Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase từ vỏ lụa sắn theo phương pháp bề mặt năng suất 18000kgngày

MỞ ĐẦU
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước và
trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000
dalton nên không qua được màng bán thấm.
Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợp
hóa học. Người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc
vi sinh vật. Với những ưu điểm vượt trội - tốc độ sinh trưởng nhanh, hệ enzyme
phong phú và có hoạt tính cao, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm, vi sinh vật đã
trở thành nguồn nguyên liệu thu enzyme chủ yếu thu hút được nhiều quan tâm của
các nhà nghiên cứu và sản xuất.
Enzyme không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi
sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm,
trong y học, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Vì vậy mà những
nghiên cứu sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu
thế kỉ XX .
Mặt khác, hiện nay các nhà máy chế biến tinh bột sắn thải ra hàng trăm ngàn tấn bã
thải. Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất 30-100 tấn/ngày thì sẽ sản
xuất được 7,5 - 25 tấn tinh bột, kèm theo đó là khối lượng lớn vỏ lụa sắn. Lượng vỏ
lụa này hiện nay vẫn chưa được xử lý riêng rẽ gây mùi hôi thối, ô nhiễm môi trường
cho cộng đồng dân cư sống quanh khu vực nhà máy chế biến tinh bột sắn. Chính vì
vậy cần có phương pháp xử lí để giảm thiểu độ ô nhiễm đồng thời tạo ra những sản
phẩm có giá trị, nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu.
Xuất phát từ thực tế đó, ý tưởng sử dụng vỏ lụa sắn – thành phần chứa hàm
lượng cellulose rất cao, làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất cellulase.
Nó không chỉ góp phần tạo ra nguồn enzyme mang lại nhiều ứng dụng trong cuộc
sống hằng ngày của con người mà còn góp phần giải quyết tình trạng ô nhiễm môi
trường của các nhà máy tinh bột sắn.
Trên cơ sở đó, tôi được thực hiện đề tài: “Thiết kế nhà máy sản xuất
enzyme cellulase từ vỏ lụa sắn theo phương pháp bề mặt năng suất
18000kg/ngày ”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Tổng quan về enzyme cellulase [1]
1.1.1. Định nghĩa enzyme cellulase
Cellulase là một phức hợp enzyme phân giải cellulose tạo thành β-glucose.
Nó được sản xuất nhờ các vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại.
Ngoài động vật nhai lại không còn động vật nào khác sản xuất được enzyme này.
Cellulase là hệ enzyme có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose,
chuyển hóa các hợp chất cellulose trong rác thải tạo nguồn năng lượng thông qua
các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác:
từ các chất thải nhà máy giấy như: các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu hồi
năng lượng như ethanol.
Trong cấu trúc của cellulose chủ yếu là liên kết β-(1-4) glucosit. Để phá hủy
hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những
tác động đặc trưng riêng biệt. Sau khi enzyme cellulase (còn gọi là endoglucanase
D) và enzyme β-glucosidase (còn gọi là cellobiase) phá hủy không chọn lọc β-1,4
gluccan thành các mảnh có khối lượng phân tử nhỏ oligocellulose. Enzyme
cellobiosidase (còn gọi là cellobiohydrolase) phá hủy tiếp các mảnh nhỏ này cho tới
đơn vị nhỏ nhất là đường đơn.
1.1.2. Tính chất và cơ chế hoạt động của cellulose [1]
1.1.2.1. Phân loại enzyme cellulase
Enzyme tham gia phân hủy cellulose được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu:
- 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91). Enzyme cắt đầu không
khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt các
tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase.
Enzyme này có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay
đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enyme endocellulase phân giải chúng.
- 1,4 β-D glucan 4 glucanohydrolase (EC 3.2.1.4). Enzyme này tham gia

phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, lignin và β-D glucan. Sản phẩm
của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác
động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh. Enzyme
này còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 glucanase và C-cellulase.


Hình 1.1 Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Hình 1.2 Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan 4 glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
- β-D glucoside glucohydrolase (EC 3.2.21). Enzyme này tham gia phân hủy
cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân giải cellulose nguyên
thủy.Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase.


