Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) bằng phương pháp in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)

I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM

HOÀNG TH

NG

tài:
U

NG C A CH T KÍCH THÍCH

N KH

NG CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn) B

IN VITRO

KHÓA LU N T T NGHI

H

o:

IH C

Chính quy

Chuyên ngành:

Công ngh Sinh h c

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa h c:

2011 2015

Thái Nguyên - 2015


I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM

HOÀNG TH

NG

tài:
U

NG C A CH T KÍCH THÍCH

N KH

NG CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn) B

IN VITRO

KHÓA LU N T T NGHI

H
o:
Chuyên ngành:
Khoa:
Khóa h c:
Gi
ng d n:

Khoa CNSH - CNTP -

IH C

Chính quy
Công ngh Sinh h c
CNSH - CNTP
2011 2015
1.PGS.TS. Ngô Xuân Bình
B Khoa h c và Công ngh
2. ThS. Nguy n Th Tình
Nông lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2015

i
L IC

Sau 6 tháng th c t p t i phòng thí nghi m nuôi c y mô Khoa Công ngh Sinh
h c và Công ngh Th c ph

tài c

c k t qu

Ban giám hi u nhà

ng, Ban ch nhi m khoa cùng các th y cô giáo trong b

u ki n

em trong su t th i gian qua.
Em xin bày t lòng bi
Nguy n Th

c th y giáo PGS.TS. Ngô Xuân Bình và ThS.

n tình ch b

ng d n em trong su t th i gian th c hi n

tài.
Em xin bày t lòng bi
báu c

i v i nh

ng d n quý

n trong quá trình th c hi n và hoàn thành khóa lu n.
Cu i cùng, em xin chân thành c
t

n t i b n bè

i thân

ng viên,

u ki n v v t ch t và tinh th n cho em trong quá trình h c t p và

nghiên c u.
Do th i gian th c hi
nh ng sai sót. Em r t mong nh
tài c

tài có gi i h n nê
cs

tài không th tránh kh i
n c a th y cô và các b n

c hoàn thi

Em xin chân thành c

Thái Nguyên, ngày 03 tháng 0
Sinh viên th c hi n

Hoàng Th

ng


ii
DANH M C CÁC B NG BI U

B ng 3.1: B ng tên hóa ch t dùng trong thí nghi m.................................................22
B ng 3.2: B ng tên thi t b dùng trong thí nghi m...................................................22
B ng 4.1: K t qu

ng c a BA

n kh

i cây Sâm cau (sau

30 ngày nuôi c y).....................................................................................29
B ng 4.2: K t qu

ng c

n kh

i cây Sâm cau

(sau 30 ngày nuôi c y).............................................................................31
B ng 4.3: K t qu

ng c

n kh

i cây

Sâm cau (sau 30 ngày nuôi c y) ..............................................................33
B ng 4.4: K t qu

ng c a hàm l

ng BA k t h

n kh

nhân nhanh cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi c y) ....................................35
B ng 4.5: K t qu

ng c

ng BA k t h p

n kh

nhanh ch i cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi c y) .....................................37
B ng 4.6: K t qu

ng c

n kh

c a cây Sâm

cau (sau 30 ngày nuôi c y) ......................................................................39
B ng 4.7: K t qu

ng c

n kh

c a cây Sâm

cau (sau 30 ngày nuôi c y) ......................................................................40


iii
DANH M C CÁC B NG BI U
Hình 2.1. Cây Sâm cau................................................................................................5
Hình 2.2. Lá Sâm cau ..................................................................................................5
Hình 2.3. Hoa Sâm cau ...............................................................................................5
Hình 2.4. Qu và h t Sâm cau.....................................................................................5
Hình 2.5: M t s h p ch
Hình 4.1:

c li u Sâm cau [37] ......................................8

nh ch

ng n n b sung BA

cá

ng

khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y) ...........................................................30
Hình 4.2:

nh ch

ng n n b sung Kinetin

các hàm

ng khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y) .................................................32
Hình 4.3: nh ch

ng n n b sung BA

ng

khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y) ...........................................................34
Hình 4.4:

