TIEU LUAN SINH THAI RUNG Chuyên đề: “Trình bày và phân tích một số phương pháp nghiên cứu hệ sinh thái”

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ


TIỂU LUẬN CAO HỌC
HỌC PHẦN: SINH THÁI RỪNG
Chuyên đề: “Trình bày và phân tích một số phương pháp nghiên cứu hệ sinh thái”

GVGD:

TS. Ngô Tùng Đức

Học viên thực hiện:

Nguyễn Quốc Cường

Lớp:

Cao học lâm học 22C

Huế, 1/2018.


1. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử làm cơ sở tuyển
chọn và phát triển nguồn gen Bời lời đỏ của cây trội đã lựa chọn ở miền Trung và Tây
Nguyên.
1) Tách chiết ADN tổng số:
- Lá Bời lời đỏ được lau sạch bằng cồn 70%;
- Nghiền 1 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng cối chày sứ;
- Chuyển bột này sang ống eppendoft 2ml, sau đó bổ sung 800µl đệm chiết CTAB (đã
được làm nóng đến 650C);

- Bổ sung thêm 60µl đệm SDS 10%;
- Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút (10 phút đảo một lần);
- Để nguội ở nhiệt độ phòng. Bổ sung thêm 800µl chloroform (tương đương tỷ lệ 1:1),
đảo đều trong 10 phút;
- Ly tâm 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong vòng 15 phút;
- Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendoft sang một ống epp 2ml mới (~ 500µl);
- Bổ sung một thể tích tương đương (500µl) chloroform, đảo đều;
- Ly tâm 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong vòng 15 phút;
- Thu dịch nổi vào ống epp mới, bổ sung thêm 500µl Isopropanol, lắc đều, sau đó để
vào - 20oC trong thời gian 1 - 2 giờ;
- Lấy ống mẫu ra để ở nhiệt độ phòng 10 phút; ly tâm thu tủa ở 10000 vòng/phút ở nhiệt
độ 4 C trong thời gian 20 phút. Đổ dịch trên, thu tủa;
o

- Rửa tủa 2 lần bằng cách bổ sung thêm 700µl ethanol 70% để rửa tủa, ly tâm ở 10000
vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong thời gian 20 phút. Đổ dịch trên, thu tủa;
- Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 100µl đệm TE;
- Bổ sung 1µl RNase (10mg/ml), Ủ mẫu ở 370C trong 3h;
- Bảo quản ADN ở - 20°C;
2) Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của ADN bằng phương pháp điện di trên gel
agarose 0,8% và máy đo quang phổ.
- Phương pháp điện di kiểm tra ADN trên gel Agarose:
Các bước tiến hành:
+ Lấy2µl ADN/mẫu và 3µl loading dye;
+ Tra mẫu vào các giếng trên khay gel agarose 1%;
+ Điện di trong thời gian 30 phút ở 100V;


+ Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide.
- Đo nồng độ ADN và độ tinh sạch (OD 260/280) trên máy đo NanoDrop: Máy quang

phổ NanoDrop cho phép phân tích với độ chính xác cao với một lượng mẫu cực nhỏ, không
cần sử dụng cuvet, không cần pha loãng mẫu.
Nguyên lý cơ bản và cách tiến hành: Dùng pippet nhỏ trực tiếp một lượng nhỏ 1µl mẫu
vào vị trí đo, có một tay cầm nơi có sợi quang học ấn xuống vị trí đặt mẫu sau đó thả nhẹ để
tạo một khoảng cách nhỏ, duới tác dụng của sức căng bề măt, cột chất lỏng của mẫu được
kéo lên, lúc mày có thể thực hiện phép đo với thời gian nhỏ hơn 10 giây. Phổ đồ và các phân
tích có thể hiện trên màn hình máy tính đi kèm. Ngay khi phép đo được hoàn thành, mẫu
được lau sạch. Phần mềm cùng có thể thiết lập account cho tổng người sử dụng. Dữ liệu cũng
có thể được xử lý trên các phần mềm khác.
3) Phương pháp PCR: Tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng là 10µl bao gồm:5,7µl
nước cất khử trùng; 1,0µl đệm 10xPCR có 25mM MgCl2; 0,2µl dNTPs (10mM); 1µl hỗn
hợp mồi xuôi và ngược (10µM/ µl); 0,1µl Taq polymerase (5 U/µl); 2,0µl ADN khuôn
(10ng/µl).
Điều kiện phản ứng PCR
Các
bước

