Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

LÊ THỊ SINH
Tên đề tài:
PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI
Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2012 – 2016

THÁI NGUYÊN - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

LÊ THỊ SINH
Tên đề tài:
PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI
Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Lớp

: K44 - CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2012 – 2016

Giảng viên

: ThS. Bùi Đình Lãm

Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2016

i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Khoa CNSH - CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên. Em đƣợc thực tập tại phòng thí nghiệm của Khoa CNSH – CNTP, trƣờng
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát hiện nhanh bệnh greening trên
cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ để hoàn thành khóa luận này ngoài
sự nỗ lực của bản thân em còn nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ của Ban giám hiệu
trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng
các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học.
Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Ban giám hiệu
trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng
các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học vừa qua để em có thể
hoàn thành khóa luận.
Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.
Bùi Đình Lãm ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS. Lã Văn Hiền đã dành
rất nhiều thời gian quý báu trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện nghiên cứu đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã quan
tâm, ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu giúp em
hoàn thành tốt khóa luận này.
Do điều kiện và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót.
Kính mong thầy cô giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài
của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2016
Sinh Viên

Lê Thị Sinh


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1:

Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất ........................6

Bảng 2.2:

Tình hình sản xuất cây có múi ở các châu lục trên thế giới giai đoạn
2011 - 2013 .........................................................................................14

Bảng 2.3:

Diện tích, năng suất và sản lƣợng cây có múi trên thế giới giai đoạn
2005 – 20013 .......................................................................................16

Bảng 2.4:

Tình hình sản xuất cây có múi của nƣớc ta giai đoạn 2005 – 2013. ...16

Bảng 2.5:

Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nƣớc ta năm 2009 .......17

Bảng 3.1:

Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh greening (Hung và
cs, 1999b), (Hung và cs, 2004) [34], [35] ...........................................28

Bảng 3.2:

Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm. ...........................29

Bảng 3.3:

Bảng thu thập mẫu tại các địa phƣơng ................................................30

Bảng 3.4:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .....................................................32

Bảng 4.1:

Kết quả thu thập mẫu vật liệu .............................................................36

Bảng 4.2:

Kết quả đánh giá mẫu cam sành tỉnh Hà Giang ..................................38

Bảng 4.3:

Kết quả đánh giá mẫu cam vinh Thái Nguyên ....................................39

Bảng 4.4:

Kết quả giám định bệnh vàng lá greening..........................................42


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1.

Rầy chổng cánh Diaphorina citri ........................................................19

Hình 2.2.

Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi .................21

Hình 4.1.

Mẫu lá cây có múi thu thập để giám định bệnh vàng lá greening ......37

Hình 4.2.

Kết quả tách chiết DNA tổng số .........................................................40

Hình 4.3.

Điện di sản phẩm PCR mẫu lá giám định bệnh greening. ..................41

Hình 4.4.

Kết quả tinh sạch mẫu lá cam .............................................................44

Hình 4.5.

Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu
DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Quyết Thắng – tp Thái Nguyên,tỉnh
Thái Nguyên) ......................................................................................45

Hình 4.6.

Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu
DNA tách từ lá cam sành (Quang Bình – Hà Giang)..........................45

Hình 4.7.

Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA
tách từ lá cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, tp Thái Nguyên,
tỉnh Thái Nguyên) ..................................................................................45

Hình 4.8.

Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với
mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Quyết Thắng
– tp Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) ...............................................46

Hình 4.9.

Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi
GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) 47

Hình 4.10.

Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi
GR - F từ mẫu DNA tách từ lá cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú
Lƣơng, tp Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) .......................................47


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BVTV

: Bảo vệ Thực vật

Cs

: Cộng sự

CTAB

: Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

ĐC

: Đối chứng

dNTP

: Deoxyribo-nucleotide triphosphate

EDTA

: Ethylene diamine tetraacetate

FAO

: Food and Agriculture Organization

NN&PTNT

: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic Acid


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU........................................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2
1.3. Yêu cầu nghiên cứu ..............................................................................................2
1.4. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................2
1.5. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3
1.5.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3
1.5.2. Ý nghĩa trong thực tiễn .....................................................................................3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
2.1. Tổng quan về cây có múi .....................................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại.....................................................................................4
2.1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................4
2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây có múi ....................................................................7
2.1.3. Giá trị của cây có múi .......................................................................................9
2.1.4. Yêu cầu sinh thái của cây có múi ....................................................................10
2.1.5. Một số sâu bệnh hại trên cây có múi ...............................................................12
2.1.6. Tình hình sản xuất cây có múi ........................................................................14
2.2. Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi .............................................................18
2.2.1. Lịch sử của bệnh .............................................................................................18
2.2.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh ............................................................18
2.2.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening.............................................21
2.2.4. Một số biện pháp phòng tránh .........................................................................23
2.3. Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi ...................23
2.3.1. Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới ..............................................23
2.3.2. Các nghiên cứu về phát hiện bệnh ở Việt Nam ..............................................26
Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................28
3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................28
3.1.1. Vật liệu thực vật ..............................................................................................28
3.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm......................................................................28