Hình 1.3 Cấu trúc enzyme β-D glucoside glucohydrolase (EC 3.2.21)
1.1.2.2. Tính chất của cellulose [25]
Cellobiohydrolase gồm hai loại Cbh I và Cbh II.
Cbh I có trọng lượng phân tử khoảng 65 kD, điểm đẳng điện là 4,4 (PI =
4,4). Loại enzyme này tác động lên cellulose vô định hình và kết tinh nhưng chúng
không tác động đến cellulose biến tính như CMC.
Cbh II có trọng lượng phân tử là 53 kD, PI = 5,0. Chúng cũng không tác
động lên CMC, chúng có khả năng tác động lên cellulose hòa tan và không hòa tan.
Endoglucanase chia thành hai loại Egl I và Egl II. Egl I có trọng lượng phân
tử 48,212 kD và Egl II có trọng lượng phân tử 42,2 kD. Các enzyme này có thể hoạt
động ở nhiệt độ khá cao.
β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở
pH rất rộng (pH = 4,4-8,4), trọng lượng phân tử 54-98 kD, PI = 8,4 và có thể hoạt
động ở nhiệt độ cao.
1.1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase [25]
Hệ enzyme cellulase sẽ phân hủy thành hai phần tử glucose theo cơ chế:

Cellobiohydrolase I (CBHI) sẽ tác động tại đầu khử, cellobiohydrolase II (CBHII)
sẽ tác động vào đầu không khử, endoglucanases (EG) thủy phân các liên kết bên
trong và β-glucosidase tách các cellobiose disaccharide thành glucose.


Hình 1.4. Cơ chế tác động phân giải của tổ hợp enzyme
Theo nghiên cứu của Ogawa và Toyama còn có 1 enzyme C 2 có tác dụng
trung gian giữa exoglucanase (C1) và endoglucanase (Cx). Enzyme này tác động vào
các phần tử cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những loại
cellodextrin hòa tan. Sau đó enzyme C x sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodextrin
này thành cellobiose.
Các chế phẩm enzyme cellulose có thể thủy phân các cellulose tự nhiên như
giấy lọc, hay dẫn xuất của cellulose như Carboxylmethyl cellulose (CMC) hoặc
Hydroxylethyl cellulose (HEC) bằng cách phá vỡ liên kết β-1,4-glucoside và β-,4glucanase. Vì vậy để xác định hoạt tính của C1 người ta sử dụng các loại cellulose
tự nhiên, để xác định hoạt tính của C x người ta sử dụng môi trường thạch có bổ sung
CMC hay HEC.
1.1.3.Ứng dụng của enzyme cellulose[24]
1.1.3.1. Nguồn thu nhận enzyme cellulase[24]
Có thể nói nguồn phân giải cellulase bởi vi sinh vật là một trong những chu
trình quan trọng của tự nhiên. Người đầu tiên nghiên cứu khả năng phân giải của
cellulose của các vi sinh vật kị khí là Popov vào năm 1875, tiếp đó là Omelianxki.
Các môi trường nghiên cứu phân lập vi sinh vật loại này trở thành kinh điển. Con
người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose bởi vi khuẩn hiếu khí là G.
Van Iterson vào năm 1903.


Trước đó, hoạt động phân giải cellulaese bởi các vi sinh vật sống trong dạ cỏ
của các loài động vật nhai lại đã được chứng minh (1955). Đến năm 1971, người ta
đã phân lập được một số loài vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose trong dạ
cỏ. Trong đó có hai giai đoạn nghiên cứu kĩ hơn cả là Ruminococus và R.