Nhiệt độ
(oC)

Thời
gian

Số chu kỳ

I

95

5 phút

1

II

94

45 giây

50

1 phút

72

1 phút

III

72

8 phút

1

V

4

10 phút

1

35

Giữ mẫu ở 40C
4) Phân tích và xử lí số liệu
Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng Bời lời đỏ, các kết quả thu được từ quá trình
điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất
hiện của các băng ADN nhờ khuếch đại bằng PCR.
Số 1: các alen có xuất hiện băng ADN
Số 0: các alen không xuất hiện băng ADN
Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các alen (mất số liệu)
Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi.
- Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:


PIC = 1- Pi2
Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i
Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số
tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh.
- Tỷ lệ alen dị hợp (H%) của mỗi giống Bời lời đỏ được tính theo công thức:

X
H% = P  Y
Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR
Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN
P là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu
- Tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) được tính bằng công thức:

Z
M% = P
Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN
P là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu
2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ Ô MẪU VÀ ĐIỀU TRA XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU
CẤU TRÚC THẢM THỰC VẬT.
2.1. Bố trí ô mẫu
2.1.1. Ô mẫu dùng để điều tra tầng cây cao
- Diện tích ô mẫu
+ Rừng trồng, non: tối thiểu 400 m2/ô mẫu.
+ Rừng trồng, từ giai đoạn rừng sào trở đi: tối thiểu 500 m2/ô mẫu.
Trường hợp mật độ cây rừng dày, có thể giảm diện tích ô mẫu, nhưng diện tích ô mẫu
không nhỏ hơn 100 m2/ô và không ít hơn 31 cây gỗ/ô.
+ Rừng tự nhiên: tối thiểu 1000 m2/ô.
Trường hợp lô rừng được thiết kế theo băng thì chiều rộng ô mẫu bằng chiều rộng của
băng (W, m), chiều dài ô bằng diện tích ô chia cho chiều rộng (m).
- Tỷ lệ rút mẫu
Tổng diện tích ô mẫu chiếm 2% diện tích lô đối với rừng trồng và chiếm 1% diện tích lô
đối với rừng tự nhiên. Trường hợp lô rừng có diện tích nhỏ (gồm những lô cần 1 ô mẫu),
nhưng hiện trạng rừng biến động lớn (phân bố không liên tục, gồm từ 2 mảnh rừng trở lên,


mỗi mảnh rừng có hiện trạng khác nhau rõ rệt) thì giải quyết thông qua 1 trong 2 cách như
sau:
Cách 1: Bổ sung thêm số ô mẫu để có ít nhất 1 ô mẫu đại diện tốt cho một mảnh rừng.
Cách 2:
+ Mỗi mảnh rừng chọn 1 ô mẫu điển hình. Diện tích mỗi ô mẫu này bằng S o/k (trong đó,
So là diện tích nguyên bản của ô mẫu; k là số mảnh rừng trên lô). Không được giảm diện tích
ô mẫu còn nhỏ hơn 100 m2. Trường hợp cần thiết phải bổ sung thêm số ô mẫu đo đếm.
+ Các chỉ tiêu đo đếm được xác định bằng phương pháp bình quân gia quyền theo diện