vi

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................29
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................29
3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................29
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................30
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................30
3.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu vật liệu .................................................................30
3.4.2. Phƣơng pháp xác định sự biểu hiện của bệnh greening thông qua sự biểu hiện
bên ngoài. ..................................................................................................................31
3.4.3. Phƣơng pháp phát hiện bệnh greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR...31
3.4.4. Giải trình tự gene của sản phẩm PCR .............................................................33
3.4.5. Phƣơng pháp sử lý số liệu ...............................................................................35
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................36
4.1. Kết quả thu thập mẫu vật liệu ............................................................................36
4.2. Kết quả xác định mức độ biểu hiện của bệnh. ...................................................37
4.2.1. Kết quả xác định sự biểu hiện của bệnh thông qua các triệu chứng bên
ngoài ............................................................................................................ 37
4.3. Kết quả giám định bệnh vàng lá greening bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu ............................................................................................................................40
4.3.1. Tách chiết DNA tổng số mẫu lá ......................................................................40
4.3.2. Kết quả nhân đoạn gen 16s rDNA ..................................................................40
4.4. Kết quả giải trình tự gen của sản phẩm PCR từ mẫu lá bị bệnh greening .........44
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................48
5.1. Kết luận ..............................................................................................................48
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................50
I. Tiếng Việt ..............................................................................................................50
II. Tiếng Anh .............................................................................................................52
III. Tài liệu Internet ...................................................................................................55

PHỤ LỤC


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây ăn quả có múi (cam, quýt, chanh, bƣởi, v.v.) là nhóm cây ăn quả quan
trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nƣớc ta. Năm 2011, diện tích cây ăn quả có múi
ở Việt Nam đạt 124.057 ha, trong đó diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70.300 ha,
bƣởi 45.000 ha và chanh là 18.000 ha (FAO, 2015) [52]. Cây có múi là loại cây
trồng mang lại giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế cao. Trong 100g thịt quả tƣơi có
chứa 6-12% đƣờng, vitamin C từ 40-90 mg, Các acid hữu cơ từ 0,4-1,2%, các chất
khoáng và dầu thơm. Sản phẩm của cây có múi đƣợc sử dụng với nhiều mục đích
khác nhau nhƣ làm thực phẩm ăn hàng ngày, làm mứt, nƣớc giải khát. Tinh dầu
đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng nhiều trong Công nghệ Thực phẩm và Mỹ
phẩm. Vỏ quả có thể dùng làm thuốc, hƣơng liệu (Đỗ Đình Đức, 1991) [7].
Bệnh greening là nguyên nhân ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất và chất
lƣợng của cây (Lê Mai Nhất, 2014) [11]. Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh và gây
hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt trên thế giới. Sản lƣợng quả bị
giảm từ 30% đến 100% (Bassanezi R.B. và cs, 2005) [25]. Ở Việt Nam, bệnh
greening đƣợc ghi nhận gây hại trên cây ăn quả có múi từ những năm 1960. Bệnh
greening gây hại lớn nhất vào các năm 1970 và 1990 ở các nông trƣờng trồng
cam. Mức độ thiệt hại trên bƣởi từ 17% – 25% và trên cam quýt từ 54% – 70%
(Vien N.V và cs,2009) [50]. Bệnh vàng lá greening là bệnh hại quan trọng nhất,
khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt nhất và tàn phá nặng nề
nhất đối với nghề trồng cây ăn quả có múi trên thế giới (Su và cs., 2012) [44] Đặc
trƣng của bệnh Greening là có thời gian ủ bệnh dài, nên rất khó phát hiện bệnh ở
giai đoạn đầu và thƣờng hay nhầm lẫn với bệnh khác nhƣ khi cây bị thiếu kẽm (Zn)

(Lê Mai Nhất, 2014) [11] . Đến khi bệnh biểu hiện rõ ràng thì bệnh đã tàn phá rất
nặng và các biện pháp chữa trị gần nhƣ là vô nghĩa trong lúc này, rất nhiều biện
pháp đã đƣợc thực hiện nhƣng vẫn không mang lại hiệu quả. Hơn nữa, vi


2

khuẩn gây bệnh vàng lá đến nay đã xuất hiện các chủng mới, có độc tính nặng hơn
(Hung và cs, 199a) [33].Chính vì vậy, việc phát hiện nhanh bệnh greening trong
giai đoạn đầu là vô cùng quan trọng đối với việc phòng và điều trị bệnh.
Ngày nay việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đoán
các bệnh trên cây có múi mang lại hiệu quả cao với nhiều ƣu điểm nhƣ: độ nhạy
cao, chính xác và mất ít thời gian. Có thể kể đến một số kỹ thuật: PCR, real-time
PCR, các kỹ thuật lai phân tử, southern blot... Kết quả thu đƣợc từ những nghiên
cứu chẩn đoán bằng sinh học phân tử là cơ sở để sớm đƣa ra những giải pháp phòng
tránh. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để
phát hiện bệnh greening trên cây có múi. Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá
greening bằng phƣơng pháp sinh học phân tử. Phân lập vi khuẩn Candidatus
Liberibacter asiaticus gây bệnh greening từ rầy chổng cánh bằng kỹ thuật PCR
(Hung và cs, 199a) [33].
Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: „„Phát
hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Thu thập nguồn vật liệu trên một số đối tƣợng cây có múi nhƣ: Cam, chanh,
bƣởi, quýt... tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Xác định sự biểu hiện của bệnh greening trên mẫu vật liệu đã thu thập
đƣợc.
- Giám định bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng phản ứng PCR với

cặp mồi đặc hiệu.
- Giải trình tự gene của sản phẩm PCR từ mẫu lá bị bệnh greening (từ 2-3 mẫu)
1.4. Mục tiêu nghiên cứu
- Thu thập đƣợc các mẫu vật liệu trên một số đối tƣợng cây có múi nhƣ:
Cam, chanh, quýt, bƣởi,... ở các địa phƣơng khác nhau.


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full