Hình 4.5:

nh ch i Sâm cau trên môi t
Kinetin

ng khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y)...................36

nh ch

ng n n b sung BA 1,0 mg/l k t h p

NAA
Hình 4.6:

ng n n b sung BA 1,0 mg/l k t h p

nh r

ng khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y) ......................38
ng n n b sung IBA

ng

khác nhau(sau 30 ngày nuôi c y) ............................................................40
Hình 4.7:

nh r

ng n n b sung NAA

ng

khác nhau (sau 30 ngày nuôi c y) ...........................................................41

iv
DANH M C CÁC T , C M T

VI T T T

B1

:

Thiamin HCl

B2

:

Nicotinic acid

B5

:

B6

:

Pyridocine

BA

:

6- Benzyladenine

Cs

:

C ng s

CT

:

Công th c

CV

:

Coeficient of Variation (H s bi

DNA :

ng)

Deoxyribonucleic Acid
i ch ng

GA3

:

IBA

:

LSD

:

Gibberellic Acid
Indol Butyric Acid
Least Singnificant Diference Test (Sai khác
a các công th c
m

tin c y 95%)

KIN

:

Kinetin

MS

:

Murashige & Skoog (1962)

NAA :
TN

:

-Napthalene Acetic Acid
Thí nghi m


v
M CL C

PH N 1. M

U ....................................................................................................1

tv

............................................................................................................1

1.2. M

u............................................................................................2

1.3. Yêu c u c

tài ................................................................................................2
c và th c ti n c
oa h c c

tài .............................................................2

tài ..............................................................................2

c ti n ...............................................................................................3
PH N 2. T NG QUAN TÀI LI U .........................................................................4
2.1. Gi i thi u chung v cây Sâm cau.........................................................................4
2.1.1. Ngu n g c .........................................................................................................4
2.1.2. Phân lo i............................................................................................................4
m hình thái h c c a Sâm cau ................................................................5
2.1.4. Giá tr

c li u c a Sâm cau ...........................................................................6
ruy n th ng nhân gi ng Sâm cau ............................................10

2.2. Khái ni m và c

khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t .........................10

2.2.1. Khái ni m v nuôi c y mô t bào th c v t......................................................10
khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t............................................11
2.3. Các y u t

n quá trình nuôi c y mô t bào ...................................12

2.3.1. V t li u nuôi c y .............................................................................................12
2.3.2.

u ki n nuôi c y ..........................................................................................12

2.3.3.

ng ...................................................................................13
n chính trong nuôi c y mô t bào th c v t .....................................16

2.5. Tình hình nghiên c u nhân gi ng cây Sâm cau b

y mô

trên th gi i và Vi t Nam..........................................................................................17
2.5.1. Tình hình nghiên c u trên th gi i..................................................................17
2.5.2. Tình hình nghiên c u

Vi t Nam ..................................................................19


vi
PH

NG, N

U....22

ng, v t li u và ph m vi nghiên c u........................................................22
ng, v t li u nghiên c u........................................................................22
3.1.2. Ph m vi nghiên c u.........................................................................................22
3.1.3 Hóa ch t và d ng c thí nghi m.......................................................................22
m và th i gian ti n hành nghiên c u ......................................................23
a

m nghiên c u .......................................................................................23

3.2.2. Th i gian nghiên c u ......................................................................................23
3.3. N i dung nghiên c u ..........................................................................................23
3.3.1. N i dung 1: Nghiên c u

ng c a m t s

n kh

sinh ch i cây Sâm cau ...............................................................................................23
3.3.2. N i dung 2: Nghiên c u
n kh

ng c

ng ch t kích thích sinh

i cây Sâm cau .................................................23

3.3.3. N i dung 3: Nghiên c u

ng c

ng m t s

n kh

cây Sâm cau..............................................................................................23

u....................................................................................24
u n i dung 1: Nghiên c u
n kh

ng c a m t s

i cây Sâm cau...................................................24

3.4.2.

