Chuyển gen Bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)

VI

VI T NAM
VI

T
----

----

NGUY N TH THU

CHUY N GEN BT2
D

TS

NG B NG S

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LU

C

-2015


VI

VI T NAM

VI

T
----

----

NGUY N TH THU

CHUY N GEN BT2
D NG M

TS

NG B NG S

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

C TH C NGHI M

LU

C

NG D N KHOA H C
PGS. TS. Nguy

g 11-2015

L

uc
k t qu

li u,
.

Nguy n Th Thu


L IC

c t i PGS. TS. Nguy
t

ng d n, ch b

om

u ki

c bi
nt
om

p th

cv

u ki n v v t ch

m t tinh th
n k thu

t

c hi
o Vi n S
t

Vi

Vi

u ki n thu n l
Cu
ng nghi p trong su t th

o.
c


DANH M C T , C M T

VI T T T

DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Ribonucleic acid

bp

: C p base (base pair)

CTAB

: Cetyltrimethyl amoniumbromide

dNTP

: Deoxynucleosid triphosphat

EDTA

: Ethylene diamin tetra acetate

EtBr

: Ethidium bromide

kb

: Kilo base

PCR

: Ph n ng chu i polymerase
(Polymerase chain reaction)

Rnase

: Ribonuclease

TBE

: Tris base, Boric acid, EDTA.

TE

: Tris EDTA

MES

: 2-morphlinoethanesulfonic acid

PPT

: L- Phosphinothricin

AGPase

: ADP-Glucose pyrophosphorylase

MS

: Murashige and Skoog Medium

BSA

: bovine serum albumin fraxtion

BCIP/NBT : 5

Bromo

4

Chloro

toluidine salt/Nitro Blue Tetrazolium
SDS

: sodium dodecyl sulfat

3

idolyl phosphate, p-


DANH M C B NG

B ng 1: K t qu ch n l

ng ch n l c..... 24

B ng 2: S

b n sao gen chuy
ct m i
........................................................................................................... 29

B ng 3: S

ng th
m
.......................................................................................................... 30


DANH M

M t s enzyme quan tr ng trong q
tinh b t. ............................................................................................................... 7
n gen pCambia2300-Ubi-Bt2; ..................................... 15
nc

-Ubi-

m ts

23

t qu
chuy n gen

t ng s

nl
25

K t qu ki m tra s
t c a gen Bt2 trong m t s
n
gen b ng PCR v i m
c hi u.. ..................................................................... 26
K t qu ki m tra s
t c a gen Ubi trong m t s
n
gen b ng PCR v i m
c hi u. ...................................................................... 27
7: K t qu ki m tra Southern m t s

n gen;................... 28


M

U ............................................................................................................ 1

1.

tv

.................................................................................................. 1

2. M

........................................................................ 2

3. N

u ................................................................................. 2
I LI U ............................................................. 3
............................................................................... 3

1.2 Tinh b

u khi

ng h p tinh b t...................... 5
ng s d ng ........................................ 7

p nh vi khu n Agrobacterium tumerfaciens.............8

1.3.1 Chuy

1.3.2 Chuy n gen tr c ti p ................................................................................10
u chuy n gen

1.4.2

................................................. 11

u chuy

gi i .................................................11

u chuy

c ...................................................14

T LI
2.1 V t li

U................... 15
u .............................................................. 15

2.1.1 V t li u .....................................................................................................15
t....................................................................................................16
n gen b ng PCR..................................................19
n gen b ng lai Southern......................................20
T QU
3.1 Ch n l

O LU N ................................................. 23
n gen......................................................... 23
n gen b ng PCR ................................................. 25

3.3

n gen b ng lai Southern ..................................... 28
T LU

N NGH ................................................. 32

4.1 K t lu n.................................................................................................... 32

4.2 Ki n ngh ................................................................................................. 32


1.
ng th
quan tr

iv

gi i sau

is

i.