Flavefacicus.
Về sau này, rất nhiều vi sinh vật phân giải cellulose được tìm thấy trong đất,
nước, phân bón hữu cơ. Đáng chú ý hơn cả là việc ứng dụng vi khuẩn thuộc nhóm
Celludomonas vào việc lên men phân giải bã mía và rát thải thực vật. Sưu tập giống
QM (QM collection) của Massachusetts cũng có khoảng 14000 chủng nấm có khả
năng phân giải cellulose trong đó có các chủng nổi tiếng như Trichoderma viride,
Sporotrichum P. Ruinosum, penicillium pusillum,....
1.1.3.2. Ứng dụng [26]
Hiện nay, công nghiệp thủy phân nhờ enzyme đã và đang phát triển với tốc
độ nhanh chóng. Cùng với các enzyme quan trọng khác, cellulase đã được ứng dụng
rộng rãi vào các mục đích khác nhau như:
Trong công nghiệp:
Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn
gia súc và tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để
tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực
vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được
tăng lên. Một số nước đã sử dụng cellulase đẻ xử lý các loại rau quả như bắp cải,
hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các
loại tảo biển...
Cellulase còn được ứng dụng trong sản xuất glucose mật đường từ nguyên
liệu giàu cellulase như rơm, rạ, mạt cưa, gỗ vụn, dăm bào...thay thế dần cho phương
pháp thủy phân bằng axit. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức
hệ citase, trong đó có cellulase, thành tế bào của các hạt đại mạch bị phá hủy tạo
điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa.
Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất
lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng axit để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt
là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân,
dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men.

Những ứng dụng cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.
Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.
Trong lĩnh vực sản xuất nhiên liệu, enzyme cellulase ngày càng được quan
tâm do các enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa
các hợp chất kiểu linocellulose và cellulose trong các rác thải tạo nên nguồn năng
lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu
năng lượng khác. Ví dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy
và giấy có thể thu nguồn năng lượng nhuwethanol. Hiện nay vẫn có số lượng lớn
các công trình đề xuất những phương pháp có thể thực hiện được trong việc sử dụng
các enzyme để thủy phân cellulose có trong các chất thải hữu cơ tại thành phố lớn
để thu hồi các sản phẩm đường có thể lên men và cuối cùng tạo ra ethanol và
butanol.
Ngoài ra cellulase còn được ứng dụng trong việc phá hủy vách tế bào, giúp
cho việc trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc được dễ dàng hơn. Trong công
nghiệp sản xuất vải sợi từ bột gỗ, sản xuất tơ nhân tạo, cellulase được bổ sung vào
thành phần chất tẩy giặc để làm mềm vải.
Trong nông nghiệp và xử lý môi trường:
Bên cạnh những ứng dụng trong công nghiệp, cellulase còn được ứng dụng
trong việc giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường và cải tạo đất. Cellulase được dùng để
xử lý phân, rác thải tạo ra các sản phẩm cuối cùng là phân hữu cơ, gồm các thành
phần như: N, P, K, Ca, S... các yếu tố vi lượng như: Fe , Mn, Cu, Zn, B, Mo,
Na...cùng với hàng tỉ tế bào sinh vật, trứng giun, ấu trùng, côn trùng có ích giúp đất
tơi xốp, dễ canh tác, giảm đến mất thấp nhất bệnh cây trồng. Các kháng sinh do vi
sinh vật tiết ra trong đất hay có sự có mặt cua hoocmon trong phân hữu cơ sẽ kích
thích sinh trưởng của cây. Phân hữu cơ lại có giá thành rẻ hơn các loại phân hóa học
khác.
Ngoài ra cellulase còn phân hủy xác thực vật còn lại trên ruộng đồng để làm
màu mỡ cho đất, phân hủy các loại chất thải rắn hoặc nước có chứa cellulose để làm
sạch môi trường . Có thể nói cellulase là một trong những loại enzyme được ứng

dụng rộng rãi cả trong công nghiệp, nông nghiệp cũng như trong sinh hoạt hằng
ngày.
1.2. Tổng quan về hệ Vi sinh vật phân giải cellulase:
1.2.1. Vi khuẩn [18]


Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes,
Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium,
Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,
Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia
riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter
freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi
sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử
dụng gỗ làm nguồn thức ăn.
Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+)
hiếu khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus. Đối với các
dòng ưa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của
chúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt
độ 750C.
1.2.2. Xạ khuẩn [19]
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm.
Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. ADN của xạ khuẩn
rất giàu G+C chiếm 57-75 %. Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô. Xạ khuẩn
còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại
kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản
sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống này
như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans.
231.2.3. Nấm [2]
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo

những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong
lĩnh vực phân hủy cellulose. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và
dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn.
Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma
viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,
Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus
niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy
trình phân hủy cellulose ở nhiều môi trường khác nhau.


Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm
Trichoderma là nguồn thu enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá
cao.
Trong đồ án thiết kế của tôi, tôi sử dụng chủng Trichoderma reesei.
1.3. Tổng quan về Trichoderma reesei. [23]
1.3.1 Lịch sử phát hiện
Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó
được biết là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng
của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các
ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội
Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở
Nam Thái Bình Dương.
Chương trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã
số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài
suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên
lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là
Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của
Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy
cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này
và các thể đột biến trên chủng đó.

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu
và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của
Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần
đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma.
Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo
các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng
dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu
về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối
kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm
soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên
cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới [Theo Christian P. Kubicek và Gary E.
Harman].
1.3.2 Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei[24]


1.3.2.1 Vị trí phân loại
Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum):
Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota .[21]
Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một
diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được
chia thành 10 dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota
được xếp vào dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành
riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng
phân loại .
Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of
Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như
sau[24]:
Giới :
Ngành:
Lớp :

Bộ :
Họ :
Giống :
Loài :

Fungi
Ascomycota
Ascomycetes
Hypocreales
Hypocreaceae
Trichoderma
Trichoderma reesei

Đặc điểm hình thái
Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên
trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng
vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông
thường là 5-10 µm).
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở
cuối nhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,
không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy.
Bào tử của Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu
trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình
elip hoặc hình thuôn.
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone).
Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này
thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất
thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có

kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome)
hay biên thể (lomasome).
Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có
nhiều lỗ thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế
bào phía sau ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi
quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương
đối ít ( 6 ở T.reesei).
Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân
thực (Eukaryote) khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số
lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) :
bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 3040 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24
loại protein)
Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ
nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía
đỉnh ngọn sợi nấm.
Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis)
hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật
khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp
với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo
(chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều
kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh
(endospore).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên
một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiềumycelia), sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc
(colony).
Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng
(anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho
việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm.

Hình 1.5: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử
( Nguồn bởi G.B.Sharples)
1.3.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa[2]
1.3.3.1 Đặc điểm sinh thái
T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty.
T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm
sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 250C-300C, chậm ở
350C-370C. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành
bào tử nhỏ và ở mép bất thường. Trong khi ở 37 0C, bào tử không xuất hiện sau 7
ngày nuôi cấy.

Hình 1.6: Khuẩn lạc T.reesei sau 47 ngày nuôi cấy.
Môi trường sống


Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật
hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít
tìm thấy thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có mặt khắp
mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu
rừng nhiệt đới ẩm hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc.
Nhu cầu nhiệt độ tối đa của môi trường sống đặc trưng cho từng loài.
Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và chúng sử dụng nhiều
nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.Trichoderma có
thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa (6-pentylpynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của
Trichoderma
1.3.3.3 Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh
Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids,
trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid . Trichoderma có khả năng sản xuất đa
dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon, emodin .
1.3.3.4 Môi trường nhân sinh khối [22]

Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều
cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…
1.3.4 Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma [22]
Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt
động" khác nhau, chúng có thể sử dụng:
Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác
nhân gây bệnh
Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng,
không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi
trường trước các vi sinh vật khác.
Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong
loài nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng.


Hình 1.7: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium
[(Nguồn: DienTrang Biolab)]
1.4. Các phương pháp lên men [2]
Dựa vào mức độ thông khí có hai phương pháp lên men sau.
1.4.1. Phương pháp lên men chìm
Dùng cho cả VSV hiếu khí và kỵ khí, chỉ cần thay đổi chế độ sục khí.
- Sử dụng môi trường dinh dưỡng lỏng (môi trường dịch thể). Phổ biến trong
sản xuất men bánh mì, protein đơn bào từ VSV, chế phẩm vi sinh.
Ưu điểm:
- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho 1 đơn vị sản phẩm thấp.
- Dễ cơ khí hóa, tự động hóa cho toàn bộ quá trình.
Nhược điểm:
- Trang bị kỹ thuật cao, chế tạo đặc biệt chịu áp lực cao, kín và làm việc trong
điều kiện vô trùng tuyệt đối. Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ.
1.4.2 Phương pháp lên men bề mặt [2]

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất
enzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng.
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô
mảnh, bột đậu tương,… Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủy
phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng. Môi trường lỏng ít dùng
để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này.
- Ưu điểm của phương pháp này:
+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp.
+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất
nhiều so với nuôi cấy chìm.
+ Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản.


