hành

1. Lấy thanh thử ra khỏi túi, ghi số XN lên thanh thử
2. Trộn nhẹ nhàng canh khuẩn của tuýp MGIT bằng pipet vô trùng


3. Nhỏ 2 giọt (hoặc 100 μl) huyền dịch vào giếng thử. Huyền dịch sẽ thấm từ giếng
thử qua vùng T và C
4. Đọc kết quả sau 15 phút
5. Kết quả:
+ Dương tính với MTB: chỉ xuất hiện 2 vạch màu đỏ hoặc hồng tại vị trí T và C
+ Âm tính: Chỉ xuất hiện 1 vạch màu ở vùng C, không có vạch màu ở vùng T
+ Không phân biệt được kết quả: Không có vạch màu ở vùng C, phải làm lại với test
khác.
 Quy định trả kết quả

Máy báo

Soi ZN

Dương

Vi

khuẩn,

Định danh MTB
nấm

Trả kết quả
Ngoại nhiễm

AFB (-)
Dương

Cuộn thừng

Dương tính

Cuộn thừng, kết Dương

M.Tuberculosis

dải nhỏ, rải rác
AFB vụn

Âm tính (lần 1)

NTM
Cấy thêm mẫu

Âm tính (lần 2)

NTM


Dương

AFB lẫn vi khuẩn Dương tính

M.Tuberculosis

khác, phân lập
Không thấy gì  ủ

Âm tính

ấm theo dõi tiếp 
làm lại tiêu bản 
Không thấy gì
Âm tính

Âm tính

E. LƯU Ý

-

Khi xử lý mẫu và cấy:
Với tube bệnh phẩm có quá nhiều đờm > 5ml , cần bỏ bớt để tránh xử lý không hoàn

-

toàn dễ gây ngoại nhiễm
Không xử lý mẫu đờm > 5 ml vì nồng độ NaOH khi cấy cao, máy báo dương sai
Ghi số XN, tên bệnh nhân vào tuýp, môi trường, lam kính …trước khi cấy và kiểm tra

-

đối chiếu thông tin ở từng bước.
• Khi máy báo dương:
Máy báo dương cần lấy tube dương ra, in báo cáo những tube dương đã lấy và ghi mã

•

số bệnh nhân lên tờ báo cáo, ghi ngày báo dương trên tube dương vừa lấy ra để tiện
việc theo dõi. Tờ báo cáo được in cần lưu vào hồ sơ máy MGIT & có sự xem xét của
-

trưởng khoa
Với những mẫu dương nhưng nhuộm soi không thấy gì cần ủ ấm , theo dõi tiếp, cứ 25 ngày làm smear để kiểm tra lại, nên làm đủ 3 lần trước khi trả ra kết quả cuối cùng

3.3.2 Nuôi cấy môi trường đặc
A. Nguyên lý


-

Bệnh phẩm phải xử lí trước khi cấy để loại bỏ các vi khuẩn không phải Mycobacteria.
Sau xử lí bệnh phẩm được cấy vào môi trường, ủ ấm và theo dõi ở nhiệt độ và thời gian
thích hợp.

-

Mycobacteria nếu có sẽ phát triển thành khuẩn lạc quan sát thấy trên bề mặt môi trường.

-

Kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện 10-100 vi khuẩn /ml bệnh phẩm.

-

Nuôi cấy xác định chính xác vi khuẩn lao và thu thập chủng để phát hiện tính kháng
thuốc.
B. Tiến hành
1. Xử lý bệnh phẩm
 Bệnh phẩm đờm: 3 phương pháp khử nhiễm thông dụng

a

Phương pháp cấy ly tâm khử nhiễm bằng NALC– NaOH
N-acetyl L-cysteine (NALC) có tác dụng làm tan đờm, NaOH có tác dụng tan đờm

và khử nhiễm, natri citrat có tác dụng cố định ion kim loại nặng có mặt trong mẫu đờm
để không ảnh hưởng tới hoạt tính tan đờm của NALC. Phương pháp này ít ảnh hưởng đến
sự sống của vi khuẩn lao vì nồng độ NaOH thấp.
-

Chuẩn bị:
+

Dung dịch NALC – NaOH: Mỗi bệnh phẩm chuẩn bị khoảng 5 ml tương ứng 5 ml

đờm

+

Môi trường Lowenstein – Jeelsen

- Các bước thực hiện:
+

Lấy 3 - 5 ml đờm (ít nhất 2ml, không quá 5 ml) vào tuýp li tâm, thêm lượng ngang
bằng dung dịch NALC – NaOH xoáy chặt nắp.

+

Lắc đảo tuýp cho đến khi đờm tan hoàn toàn (không quá 20 giây vì sẽ làm bất hoạt
NALC)

+

Lộn ngược tuýp đờm để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với toàn bộ mặt trong của
tuýp.

+

Để đứng tuýp ở nhiệt độ phòng 15 phút.