cung c

i,

c cho

nhi

c ta. Hi

c a

cv

h t. Vi

c bi
iv

gi

ng. Hi

tr

i ti

c

nt o

y
c

d ng gi ng m i d

n gi

l c

n gi

t o gi ng m

u

ng di truy n ngu n gen, di

truy

n l c nh ch th

ngh

ng thu h

thu

ut

y u ph

p, s

ng h t, kh

ng c a h t

ng d
c
ng h p tinh b t, ho

ng c

u khi

ng h p

sinh kh i
Nhi
ng h p tinh b

u khi n t ng h p tinh b t

u cho th y ADP-

h

u
i gen Brittle 2 (Bt2

m 2 ti u ph n nh

i gen Shrunken 2 (Sh2). Chuy n gen Sh2

ph n l
t trong nh
b

u nh

ti u
Bt2

ng h p tinh

ng.
ng d
om ts

tumefaciens.

u: Chuy n gen Bt2
ng b ng s d

Agrobacterium


2.
Chuy n vector mang gen Bt2

m nh

ng tinh b
3.
-

Chuy n gen Bt2

ng.
t c a gen Bt2

n gen.

1.1
Zea mays L.) thu c chi Maydeae, h
ngu n g c t Trung M

c quan tr

gi

nh

o.
C ut oc

m: r

R

r

), h t.

u cho b r c

m r ng c a r ph thu
ir

mc a

m m, r

R m

ng.

m ng, r t m th i, r h t) g

m

m m th sinh.
R m

t hi n sau khi h

n ym

tr m

hi n, r m

t. Sau m t th i gian ng n xu t
ra nhi

m

sinh ng

n m t sau m t th i gian ng
nt

cung c

ng g p

R m m th sinh

tt

nh ng gi ng ch u h n).

cg

ph ho c r m m ph . R

hi n t sau s xu t hi n c a r

ng kho ng t

m ts

t hi n l ai r

v ir m

r t m th i cung c

ng cho h r
R

ph c

im

2,5m, th

m

tc

t dinh
u, s

t.

m
t

n 7. Tuy

m m th

ng th i gian 2 - 3 tu

r

t

8

nt
tb

t th p c
c3-

ng

16 r . R

tt i
ar

tv

l


n. R

m v cung c

ng su t th i k

nc
R
m

neo hay r ch ng) m

t. R

ng to, nh

ph

ng
,r
u

ki

. Chi u cao c

ng 1,5

4 m.

n g c t ch i m m.
c ut ob ib
S

. Tuy
r
nh

quan h ch t ch v i s

ng. Nh ng gi

n

c
(

ng c

b p) n m

nh ng v

.

cn m

m m t tr

cm

u

g

i di
Hoa t

ch

kho ng gi

it

H
n

p.

i qu

n

1 - 3 ch i

m 5 ph

t. V h

h t, l
n bao xung quanh h t. L

i v h t, bao l y n
tr ch

a h t ch a
ng. N

s ng. T l gi a n

n: n
ng

m 1/3 th

m, r m

ron

ah tv
i m m.

m, tr


1.2
Tinh b

p ch t cacbon sinh h

tr

c a th c v t [22]. Tinh b

p..

n tr ng trong kh u ph n

is

ng tinh

b

t

s n ph m c

c t ng h p t

uv s

is

ng c

ng h p tinh b
bi n Sh2

c ph

n

.

vi c thi u tinh b t trong
ho

t
t bi n gen Sh2 t i

ng c

h tt o

c ch ng minh

ng c a ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) b m t

ch ng minh
i

, trong khi s

pc

1990 [7]

h p tinh b t, nhi

t bi n

trong h t

c

c
ct

t bi n
t bi n

.

quan

i ch
n t ng

t nhi u gen

t r t chi ti t. H u h

c ch y u trong t ng h p tinh b

c

n
nh b

t

bi n. D c theo chu i ph n ng t ng h p tinh b

ut

u, Miniature1 (Mn1)
IncW2

Shrunken1 (Sh1)

cho enzyme t ng h p sucrose, Sh2

Sus1

Brittle2 (Bt2

Bt1

v n chuy n ADP-Glucose, Waxy1 (WX1)
enzyme t

t h t GBSSI (granule-bound starch synthase), trong t ng

h p tinh b t, Sugary2 (Su2)

Dull1 (Du1)