+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc
vận hành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém.
+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý.
- Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:
+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn.
+ Tốn nhiều diện tích cho quá trình nuôi cấy.
Đây là phương pháp đang được sử dụng khá phổ biến hiện nay. Và đồ án sản
xuất enzyme cellulase từ Trichoderma reesei của em sẽ sử dụng phương pháp lên
men bề mặt.
1.5. Tổng quan về nguyên liệu vỏ lụa sắn:
1.5.1. Cấu tạo của củ sắn:[21]
Củ sắn có kích thước trung bình dài 25 – 38 cm, đường kính 3-6cm. Tùy theo
giống, điều kiện đất đai và thời gian thu hoạch mà củ sắn có kích thước trên dưới
kích thước trung bình. Cấu tạo của củ sắn gồm 4 phần chính:
+ Vỏ gỗ (còn gọi là vỏ lụa) có màu nâu sẫm hoặc màu nâu vàng, bao bọc
bên ngoài củ sắn, dày 0,2 ÷ 0,6 mm, chiếm khoảng 0,3 ÷ 0,5 trọng lượng toàn củ.
Lớp vỏ gỗ cấu tạo chủ yếu là cellulose và hemicellulose, cho nên mặc dù rất mỏng

nhưng cứng và bền. Vỏ gỗ có nhiệm vụ bảo vệ củ sắn khỏi tác động của các yếu tố
bên ngoài gây hư hỏng.
Cấu tạo của củ sắn gồm 4 phần chính:
+ Vỏ thịt (còn gọi là vỏ cùi) nằm trong lớp vỏ gỗ, có màu trắng, vàng, hoặc
hồng tuỳ theo giống và thời gian thu hoạch, vỏ thịt dày 1,5 ÷ 6,0 mm, chiếm khoảng
5 ÷ 7% khối lượng củ sắn. Trong vỏ thịt chứa khoảng 2,9 ÷ 3,2% protein, 5 ÷ 8%
tinh bột, 2,7 ÷ 3,2 cellulose và là nơi tập trung nhiều nhất glucoxianogenic trong củ
sắn: 14,04 ÷ 21,60 mg HCN/100g, ngoài ra còn có các sắc tố và enzyme.
+ Thịt sắn nằm trong lớp vỏ thịt và là phần quan trọng nhất của củ sắn,
chiếm khoảng 90% khối lượng toàn củ. Thịt sắn khi mới đào thì có màu trắng, mịn.
Thành phần cấu tạo của thịt sắn chủ yếu là tinh bột, ngoài ra còn có một lượng nhỏ
là protein, lipit, các chất khoáng, vitamin, enzyme, khoảng 0,3% ÷ 0,5% nhựa sắn
và một lượng nhỏ glucoxianogenic. Hàm lượng tinh bột trong lớp thịt sắn phân bố
không đều, lớp thịt càng gần vỏ thịt thì hàm lượng tinh bột càng cao.
+ Lõi sắn nằm dọc giữa củ sắn và chiếm khoảng 0,5% khối lượng toàn củ.
Thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose và một lượng glucoxianogenic:
12,60 ÷ 15,80 mg% HCN.


Bảng 1.1: Một số chỉ tiêu hoá học trong vỏ lụa sắn

lượng
trong

vỏ

Chỉ tiêu
Hàm lượng lignin (%)
Hàm lượng cellulose (%)
Hàm lượng nitơ (%)

Carbon tổng số (%)
Tỷ lệ C/N

Vỏ lụa sắn
23,37
43,13
0,62
46,14
74,42

Hàm
cellulose
lụa

sắn

chiếm chủ yếu (43,13%) sẽ thuận lợi cho quá trình nuôi cấy các chủng vi sinh vật
phân giải cellulose. Tuy nhiên, hàm lượng lignin trong vỏ lụa cũng chiếm một tỷ lệ
tương đối, sẽ gây ảnh hưởng đến quá trình phát triển bình thường của vi sinh vật. Tỷ
lệ C/N tương đối cao cũng là điều kiện bất lợi cho sự phát triển của vi sinh vật.