tích.
+ Trong trường hợp số ô tính toán lẻ, thì phải làm tròn theo nguyên tắc toán học. Nếu
diện tích lô rừng bé, số lượng ô xác định theo tỷ lệ phần trăm diện tích tính toán nhỏ hơn 0,5
thì vẫn phải bố trí 1 ô mẫu trên lô rừng đó.
- Phương pháp rút mẫu: ô mẫu được rút theo phương pháp chọn mẫu điển hình.
2.1.2. Ô mẫu dùng để điều tra đất không có rừng; cây bụi, thảm tươi và vật rơi rụng
dưới tán tầng cây gỗ
- Đất trảng cỏ, trảng cây bụi, đất canh tác cây nông nghiệp, nương rẫy: diện tích tối thiểu
100 m2/ô.
- Ô mẫu điều tra độ che phủ của cây bụi, thảm tươi dưới tán cây gỗ: dựa vào ô mẫu sơ
cấp dùng để điều tra tầng cây gỗ đã được thiết lập (tiểu mục 1.1), tiến hành chia ô mẫu sơ cấp
thành hai phần bằng nhau nhờ việc thiết lập một đường vuông góc với cạnh chiều dài của ô
mẫu. Thiết lập 2 đường chéo trên mỗi ô mẫu thứ cấp này (tổng số có 4 đường chéo).
- Ô mẫu điều tra độ che phủ của vật rơi rụng: sử dụng ô dạng bản có diện tích 1 m 2/ô.
Bố trí 4 ô ở bốn góc của ô mẫu sơ cấp và 2 ô ở giao điểm hai đường chéo của hai ô thứ cấp.
Tổng số ô dạng bản cần điều tra là 6 ô.
2.2. Điều tra xác định các chỉ tiêu của thảm thực vật
2.2.1. Chỉ số diện tích tán (Cai, %)
Chỉ số diện tích tán được xác định cho tầng cây cao, đo đường kính tán lá (D T) của từng
cây trên ô tiêu chuẩn (điều tra toàn diện), sau đó lấy tổng diện tích tán của tất cả các cây trên
ô chia cho diện tích của ô tiêu chuẩn và quy đổi ra tỷ lệ phần trăm sẽ thu được chỉ số diện tích
tán.
Cai (%) = Σ(DTtán)/DTđất rừng

(1)

Diện tích tán cây được tính theo công thức tính diện tích hình tròn.
2.2.2. Độ che phủ của cây bụi, thảm tươi (CP, %)
Độ che phủ của cây bụi, thảm tươi được xác định thông qua điều tra 4 tuyến đã thiết lập

(tiểu mục 1.2). Đo tổng chiều dài của 4 tuyến và tổng chiều dài có cây bụi, thảm tươi chiếm
cứ. Lập tỷ số giữa tổng chiều dài chiếm cứ của cây bụi thảm tươi và tổng chiều dài của 4
tuyến và quy đổi ra tỷ lệ phần trăm sẽ thu được trị số độ che phủ của cây bụi thảm tươi. Bằng
cách này, tỷ lệ phần trăm về diện tích đã được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm về độ dài.
CP (%) = Lgặp cây bụi, thảm tươi/Lcủa tuyến điều tra

(2)

2.2.3. Độ che phủ của vật rơi rụng (VRR, %)
Độ che phủ của vật rơi rụng được điều tra trên 6 ô dạng bản đã được thiết lập (ở tiểu
mục 1.2) tương tự như phương pháp điều tra và tính toán độ che phủ của cây bụi thảm tươi.
VRR (%) = Lgặp VRR/Lcủa các đường chéo của ô dạng bản

(3)

3. PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TÁI SINH RỪNG TỰ NHIÊN
Phương pháp thu thập số liệu
Số liệu được thu thập từ hệ thống 9 ô tiêu chuẩn điển hình, đại diện cho các trạng thái
rừng tại khu vực nghiên cứu. Ô tiêu chuẩn (ÔTC) được thiết lập có hình chữ nhật (25x40m)
diện tích là 1000m2/ô. Số liệu điều tra tái sinh được thu thập trong các ô dạng bản (ÔDB). Đã
sử dụng 6 phương pháp điều tra tái sinh khác nhau, gồm:
+ Phương pháp I (PP I): Chia ÔTC thành 40 phần bằng nhau, mỗi phần gọi là 1 ÔDB có
diện tích là 5x5m = 25m2. Tiến hành điều tra toàn bộ cây tái sinh trong 40 ô dạng bản này. Kết
quả điều tra được sử dụng làm đối chứng để đánh giá các phương pháp điều tra khác nhau.
+ Phương pháp II (PP II): Bố trí 28 ÔDB, diện tích mỗi ô là 4m 2 (2x2m), các ÔDB được
bố trí trên giao điểm của các tuyến song song cách đều nhau 5m.
+ Phương pháp III (PP III): Bố trí 12 ÔDB, mỗi ô có diện tích 9m 2 (3x3m), các ÔDB
cũng được bố trí tại giao điểm của các tuyến song song với các cạnh ÔTC.
+ Phương pháp IV (PP IV): Bố trí 6 ÔDB, mỗi ô có diện tích 16m 2 (4x4m), các ÔDB