, amylose extender1 (Ae1

Su1
h ISAI [12; 18].
ng trong t ng h p tinh b

ADP-Glucose t Glucose-1-

AGPase [29; 36]. S

t ng h p c a
ng ho t


n gen Sh2

ng c a AGPase trong h

Bt2

c

ch

gen

[10]

p c a hai gen b sung t

[15]. Agp1 (ti

Agp2 (ti

l

n cDNA p

nh ) cho th y bi u hi n ch
c l i, Sh2

y
Bt2

c bi u hi

c hi u trong n

nh th ba gen L2
gen Agp2

[16]. Cu

t ti

nh trong m

L2

n cDNA t

Agpsemzm
a Agpslzm

c

[28]

Agpslzm

ng, khi
Agps

nh [17]. M

t ngu n g
Agpslzm ch

mv s

Agpsemzm

c a tinh b

t m th i

Bt2 ch

m trong

tinh b
AGPase

ng c a

n

nt

[36]
t bi

ng tinh b

ch

Sh2

t bi

t [9]. Tsai

t qu cho th

c t ng h p ch b ng 20-30% so v

t bi

n s

i

thi

a enzyme

adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong c n
t. S

nh

t bi n ch ra r ng ph n l n tinh b t trong
c t ng h p nh

a m t h th

enzyme s d

c
u c a Hannah [19] cho th y s

ng bi u hi n c a gen Sh2

t i 64% nh
ng h

nc
t b p.
c t ch

h

u ki n

ng 330

nhi

s

n gen

tm

i, t l
y vi
c bi

tp
ns

n
n

u ki n nhi t


t [12]
n th y: M
ng h p tinh b
mc
ng h

c

cho th

m hai ti

Brittle2 (Bt2),

hai ti

D

l n

nh

i gen Shrunken2 (Sh2) [20].

ti

ng kh
n copy c a gen Sh2

h p tinh b t nh chuy

b i gen

ng

Bt2

1.3
K thu t chuy
t

t ch

g n b gen t
trong t

thu
t nt i
,t nt

ho

ng t ng h

t gen l (m
d ng plasmid trong t
i b gen c a t
c hi

n ADN, ARN)
ho c
. Gen l
c


t hi n nh

m m i c a nh

chuy n

gen.
c chuy n n p gen m

cg

p nh vi khu n Agrobacterium

n n p gen: chuy
tumefaciens [33]

hai

n gen tr c ti p:

[16]

x

n [23]

n gen (biolistic) [32],

n qua ng h t ph n [25]

t s k thu

1.3.1

.

Agrobacterium tumerfaciens [33]
A. tumefacien (Agrobacterium tumefaciens)
-3.0 x 0.7-

p c a vi khu

c v t.

A. tumefaciens

nh c
n T-

nc at

n s r i lo

c v t, d n

ng n i sinh, t o ra kh i u. Kh
chuy n gen ngo

cv

nc at

n.

g n T-

n A. tumefaciens

cv

ph i ti

cv tb t
chvA

hi n nh

c th c

chvB. Gen chvB

n
chvA

-1,2 glucan m
protein v n chuy
chuy

n

nh v

n chuy n -1,2 glucan

sinh ch t. -1,2 glucan gi vai
c v t. N
d n truy n T-DNA.

at

nh m t
n. Protein v n

ng gi
vi khu n Agrobacterium ti p
ti

s


vir

n ph m protein c
DNA t vi khu

ng cho vi c d n truy n T-

cv

t c n thi

t T-DNA kh i Ti-plasmid, c m

cv

c, tham gia di chuy n ph n Tch t c a t
c

nt it

c v t, v n chuy n t

i cu

.
Th c ch t ch

-DNA c a Ti-

th c v

c chuy
vir

n truy n ch do s n ph m c

gen chv quy

-DNA. Tuy

i DNA 25 bp (Right border (RB)

bi

Left border (LB) c a T-DNA)

m

n ph m c a t h

gen virE

n truy

ho

vir
cv

u nh n bi

h t gen virA trong t h

n truy
vir

cv t

n ph m c

virG.