Bảng 1.2. Số lượng vi sinh vật phân giải cellulose trong mẫu vỏ sắn phân lập.
CFU/g nẫu khô (×106)
STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11

Kí hiệu mẫu
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11

pH mẫu
4,52
5,11
5,86
4,11
5,52
5,63
5,41
4,34
4,08

5,71
4,01

Nấm mốc

Vi khuẩn

Xạ khuẩn

9,45
21,56
14,78
7,90
11,32
34,78
2,43
3,61
18,69
20,05
7,45

128,18
111,34
56,02
167,57
188,72
156,91
101,03
132,79
230,47

343,23
208,55

88,35
35,68
53,43
24,79
96,24
46,69
68,95
11,34
29,67
76,56
5,63


CHƯƠNG 2: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ
2.1. Chọn dây chuyền công nghệ:
Trong công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay có hai phương pháp: phương
pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
So sánh hai phương pháp ta thấy phương pháp nuôi cấy bề mặt có những ưu
điểm sau:
- Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều
so với nuôi cấy chìm.
- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý.
- Trong kĩ thuật nuôi cấy bề mặt có hai loại môi trường nuôi cấy, đó là môi

trường bán rắn và môi trường lỏng. Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triển
trên bề mặt dung dịch lỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí. Khi đó các tế bào
vi sinh vật sẽ tạo thành những ván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng. Enzyme sẽ được
tổng hợp trong tế bào và thoát khỏi tế bào vào trong dung dịch nuôi cấy. Do đó việc
thu nhận enzyme thô trong dịch nuôi cấy cũng rất đơn giản. Tuy nhiên phương pháp
nuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực của enzyme thu nhận được của
phương pháp này không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bán rắn.Một mặt
phương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ sử dụng môi
trường nuôi cấy không cao, phương pháp này ít được dùng.
Vì vậy tôi sẽ chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn với
dây chuyền công nghệ như sau:


Vỏ sắn khô

Ngô

Phân loại, làm sạch

Nghiền, định lượng

Nghiền, định lượng

Nước

Phối trộn
W:60%

Giống
Trichoderma reesei

Trấu
Làm sạch,
định lượng

Định lượng

Nhân giống cấp 1,2

Thanh trùng 1400C,
5060 phút

Khoáng chất

Nhân giống sản xuất

Làm nguội
33 - 340C

Khay

Cấy giống

Thanh
trùng
khay

Phân phối vào khay nuôi
Nuôi cấy 28 – 320C, 3660 giờ
Thu nhận chế phẩm (W: 60%) enzyme

Nghiền (W: 60%)
Bã

Trích ly

Nước

Cô đặc
Sấy phun
1250C
Sản phẩm enzyme kỹ thuật

Bao gói


2.2. Thuyết minh dây chuyền công nghệ:
2.2.1. Nguyên liệu:
2.2.1.1. Nguyên liệu vỏ sắn khô:
- Phân loại, làm sạch:
+ Mục đích: Phân loại theo kích thước để thuận lợi cho quá trình nghiền.
Làm sạch cơ học nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiền và đảm bảo
thành phần dinh dưỡng cho môi trường nuôi cấy.
+ Cách tiến hành: Phân loại và làm sạch bằng thiết bị phân loại mảnh có
kích thước khác nhau.
- Nghiền, định lượng:
+ Mục đích: Tạo kích thước thích hợp đồng thời phá vỡ một phần các cấu
trúc đại phân tử để quá trình lên men được tiến hành thuận lợi hơn.
+ Cách tiến hành: Sắn lát khô sau khi nhập khẩu được nhập vào kho bảo
quản chờ sản xuất. Khi sản xuất, sắn từ kho chuyển đến máy nghiền tán để nghiền
đến mức độ công nghệ yêu cầu.