u n i dung 2: Nghiên c u

ch

n kh

3.4.3.

u n i dung 3: Nghiên c u
n kh

ng c

ng

i cây Sâm cau.................25
ng c

ng

cây Sâm cau .....................................................................27

3.5. Các ch

............................................................................28

PH N 4. K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N.....................................29
4.1. K t qu

ng c

ng Cytokinin

n kh

i cây

Sâm cau .....................................................................................................................29
4.1.1. K t qu

ng c

4.1.2. K t qu

ng c

n kh
n kh

i cây Sâm cau.............29

i cây Sâm cau ......31


vii
4.2. K t qu

ng c

ng ch

n kh

nhân nhanh ch i cây Sâm cau ...................................................................................33
4.2.1. K t qu

ng c

n kh

i cây

Sâm cau .....................................................................................................................33
4.2.2. K t qu

ng c

ng BA k t h

n kh

nhanh ch i cây Sâm cau ............................................................................................35
4.2.3. K t qu

ng c

ng BA k t h

n kh

nhanh ch i cây Sâm cau ............................................................................................37
4.3. K t qu

ng c a hàm lo i Auxin

n kh

cây Sâm cau.........39

4.3.1. K t qu

ng c

n kh

cây Sâm cau..............39

4.3.2. K t qu

ng c

n kh

cây Sâm cau............39

PH N 5. K T LU N VÀ KI N NGH ................................................................42
5.1. K t lu n ..............................................................................................................42
5.2. Ki n ngh ............................................................................................................42
TÀI LI U THAM KHAO


1

Sâm cau có nhi

i cau, Cô n c lan, Tiên mao, v i tên khoa h c

Curculigo orchioides Gaertn thu c h thu c h th y tiên (Amaryllidaceae) [17].
Sâm cau là lo i cây thân th o m c hoang
Malysia, Thái Lan, Philippine,
Sâm cau phân b r i rác

nh ng vùng núi r ng t i Vi t Nam, Lào,

, Trung Qu c [22], [30], [31].

Vi t Nam

các t nh vùng núi, t Lai Châu, Tuyên Quang, Cao B ng

n Tây Nguyên [4].

Theo y h c c truy n

, Sâm cau có tính ch t nh y d u, tác d ng l i ti u,

b kích d c, s d ng ch

n, tiêu ch y. Theo y h c c truy n

Trung Qu c g i tên Sâm cau v i tên g

cs d

cb

u tr suy gi m th l c, ch a b nh hen suy n, còi, vàng da, tiêu ch
b nh l u, kháng viêm, ch

ng và

ng ch

i

[21], [22], [30], [44].
y có th nh n th y r ng, tác d ng chính c a S â m c a u là t ng c
s c kh e và tinh th n, gi m m t m i, t ng s c l c và
i, c ng c h th ng mi n d

d o dai,

ng

ng ch c

Trên th

c ngoài

ph m có ngu n g c Sâm cau, ch ng h
a hãng Alma Health Care

ch ph m
-NITE
a Trung

Qu

a

hãng Sharmila [22]. Do giá tr

c li u l n vì v y S

c n ki t trong t

c tìm ra k thu t nhân gi

khai thác t i m c
ng này

trong t nhiên là r t quan tr ng.
Theo tài li u k thu t nhân gi ng m t s loài cây thu c quan tr
i, công b
b

c

t , Sâm cau có th s d ng nhân gi ng vô tính
t m m giâm hom. Tuy nhiên, v i s tìm hi u c a chúng tôi
v quy trình nhân gi ng vô tính Sâm cau b ng


2

tm
ph i xây d

ng h

c quy trình nhân gi
i hi u qu kinh t rõ r

ct

i

n, d th c hi n, h s nhân
kh c ph c h n ch nhân gi ng loài cây này

trong t nhiên [23].