+

Thêm dung dịch đệm ít nhất đến vạch 40 ml, trộn đều

+

Li tâm 3000g/15 phút.

+

Chắt bỏ hết nước nổi.

+

Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc đều tạo huyền dịch để cấy

b
-

Phương pháp cấy ly tâm khử tạp bằng NaOH 4% (Petroff cải tiến)

Chuẩn bị:
+ Dung dịch NaOH 4%
+ Môi trường LJ

-

Các bước thực hiện:
+

Lấy 3- 5 ml đờm (ít nhất 2ml và không quá 5 ml) vào tuýp li tâm, thêm 1 lượng
ngang bằng dung dịch NaOH 4% xoáy chặt nắp.

+

Lộn ngược tuýp để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với toàn bộ mặt trong của tuýp
đến khi đờm tan hoàn toàn (không quá 20 giây).

+

Để đứng tuýp ở nhiệt độ phòng 15 phút.

+

Thêm dung dịch đệm ít nhất đến vạch 40 ml

+

Li tâm 3000 g / 15 phút.

+

Chắt bỏ hết nước nổi

+

Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc đều tạo huyền dịch để cấy.

c

Phương pháp cấy không ly tâm khử tạp bằng NaOH 4% (phương pháp đơn giản)

Thường áp dụng với mẫu đờm AFB (+) nhằm mục đích thu thập chủng làm kháng sinh

đồ hoặc những phòng xét nghiệm mới triển khai nuôi cấy.
-

Chuẩn bị:

+ Dung dịch NaOH 4%
+ Môi trường Ogawa cải tiến
-

Các bước thực hiện:

+

Lấy 3 – 5 ml đờm (ít nhất 2ml và không quá 5 ml) vào tuýp nắp xoáy

+

Thêm 1 lượng ngang bằng dung dịch NaOH 4 %, vặn chặt nắp.


+

Lắc tuýp đến khi đờm tan hoàn toàn (không quá 20 giây)

+

Lộn ngược tuýp đờm để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với toàn bộ mặt trong của
tuýp

+

Để đứng tuýp ở nhiệt độ phòng 15 phút, không ly tâm, tạo huyền dịch để cấy.

Lưu ý: Làm tiêu bản XNTT trước khi cho dung dịch khử tạp, không làm tiêu bản từ
huyền dịch cấy
Sơ đồ mô tả các bước nuôi cấy

 Các dịch khác ( dịch não tủy, dịch màng phổi, màng bụng...)
- Dịch nhiều, thêm dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:1, trộn đều
- Ly tâm 3.000 x g / 15 phút
- Chắt bỏ nước nổi
- Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc đều tạo huyền dịch để cấy.
- Nếu nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lý cặn bằng phương pháp NALC-NaOH.

Lượng dịch ít < 2ml (thường gặp dịch màng tim, dịch não tủy) không cần li tâm, nếu dịch
vô trùng cấy trực tiếp vào môi trường, nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lí theo phương pháp
NALC-NaOH.
2. Cấy vào môi trường (huyền dịch bệnh phẩm đã khử nhiễm hoặc cặn dịch vô trùng
sau ly tâm) và ủ ấm.


 Chuẩn bị
- Tuýp môi trường phải dán nhãn rõ ràng, ghi đủ thông tin: số cấy, tên bệnh nhân, ngày

cấy.
- Số cấy thống nhất từ tuýp bệnh phẩm, phiếu xét nghiệm, sổ xét nghiệm, tuýp môi
trường cấy và tiêu bản.
- Tuýp môi trường có nhiều nước phải hút bỏ nước trước khi cấy
- Mỗi mẫu bệnh phẩm cấy vào 2 tuýp môi trường đặc LJ, (hoặc Ogawa phương pháp
đơn giản).

- Mỗi mẫu cấy làm 1 tiêu bản nhuộm soi để đánh giá kĩ thuật cấy
 Thao tác cấy và ủ ấm
-

-

Sử dụng riêng pipet nhựa vô trùng chia vạch (hoặc pasteur) cho mỗi mẫu cấy
- Nhỏ vào mỗi tuýp môi trường 0,1 ml huyền dịch (tương đương 2-3 giọt)
- Đồng thời nhỏ 1 giọt huyền dịch lên lam kính, làm tiêu bản để nhuộm ZN
Láng đều huyền dịch trên bề mặt môi trường
Để tuýp môi trường nghiêng trên khay, vặn nắp lỏng
Ủ ấm 35-37 0C
C . DIỄN GIẢI VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ
 Quy định về thời gian theo dõi định kỳ
-

Kiểm tra nhiễm trùng : sau 24 – 48h

-

Sau 1 tuần ủ nghiêng trong tủ ấm, vặn chặt nắp cấy và để ống cấy thẳng đứng

-

Theo dõi trong vòng 7 ngày phát hiện Mycobacteria mọc nhanh

-

Đọc kết quả cấy hàng tuần đến 8 tuần.
 Tính chất khuẩn lạc

-

Khuẩn lạc M. tuberculosis điển hình dạng R xốp, màu trắng, mọc chậm sau 7 ngày.