Trong quá trình nghiền bột vỏ sắn được phân loại theo kích cỡ:
Loại 1: Đạt kích thước yêu cầu của công nghệ thì được gàu tải chuyển lên
bunke định lượng và đựơc vít tải chuyển đến bộ phận phối trộn.
Loại 2: Kích thước quá lớn thì được chuyển lại vào máy nghiền để tiếp tục
nghiền.
2.2.1.2. Nguyên liệu trấu:
- Mục đích: Bổ sung trấu với mục đích tạo độ tơi xốp và tránh nguyên liệu bị
kết dính.
- Cách tiến hành: Trấu từ kho chứa được đưa đi làm sạch, sau đó được gàu tải
chuyển lên bunke định lượng và từ bunke xả xuống thiết bị trộn.
2.2.1.3. Nguyên liệu ngô:
Nghiền, định lượng:
- Mục đích: Ngô được nghiền và bổ sung vào nguyên liệu nhằm tạo đủ điều
kiện dinh dưỡng cho mốc phát triển tốt.
- Cách tiến hành: Ngô từ kho chứa được nghiền đạt kích thước cần thiết sau
đó được định lượng vào thiết bị phối trộn.
2.2.2. Phối trộn:
- Mục đích: Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men sau này.
- Cách tiến hành: Hỗn hợp bột sắn, trấu, nước, muối khoáng và các chất dinh
duỡng cần thiết khác được định lượng và trộn đều theo tỉ lệ đã tính toán.


Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho thanh trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm cho
quá trình nuôi cấy, độ ẩm tối ưu là 58% ÷ 60%.
2.2.3. Thanh trùng:
- Mục đích: Làm cho môi trường được tinh khiết về phương diện vi sinh vật,
làm chín để biến hình tinh bột và protein.
- Cách tiến hành: thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 140 0C. Thời gian giữ
nhiệt là 50 ÷ 60 phút.
2.2.4. Làm nguội:

- Mục đích: Làm nguội gần đền nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích
hợp về mặt nhiệt độ cho vi sinh vật phát triển. Đây cũng là giai đoạn kiểm tra và
loại bỏ những thành phần quá nhão hoặc khô so với yêu cầu.
- Cách tiến hành:
+ Sau khi thanh trùng, môi trường được băng chuyền chuyển qua băng tải
làm nguội đến nhiệt độ khoảng 330C ÷ 340C.
+ Yêu cầu thời gian thực hiện quá trình này phải ngắn để tránh bị nhiễm vi
sinh vật tạp.
2.2.5. Nhân giống sản xuất:
T.reesei được nuôi cấy trong 4 loại môi trường khác nhau nhằm kiểm tra hình
thái và kích thước bào tử cũng như sợi nấm đồng thời khảo sát khả năng sản xuất
cellulase.
Kết quả cho thấy sinh khối khô trong môi trường A đạt đến nồng độ 14.7 g/l
vào cuối giai đoạn và giảm dần sau khi thêm hỗn hợp lactose và acid lactobionic
như là một tác nhân gây ức chế.


Môi trường nuôi giống: [23]
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nhân giống
10 g/l cellulose
1.4 g/l (NH4)2SO4
0.4 g/l CaCl2.2H2O
0.005 g/l FeSO4.7H2O
0.0016 g/l MnSO4.H2O

10 g/l nấm men
2 g/l KH2PO4
0.3 g/l MgSO4.7H2O
0.0037 g/l CoCl2.6H2O
0.0014 g/l ZnSO4.7H2O.

- Mục đích:
+ Kích hoạt giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trường lên
men sẽ sản xuất trên quy mô công nghiệp.
+ Tạo đủ lượng giống để sản xuất trên quy mô công nghiệp.
- Cách tiến hành:
Nhân giống trên máy lắc.
Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường trên mốc giống được nuôi
trong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc.
Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển qua
phòng nhân giống để nhân giống sản xuất. Quá trình nhân giống sản xuất cũng được
thực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nhân giống.
2.2.6. Gieo giống:
- Mục đích: Phân bố giống đều trên môi trường nuôi cấy nhằm tạo điều kiện
thuận lợi cho giống phát triển tốt.
- Cách tiến hành: Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ 33 0C ÷ 340C ta
tiến hành gieo giống, tỷ lệ gieo giống là 10%.
2.2.7. Nuôi cấy:
- Mục đích: Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình, giai
đoạn này cần được giám sát chặt chẽ. Những thay đổi của các thông số sinh lý trong
giai đoạn này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng enzyme thành
phẩm.
- Cách tiến hành:
Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được gàu tải
chuyển lên bunke trung gian. Từ bunke này canh trường qua cân định lượng và
được đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy
và tiến hành nuôi.
Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường. Đây là môi
trường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi
trường. Độ ẩm 96% ÷ 98%.

Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là 42
giờ.
Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt
trải qua các giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1:
Giai đoạn này thường kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.
Trong giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trường còn rời rạc.
+ Enzyme mới bắt đầu hình thành.
Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được
để nhiệt độ cao hơn 300C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
- Giai đoạn 2:
Giai đoạn này kéo dài 14 ÷ 18 giờ tiếp theo. Trong giai đoạn này có những
thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
+ Môi trường được kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm của môi trường giảm dần.
+ Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 400C ÷ 450C .
+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá của nấm sợi.
+ Các loại enzyme được hình thành, trong đó cellulase hình thành nhiều
nhất.
+ Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 290C ÷ 300C.

Giai đoạn 3:
-Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 20 giờ tiếp theo. Ở giai đoạn này có những thay
đổi cơ bản sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó quá trình giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi
trường xuống còn 20% ÷ 25% thể tích không khí trong 1 giờ. Nhiệt độ nuôi cấy
duy trì ở 300C.
Cần dừng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này. Vì
trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme.
2.2.8. Thu nhận chế phẩm:


- Mục đích: Tập trung lượng canh trường có thể thu nhận enzyme để thuận
lợi cho quá trình tiếp theo.
- Cách tiến hành: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận chế phẩm enzyme
thô. Tuỳ theo mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng chế phẩm ngay hoặc tiến hành
một số bước nữa để bảo quản.
2.2.9. Sấy băng tải:
- Mục đích: Sấy để làm giảm độ ẩm của chế phẩm nhờ đó có thể bảo quản và
sử dụng trong thời gian dài.
- Cách tiến hành: Chế phẩm enzyme từ canh trường được chuyển lên bunke
định lượng bằng gàu tải sau đó được băng tải chuyển đến máy sấy. Độ ẩm cần đạt
được sau khi quá trình sấy kết thúc nhỏ hơn 10%. Quá trình sấy được thực hiện bởi
tác nhân sấy là không khí có nhiệt độ là 400C.


2.2.10. Nghiền:
- Mục đích: vừa phá vỡ tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm
enzyme thô.

- Cách thực hiện:
Canh trường nấm mốc sau khi sấy được gàu tải chuyển sang máy nghiền. Kết
thúc quá trình nghiền, canh trường nấm mốc được gàu tải chuyển vào bunke chứa
và chuyển sang kho bảo quản.
2.2.11. Trích ly:
- Mục đích: Chế phẩm sau khi nghiền sẽ được chiết lấy dịch enzyme dùng
cho việc tạo ra chế phẩm enzyme kỹ thuật.
- Cách thực hiện: Sau khi nghiền phá vỡ cấu trúc tế bào, ta có thể chiết xuất
enzyme bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, muối trung tính.
Sau đó dịch enzyme sẽ được đưa vào thiết bị cô đặc.
2.2.12. Cô đặc:
Mục đích của giai đoạn này là nâng cao nồng độ chất khô từ 4 - 6g/l tới 15 20 g/l, cho thêm một số chất bảo quản để đưa dung dịch đạt nồng độ 35 – 40 g/l
.Sau đó dịch cô đặc sẽ được đưa vào thiết bị sấy phun.
2.2.13. Sấy phun:
- Mục đích: của giai đoạn này là tạo sản phẩm enzyme kỹ thuật dạng bột để
tiện cho quá trình bảo quản và vận chuyển.
- Cách thực hiện: Dịch enzyme sau khi cô đặc được đưa vào thiết bị sấy phun
với nhiệt độ đầu vào là 1200C và đầu ra là 600C.