Trên th gi i, c

t nhi u công trình nghiên c u nhân gi ng

cây Sâm cau b
kh

y mô t bào th c v t. Các nghiên c
in vitro. Quy trình nhân

nh Sâm cau có th nhân gi ng b

gi

n, h s nhân gi ng cao. Và theo các nghiên c u này cho th y không

có s

i v hình thái nuôi c y so v i cây m [30], [34], [41].
Vi t Nam, tài li u nhân gi ng Sâm cau còn ít và h n ch chính vì v y vi c
in vitro là c n

tìm ra quy trình nhân nhanh loài cây quý hi m này b
thi t. Vì v y chúng tôi ti n hành nghiên c
ch

tài:

n kh

ng c a

ng cây Sâm cau (Curculigo
in vitro .

orchioides Gaertn) b

c

u

ng c

ng ch t kích thích s

n

ng cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) b

kh
pháp in vitro.

-

nh lo i Cytokinin

-

n kh

ng ch t kích thích h

i cây Sâm cau.
n kh

ng nhân nhanh ch i

cây Sâm cau.
-

ng lo i Auxin thích h

n kh

- Giúp cho sinh viên c ng c và h th ng l i ki n th

cây Sâm cau.

c vào th c ti n.

ng th i ti p c n công tác nghiên c u khoa h c ph c v cho vi c nghiên c u và
công tác sau này.


3

- Bi

um tv

khoa h c, x lý, phân tích s

li u, trình bày m t báo cáo t t nghi p.
1.4.2.
- K t qu nghiên c u c

tài giúp xây d

ng

cây Sâm cau b

y mô, hoàn thi n quy trình nhân nhanh

gi ng Sâm cau b

y in vitro, t o ra s

v is

ng l n, ch

ng t

ng gi ng Sâm cau

u ph c v cho quy trình s n xu t.


4

c ghi nh n trong th c v t ch c a m t s
b c phân lo i loài. Theo m t s tài li u, Sâm cau phân b
Qu c, Nh t B

c t r t lâu và
, Sri Lanka, Trung

t Nam, Lào, Thái Lan,

Malaysia, v.v [22], [30], [31].
cg iv
Sâm cau là loài thân th o, thân c
r ng ch u bóng
màu m , m, t

c nh . Sâm cau có ngu n g c
ng, phát tri n t t

cao t i 2300 m so v i m

c bi

ng b
c bi

m [40], [41], [61].

Chauhan và cs (2010) [29], cây Sâm cau

Gi i (Kingdom)

Plantae

Ngành (Division)

Spermatophyta

L p (Class)

Monocotyledon

B (Order)

Liliidae

H (Family)

Amaryllidaca

Chi (Genus)

Curculigo

Loài (Species)

Orchiodes

vùng
t

t


5

-

m c a thân r
Sâm cau là cây thân th o s

chi u cao kho ng 20 - 30 cm
r m p, hình tr dài, m c th ng, thóp l i
u chi u dài 2,5 -

hai

ng kính 1,0 - 4,5

cm, b m

u

r ph có d ng gi ng thân r , bên trong có màu
kem; v nh
-

ng [4], [52].

Hình 2.1. Cây Sâm cau

m c a lá
p và
-

-3

to và dài;
10 cm [4], [52].
Hình 2.2. Lá Sâm cau [52]
-

m c a hoa

mang 3 -

[4], [52].
Hình 2.3.

i m c a hoa

mm, 1 -

- 2 mm,
- 7 [4], [52].
Hình 2.4. Qu và h t Sâm cau


6

2.1.4.1. Giá tr làm thu c c a Sâm cau

Theo y h c c truy n
kích d c, s d

, Sâm cau có tính ch t nh y d u, tác d ng l i ti u,
u tr b

c s d ng b

n, tiêu ch y. Sâm cau
ch a ng a và b nh ngoài da. Bên c

c s d ng làm thu

ng ch

lý cho nam gi i.