-

Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria không phải lao (NTM) dạng S trơn bóng, nhày, có
(hoặc không) sắc tố, có thể mọc nhanh trong vòng 7 ngày.
Hình ảnh khuẩn lạc MTB


Hình ảnh khuẩn lạc của một số loài NTM

 Vấn đề ngoại nhiễm

Ngoại nhiễm có thể xảy ra trong suốt quá trình ủ ấm. Có 2 loại ngoại nhiễm sau:
a) Nhiễm vi khuẩn


Thng xy ra trong vũng 24 - 48 h, thờng gặp trên cả 2 ống cấy, do khử tạp cha
đạt, nhiễm trùng rầm rộ, mặt môi trờng nhày, ớt, thậm chí vữa toàn bộ môi trờng. Khi
nhiễm khun môi trờng chuyển màu, sự chuyển hoá của vi khuẩn sinh ra acid làm pH
môi trờng giảm, chất chỉ thị Malachit đổi màu xanh tối, đậm độ màu xanh phụ thuộc
lợng vi khuẩn nhiễm trên môi trờng. Khi nhiễm toàn bộ ống cấy M.tuberculosis không
thể mọc trong điều kiện pH thấp, phải huỷ bỏ ống cấy.
Hiếm gặp nhiễm khuẩn muộn, thờng nhiễm 1 phần ống cấy, vẫn tiếp tục quá
trình ủ ấm, nếu có khuẩn lạc lao cần phân lập cấy truyền chủng.
b) Nhin nm
Thờng xảy ra muộn trong quá trình 8 tuần ủ ấm, thờng do nhiễm từ mụi trng m

(t m, bung m), nếu phát hiện sớm khi nấm mọc rải rác có thể phân lập đợc chủng
vi khuẩn lao mọc lẫn trên môi trờng, phát hiện muộn thờng mất chủng, vì nấm mọc kín
toàn bộ môi trờng. Nhiễm nấm sớm thờng do bệnh phẩm bị nhiễm nấm, hoặc do
dụng cụ hay thao tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến 1 tuần, phải huỷ ống cấy.
Quy nh tr kt qu

Kt qu cy

Kt qu nh Tr kt qu
danh MTB

Ngoi nhim c 2 ng cy

Ngoi nhim

khụng phõn lp c khun
lc lao

Dng tớnh

m tớnh

Dng tớnh

M.tuberculosis

m tớnh

NTM (s lng khun lc)

( ln 1)

Cy thờm mu

m tớnh

NTM ( ớt nht 2 mu cú KQ

(ln 2)

ging nhau)
m tớnh


- Mẫu cấy âm tính trả kết quả sau 8 tuần
- Mẫu cấy ngoại nhiễm trả kết quả ngay khi phát hiện ngoại nhiễm
- Mẫu cấy dương tính phải định danh trước khi trả kết quả
- Mẫu cấy nghi NTM yêu cầu cấy thêm mẫu khác, ít nhất 2 mẫu có cùng loại NTM kết

quả cấy mới có giá trị.
D. LƯU Ý
-

Để đảm bảo chất lượng cấy XNV phải thực hiện nghiêm ngặt qui trình kỹ thuật, phải
được đào tạo, có kĩ năng và cần kinh nghiệm.

-

Phải phân loại mẫu trước khi xử lí: dịch vô trùng, dịch lẫn máu, đờm tươi, đờm bảo
quản, nguồn mẫu từ địa chỉ khác nhau như MDR, bệnh nhân thường...để xử lí thích

hợp nhất.

-

Xử lí mẫu càng sớm càng tốt. Mẫu bảo quản 2 - 8 0C không quá 72 giờ, dịch dạ dày,
nước tiểu xử lí sớm trước 4 giờ kể từ khi lấy mẫu.

-

Mỗi mẻ xử lí 6 - 8 mẫu
+

Ly tâm đủ 3000g/15-20 phút, nhiệt độ 10

0

C, nếu máy ly tâm thường, nên có

khoảng chờ giữa 2 lần ly tâm để nhiệt độ máy giảm xuống.
+

Tuân thủ qui trình xử lí: nồng độ hóa chất, thời gian tiếp xúc. Xử lí mạnh làm chết
vi khuẩn lao, xử lí không đạt tăng tỉ lệ ngoại nhiễm. Trường hợp đặc biệt có thể
tăng thể tích hoặc nồng độ hóa chất, không kéo dài thời gian khử nhiễm..

+

Tránh nhiễm chéo và nhầm lẫn, không mở đồng thời các tuýp mẫu. Chia nhỏ
lượng dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm, không chắt trực tiếp dung dịch khử
nhiễm hay dung dịch đệm vào bệnh phẩm.

+

Môi trường, hóa chất, sinh phẩm và dụng cụ trong hạn sử dụng và vô trùng.

+

Kiểm tra cẩn thận về hành chính từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết quả để
tránh nhầm lẫn.