i ti p t

S n ph m c a gen virG
hai gen cu

vir
virB

c ho
virD

bi

c

ng c a

p ch t phe
t

c

virE.

c ho

a T-

n ph m c

m ng nh n

t ph n T-DNA ra kh i DNA c a Ting th

i

u t th m th u

th

-

o th c v

m

virE t ng h

cg

chuy n v

i T-

vi khu

c v t. C u n

c m ng s n ph m gen virB
cv

tt

ti p h p gi a hai t
-

c chuy

p nh t trong gen t

cv

m: chuy n gen s d ng vi khu n Agrobacterium
pv

u ki n nhi

ch

m

Vi t Nam.

nh

n


1.3.2
Chuy n gen b

n gen [32]
n nh

c c c nh

n) b
ng 0,5 - 1,5 m v i dung d

ADN ngo i lai c n chuy

cv

im
g

um

n

c 0,5 -

c

n l n (macroprojectile) b ng nh a, ho c v t li u nh .

Khi b

it

cao. T

nl ns b c nl ib im

n nh

ti p t c di chuy n v i t

l nt

n) v n

ng b n r i r i

b
b n gen.

m: chuy n gen b
b nm tl

n gen t

c nhi u t

b

ng (h t ph n, t

y, t
m:
n p

n gen b ng

nh th

b

n s bi n

m th i.3

Chuy n gen b ng k thu

[16]

d

nh ng t

i

nh, nh m t

bi n n p kh m t

nn pt

n t h t ph n.

m:

n gen b

t
uy t

ng

nh

lo i t
c

t ph

c
3

n ch v s
nn
m:
t

i gi
il n

ch v i m t t

,


Chuy n gen nh k thu t

n [23]

K thu

chuy

n protoplast. Sau khi

t o protoplast, ti

n protoplast v

h p mang gen mong

mu

t o h n h p d ng huy

n

ng p trong h n h p huy

ng 3 mm. C

nv i

t n s 20 KHz theo t ng nh p ng n, m i nh p kho

nh p

kho ng t 6 - 9 nh p v i t ng th

ng t 600 p,

ch n l

c chuy n gen. Nu
nl

ng

mc

ng

protoplast nhi

ch

iv it
tb

ic

ih i

k thu t cao.
Chuy n gen qua ng ph n [25]
n gen qua ng ph
cc
chuy

u ng ph

i lai
u nh

i gian chuy n

t ph n m
t t nh

tinh,

chuy n gen x

tinh

pt
i k thu t cao, ph thu c nhi
kinh nghi m c

i ti

1.4

Hi
d

cs
chuy

khu n A. tumefaciens
gi

cv

n gen nh vi

i hi u qu

t.
u chuy

iv
A.


tumefaciens

ot
[31]

ot

[5];

[13; 14; 21; 38; 37]

ng s
pBECK2000.4 s

[34]

o

[27]

n vector

d ng vi khu n A. tumefaciens
t s

CML78, CML216, CML331, TL18, TL27,

.

n gen b ng
t c a gen gus, gen bar

m tra s
u

n gen v i hi u su t chuy n
c ng s

[35]

n vector

n A. tumefaciens
n 2 mm

y v i vi

khu n A. tumefaciens LBA4404 trong 72 gi
di

d ng MES,

nl cm

m, t

t qu

gen gus

n

bar trong h gen c

T n s xu t hi

i v

ng s

[37]

n vector

c

200

nhi

yb

acetosyringone. T n s

l cao

nh

ng s [21]

i

ut

a

c chuy

as

ng s t o ra th h th
chuy
chuy n gen

ng s [13; 14]
iv
d ng A. Tumefaciens

cm t

ng l n 2 v i OD600= 0,6


0,8 m

s d ng tr c ti p khu n l
dung d

t t i OD550= 0,3

ng t o

0,

c ng s [6]

n hai vector pXBb7-SIc
n

o ra
i con lai c

im c

tc

c Trung Qu

thu

-glucose pyyrophosphorylase (AGPase)

nh

ng h p t

s [38]

chuy n vector CAMBIA3301 mang gen glgC
sau 3 th h cho th

ng tinh b t trong h

Tuy
ch

n 25%.