Trong y h c c truy n Trung Qu c
thu c b

c s d ng

u tr suy gi m th l c, ch a b nh hen suy n, còi, vàng da, tiêu ch y,

ng và b nh l u, kháng viêm, ch
gi

, l i ti u, thu c b

.

cs d

ng ch

làm
i [21],

[22], [30], [44], [55]
c li u Sâm cau là Rhizoma Curculiginis. Theo kinh nghi m dân gian,
thân r (hay c ) c a cây Sâm cau có v cay, tính

c, b th n tráng

tê, tráng gân c t, ch tr tinh l nh, li
nh da, th

c

c, phong th
c ph i h p v

u tr tiêu bi

kh

l nh t

c, b i b
i lo n th n kinh ch

i già,
a tiêu ch y.

t nh t vào mùa thu, b ph n thu

ho ch làm thu c là thân, r mang v c o s ch v ngoài ho
g

c

y, ch a cao huy t

cung, ch a phong th

c thu ho

n

c li u khác s d

nam tinh l nh, li

ph n sau sinh, ch a li

i,

il

tr s t xu t huy t, ch a tê th

áp (ti n mãn kinh), b i b ,

n ,b

c, r

c

y khô c t s d ng d n [4].

Trên th

ph m có ngu n g c Sâm

cau, ch ng h

ph

d ng h tr

i, vô sinh, hi m mu n do tinh l
và ch ng l i nh ng b

a

ng v tinh trùng, giúp b i b s c kh e, b th n tráng

ng sinh l c, gi
và chân tay c a t

u tr suy gi m ch c

Linh.

ng m t m

c trí óc


7

2.1.4.2. Thành ph n hóa h c và tác d

c lý

Thành ph n hóa h c c a Sâm cau
Các nghiên c

c thành ph n hóa h c c a Sâm cau g m các

ch t chính là glycosids, là nh ng ch t có ho

c h c ch y u c

Sâm cau. Các ch t có ho t tính trong c Sâm cau

c li u

nh g m flavones,

glycosite, steroids, saponins, triterpenoids và các h p ch t khác trong cây

c

báo cáo b i các tác gi (Ajit 2012, Mistra et al. 1990, Nagesh 2008, Neema et al.
2010, Xu et al. 1992) [22], [40], [41], [61].

t s ch th khác

c s d ng làm ch t chu n góp ph n nh n d ng
c li u Sâm cau [30]
Theo Wealth of India (1950) c Sâm cau ch

ng t do (7.56%), mucilage

(8.12%), hemicelluloses (12-15%), polysachharides (17.01%) [54]. Thành ph n hóa
h c c a thân c

c công b b i nhi u tác gi , bao g m các nhóm sau:

Nhóm Steroids và triterpenoids: G m steroids, sitosterol, stigmasterol [33]
và yuccagenin [58]. Trong s

c chi t tách có 1 triterpene là axit 31-

methyl-3-oxo-20-ursen-28-oic [39] và s còn l
[33], curculigol, curculigenin [60], [61], Curculigenin B và curculigenin C [59].
c tách chi

Nhóm Glycosides và saponins:
t thân c

t tên là các ch t phenol A - M curculigosaponins [61], [62]. Ti

5 ch

c tách chi t là curculigoside (5-hydroxy-2-O- -D-

glucopyranosyl benzyl-2,6-dimethoxy benzoate [36], curculigine A và orcinol
glucoside [59], corchioside A [33]và flavanone glycoside - I(glycoside 5,7dimethoxy-dihydromyricetin-3-O- -L-xylopyranosyl
Nema và cs

t tách và nh n bi t thêm m t ch t glycoside m

D-glucopyranosyloxy-5-hydroxybenzylphân t

(4-1)- -D-glycopyranoside.
t tên là 2- -

-dimethoxy- -ydroxybenzoate. Công th c

nh là C22H26O12 [44].