cũng được bố trí tại giao điểm của các tuyến song song với các cạnh ÔTC.
+ Phương pháp V (PP V): Bố trí 5 ÔDB, mỗi ô có diện tích 25m 2 (5x5m), các ÔDB
được bố trí 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở tâm ÔTC.
+ Phương pháp VI (PP VI): Bố trí 2 dải song song dọc theo chiều dài ÔTC, mỗi dải có
bề rộng là 1,2m (diện tích mỗi dải là 40x1,2 = 48m2), dải được bố trí cách cạnh dài ÔTC 5m.
Số ÔDB, diện tích và tỷ lệ diện tích điều tra tương ứng với các phương pháp được thống
kê ở bảng 1
Bảng 1. Thông tin về các phương pháp điều tra tái sinh

T
T

Phương
pháp

Số
ÔDB

Diện
tích ÔDB
(m2)

Tổng diện
Tỷ lệ
tích điều tra
% điều
2
(m )
tra

1

I (toàn

40

25

1000

100

2

II

28

4

112

11,2

3

III

12

9

108

10,8

4

IV

6

16

96

9,6

5

V

5

25

125

12,5

6

VI

2 dải

48

96

9,6

diện)

Phương pháp xử lý số liệu
+ Mật độ cây tái sinh được tính theo công thức:

Trong đó: Ni/ha: là mật độ của loài i/ha
S0: là tổng diện tích các ÔDB (m2)
Ni: là số lượng cá thể loài thứ i
Dựa vào mật độ của từng loài để tính mật độ cây tái sinh cho cả ha (N/ha = Ni/ha)
+ Chất lượng cây tái sinh được đánh giá theo 3 cấp (Tốt, trung bình, xấu).
+ Nguồn gốc cây tái sinh được tính theo công thức:

Trong đó: N% là tỉ lệ % số cây nguồn gốc hạt hoặc chồi.
Ni là tổng số cây có nguồn gốc hạt hoặc chồi.
N là tổng số cây tái sinh.
+ Tổ thành cây tái sinh được xác định theo tỷ lệ giữa số lượng của một loài có mặt trong
các ÔDB so với tổng số cây của loài trong các ÔDB. Tổ thành của từng loài cây tái sinh được

tính theo công thức:

Trong đó:

Ki là hệ số tổ thành của loài i

Xi là số lượng cá thể của loài i N là tổng số lượng của các loài.
+ Phân bố số cây tái sinh theo cấp chiều cao: Chiều cao cây tái sinh được phân thành 6
cấp như sau: dưới 0,5m; 0,5-0,99m; 1-1,49m; 1,5-1,99m; 2-2,99m; ≥3m. Cây tái sinh triển
vọng là những cây có H 1,5m.
+ Phân bố số cây tái sinh trên mặt đất: Nghiên cứu hình thái phân bố của cây tái sinh
trên bề mặt đất rừng dựa vào phân bố số ô theo số cây trên ô. Dựa vào tỷ số giữa phương sai
và trung bình số cây quan sát trên các ô được chọn hệ thống trên bề mặt diện tích rừng (gọi tắt


là phương pháp tỷ số).
Nếu phân bố cây trên các ô tuân theo luật Poisson thì tỷ số trên bằng 1 (vì theo lý thuyết
phânbố Poisson có kỳ vọng bằng phương sai) và người ta cũng chứng minh được rằng:
T = (W-1)/Sw
hoặc
Nếu giá trị tuyệt đối của t < tn / 2 , cây phân bố ngẫu nhiên. Nếu trị số dương của t > tn /
2 , cây phân bố cụm.
Nếu trị số âm của t < tn / 2 , cây phân bố cách đều.
+ Lựa chọn phương pháp điều tra tái sinh phù hợp: Phương pháp điều tra tái sinh phù
hợp được lựa chọn trên cơ sở so sánh sai số giữa các chỉ tiêu biểu thị tái sinh của từng phương
pháp với phương pháp điều tra toàn diện. Phương pháp được chọn là phương pháp có sai số
nhỏ, đồng thời đáp ứng được mục tiêu đề ra và dễ thao tác đo đếm ngoài thực địa.