u chuy

pm ts h n

c ph

l

i tr i qua nhi

d

nm

nh t

ngu n g

s

thu

i gi

t.

i gian chuy
tumefaciens

t) ph i m t kho ng
it

th i gian tr

ph i m t t

[21].

l

ut

i

cho hai v thu ho
th

s d

m b h n ch b i

tu i t

ph n

n ch
c hi

c trong th i gian

c nhi

Kh c ph
chuy n gen Bt2

m.
Li

ng s

Sh2
i hi u qu

c chuy

chuy

[24]

u

c

s d ng vi khu n A. Tumefaciens

d

i A.

khi x

ic

ng 10%
ng s [39]

n giao T
psy

A. tumefasciens.


m th

n th

ch ng t

n.

1.4.2
ts

u chuy n gen

y ut

u h n.

2007, Ph m Th

ng h th

nh
nh

nh r ng chuy n gen b

iv

u qu cao

u [3]

ng s [4]

u chuy n gen ch u h n ZmDREB2A
x

i dung d ch huy

chuy

c khi th ph n
uh

trong s n xu

n Agrobacterium mang vector
u chuy n
ts

m

ng

KC.04.02/11-

nhi

u chuy

HVA1, ZmDREB2A

u h n

CspB
n Agrobacterium tumefaciens. M
u chuy n gen ch u h n NF-TB2

ng s [4]
Hi n nay,
ng kh
Nguy
m ts
%

n 1,77%.

ts

ut
ng h p tinh b t b
nhi

m
gen c a PGS. TS
ut

c

n gen mang gen Sh2 v i hi u su t chuy n gen t 1,08


2.1

H tc

m H20
p. Ch ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang

c

vector chuy n gen pCambia2300-Ubi-Bt2
th c v t

Vi

nt

Sinh h c cung c p [2].

u khi

c hi

gen Bt2

m),

ng t ng h p tinh b t, gen ch n l

u khi
k

-Ubi-Bt2;
Ubi: promoter Ubiquitin; Bt2: gen Brittle 2

MV:

Promoter
.

M i Bt2F:

-GCGGATCCACCATGGACATGGCTTTG-

a

m c t c a enzyme BamHI.
M

- GCGAGCTCAAGCTTCATGTCGCACGTm c t c a enzyme SacI.

M i UbiF:

CTGCAGGTGCAGCGTGAC

m c t c a enzyme PstI.
M i UbiR:
ch

GGATCCTGCAGAAGTAACACCAAA

m c t c a enzyme BamHI.
c hi
c

chuy n gen.

d

ki m tra s

c thi t k t
tc

a


2.1.2
m:
MS I stock: pha 33 g NH4NO3; 38 g KNO3; 7,4 g MgSO4
cc
MS II stock: pha 33,202 g CaCl2

cc

MS III stock: pha 17 g KH2PO4

cc

MS IV stock: pha 0,62 g H3PO4; 0,86 g ZnSO4.7H2O; 1,69 g
MnSO4.H2

cc

MS V stock: pha 0,25 g Na2MoO4.2H2O; 0,025 g CuSO4.2H2O; 0,025 g
CoCl2.6H2

cc

MS VI stock: pha 3,726 g Na2EDTA; 2,78 g FeSO4.7H2

t

c c t.
MS VII stock: pha 0,5 g nicotinic acid; 0,5 g Pyridoxine-HCl; 0,1 g
Thiamine-

cc

MS VIII stock: pha 10 g Myo-

cc
II stock, 10 ml MS

III stock, 10 ml MS IV stock, 1 ml MS V stock , 10 ml MS VI stock, 1 ml MS
cc
c chu

ng

o qu n

100 mM acetosyringo
dimethyl sulfoxide. Dung d
qu n trong t i

c l c trong c t l

o

40C.

Rifam
d

c l c trong c t l
Cefotaxime

Dung d

cefotaxime
c l c trong c t l

LB: pha 25 g Lurianhi

-200C.

o qu n

c c t kh
o qu n

-200C.

c c t. Kh

ng

1210C tro
t DNA t
(1984 )[30]

n gen theo

c a