Nhóm h p ch t ch

g m N-acetyl-N-

hydroxy-2-carbamic acid methyl ester, 3-acetyl-5-carbomethoxy-2H-3, 4, 5, 6-

8

tetrahydro-1, 2, 3, 5, 6-oxotetrazine, N, N,

-tetra methyl succimmide và

Lycorine [58].
Ngoài ra, m t s ch

nh có m

xylose, glucoronic acid, resin, tannin, fat, tinh b

ng t ng s c a các ch t

này trong c Sâm cau kho ng 8-9% [30].
M ts

cs d

nh ho t ch t curculigosidate b

nh ch

ng Sâm cau

2,6-dimethoxybenzoic axit

trong máy s c khí l ng cao áp (HPLC), ho c s c khí c t

quang

c

sóng UV 283 nm.
Lu và cs

ng curculigoside

Sâm cau (Curculigo orchioides

ng trong 6 m u

phân tích khác nhau thu th p t i t nh Qu
M t s h p ch

Hình 2.5:

c li

0,11% to 0,35% [37].
c th hi n trong hình 2.5.

[37]


9

Tác d

c lý c a Sâm cau
y ho t tính b o v gan th

Ho t tính b o v gan:
ch ng l

c t rifampicin, thioacetamide, galactosomine, carbon tetrachlorite c a

ho t ch t curculignin A và curculigol chi t tách t
methanol r

Sâm cau [48]. D ch chi t

c phát hi n có tác d ng b o v gan chu t [26].

Ho t tính ch ng oxy hóa: D ch chi t methanol r
tác d ng ch ng oxy hóa
Ho

c phát hi n có

chu t [57].
nghi m d ch chi t

u hòa mi n d ch:

methamol Sâm cau trên chu t và nh n th

kháng th

nhi m cyclophosphamide, ph n ng nh y c m
t bào máu tr ng và ph thu c vào li
Ho

d ng tr hoãn và các m

ng [25].
Nghiên c

ng ch

t c n có tác d ng kích thích sinh d

th

c qua các thông s

i ch ng sau 30 phút ph n ng [53]. D ch chi

c i thi

ho

ng tình d c

li

ng 200 mg/kg tr

nh d ch chi t c n
tr

ng t d ch chi t

ng tinh trùng in vitro

c ghi nh n. Ngoài ra, tác d
k so v i

khi

li

ng 100 mg/kg

ng chu t tr ng có tác d
chu

c [29].
ng: C d ng d ch chi

Ho t tính kháng ti
tính ch

ng huy

th b ti

c và c

ng so v

u có ho t

i ch ng [28].

D ch chi t Sâm cau có ho t tính ch ng loãng

Ho t tính ch ng l
th

ng ch c

ng th i không

n tr

canxi và osteoprotegerin trong huy t thanh, gi m liên k t deoxypyridinoline v i
creatinine, gi m hormone adrenocorticotropic và m
i factor-alpha, interleukin-6, alkaline phosphate
Ho t tính ch ng hen: D ch chi t Sâm cau b ng c
do

ng c a histamine

dê và l n v i n

T

chu t [27].
ng ch ng hen

100g/ml và 25g/ml

ng.

t (99%) và gi m esinophils t i 0%
li

ng 375 mg/kg tr

[45].


10

Ho t tính kháng vi khu n: Tinh d u Sâm cau có ho t tính kháng khu
k ch ng l i các ch ng vi khu
pullorum, v.v. và n

Bacillus anthracis, B. suhtilis, Salmonella

Fusarium monili forme, F. solani, v.v. [35]. Singh &
ng minh tác d ng kháng vi sinh v t do tác d ng c a ch t

saponin trong d ch chi t [50].
D ch chi

Ho t tính ch

c ch t

c phát hi n có tác d ng

i dòng t bào MCF-7 [50].

c nhân gi ng b ng h
l cây t o h t và kh
th loài trong t

ng ch di n ra vào mùa

y m m r t th

ms

ng th i khai thác quá m c trong th

tình tr ng nguy c p hi n nay c a loài cây này

nhi

ng cá
n

, Trung Qu c

v.v. [24], [41].
c nhân gi ng trong t nhiên b ng h t ho c b ng tách m m. Th i
v thích h p nh t tr ng là mùa xuân, các mùa khác tr ng cây c

ng r t kh e, lá xanh t
trong ch u làm cây c nh. N u tr

u
có th tr ng

t, có th tr ng v i kho ng cách 30 x 40

cm ho c 30 x 50 cm [4].
2.2.

c

in vitro


11

2.2.2.1.
u tiên nhà th c v t h
quan ni

i t bào b

kh

t hóa) c a m

sinh v

có th phát tri n thành m t
Theo quan ni m c a sinh h c hi

u ch a b gene y h

hoàn ch
t c m i t bào c a m

t c các t bào c a m

có ti

t ng h p nh ng ki u protein - enzym gi ng h t nhau và n
ng thích h

u có

c nuôi trong môi

u có th phát tri n thành cây nguyên v

th và ra hoa, k

ng. Kh

at

c g i là tính toàn

a t bào th c v

a t bào th c v
lí lu n c a nuôi c y mô t bào th c v
ch ng minh

c kh

th c v t hoàn ch nh t m t t bào

riêng r [12].

Theo PGS.TS Nguy n Quang Th

th c v

ng thành

là m t ch nh th th ng nh t bao g m nhi
nhiên, t t c các lo i t

u b t ngu n t m t t

u tiên (t bào h p t ).

u, t bào h p t phân chia hình thành nhi u t
mang ch

t (chuyên hóa).
các t bào phôi sinh này chúng ti p t

c bi

c hi

.

T bào phôi sinh -> T bào dãn -> T bào phân hóa có ch
Tuy nhiên, khi t
chúng không hoàn toàn m t kh
thi t,

i thành các t

t.

bào có ch
ng h p c n

u ki n thích h p, chúng l i có th tr v d ng t bào phôi sinh và phân

chia m nh m cho ra các t bào m i có kh

nh. Quá


12

trình này g i là quá trình ph n phân hóa t

c l i v i phân hóa t bào. S

phân hóa và ph

:

c bi u th b ng bi

Phân hóa t
bào
T bào phôi sinh

T bào giãn

T bào chuyên hóa

Ph n phân hóa
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi c y mô, t bào th c v t th c ch t là
k t qu c a quá trình phân hóa và ph n phân hóa. K thu t nuôi c y mô, t bào th c
v

n cùng là k thu

m

u khi n s phát sinh hình thái c a t bào th c v t

ng d a vào s phân hóa và ph n phân hóa c a t

s

a t bào th c v t [12].

2.3.1.
V t li u nuôi c y là ngu n nguyên li u kh
vitro

u cho quá trình nhân gi ng in

c l a ch n v t li u nuôi c y thích h p là c n thi
u cho nhân gi ng vô tính in vitro có th là ch

cau, v t li u kh
ng, ho

i v i cây Sâm

n thân, r . Các v t li u này c

nh sinh

mb

c khi

ti n hành nuôi c y in vitro

t li u thông d ng nh t hi n nay

là s d ng các ch t hóa h

i v i các thí nghi m nuôi c y Sâm cau in vitro, tôi

s ch

ph c v cho vi c nhân gi ng in vitro.

nh

2.3.2.
u ki n nuôi c y

n s phát sinh hình thái c a t bào và mô

trong quá trình nuôi c y in vitro

u

ki n có vai trò quan tr ng nh t [12].
- Nhi

: Là y u t quan tr ng

n s phân chia t bào và các quá

i ch t trong nuôi c y mô, nhi
27oC, nhi

còn

ng t i ho

nuôi c

ng c a Auxin [18].

ng gi

nh

25 -


13

- Ánh sáng: Các nghiên c u cho th y ánh sáng r t c n thi t cho s phát sinh
hình thái m u nuôi c y. Các lo i m u c y khác nhau có nhu c u v th i gian chi u
ánh sáng khác nhau. Th i gian chi u sáng v
thích h p là 12 -

các loài cây

ánh sáng thích h p cho mô nuôi c y là 1000 -

10000 lux [19].
-

m: Trong các bình nuôi c

i luôn luôn là 100%.

2.3.3.

u ki n c n thi t và là y u t quy
trình phân hóa và ph n phân hóa c a t bào. Thành ph n c
bào

n quá
ng nuôi c y t

i tùy theo loài th c v t, lo i t

c nuôi c

v i cùng m t lo

i

y không gi ng nhau, môi

ng nuôi c y s d

ng nuôi c y còn thay

n si

ng và phát tri n c a m u nuôi c y [19]. H u h t các môi

ng s d ng trong nuôi c y mô t bào th c v t bao g m các thành
ph n chính sau:
- Ngu n cacbon: Là y u t quan tr
tri n c a mô nuôi c y,

iv is

cb

ng và phát

id

Hi n nay, trong nuôi c y in vitro

ng s d

ng saccarose, m t s

ng h p có th s d ng glucose và fructose thay th [12].
- Mu

ng: Các nguyên t

ng là m t

trong nh ng thành ph n thi t y u c n cho vi c cung c p nguyên li
th c v t xây d ng nên thành ph n c u trúc c

t bào, mô

c bi t, nó có vai trò quan tr ng

tham gia vào thành ph n axit nucleic, axit amin, tham gia c u t o màng t bào,...[12].
Bên c

ng có vai trò kích thích s ho

ng c a

nhi u enzyme và xúc tác cho các ph n ng sinh hóa x y ra trong t bào.
Trong thành ph n mu i khoáng
y

ng, các nguyên t c n ph i cung c p ch

phospho, kali và s t [19].
Các lo i mu
ng th

ng: Là nh ng nguyên t
mg/l dung d

t nhi u nguyên t

c s d ng v i
c ch ng


14

minh là không th thi

i v i s phát tri n c a mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co.

Các nguyên t

ng trong ho

ng c a các enzyme [12].

- Các vitamin: Do các lo i mô và t bào th c v t nuôi c y có kh
h

ch uh

ng

v s

nuôi c y in vitro, các vitamin c

ng v i thích h

bi

B3, B5, B6

1

c

c xem là

vitamin quan tr ng nh t cho s phát tri n c a th c v t [18].

c pha

d ng dung d ch m có cao t

n 1000 l n dung

d ch làm vi c. Dung d ch vitamin d b h ng do n m, khu n nhi m t p và d b
phân h y

nhi

ch pha ch

cao, vì v y c n b o qu
c khi s d ng [12].

- Các ch

ng: Tr

v t, thành ph n quan tr ng nh t quy

tái sinh các b ph n c a m u c
u ti

ng nuôi c y mô t bào th c

nh k t qu nuôi c y mô là các ch

u t quan tr ng nh

ch

i 0oC ho c

u ki n l

u hòa

u khi n s phát sinh hình thái và

tr thành cây hoàn ch nh. Hi u qu s d ng c a

ng ph thu c vào: s d ng, ho t tính v n có c a ch

u

ng, m u nuôi c y. Trong nuôi c y mô t bào th c v t các nhóm ch t
ng s

d ng 3 nhóm ch t chính là: Auxin,

Cytokinin, Gibberellin [18], [19].
+ Nhóm Auxin
Là ch

ng do Went và Thimann (1937) phát hi n, ch y u

kích thích s giãn c a t
hi n r b

nh. B n lo

hình thành mô s o và s xu t
c s d ng trong nuôi c y mô là: Indolylacetic

acid (IAA); Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4-Dichlorphenoxy acetic acid (2,4-D);
nhiên, NAA, IBA và 2,4-D là
các auxin nhân t o. Các auxin nhân t

ng có ho t tính m

u trúc

phân t khá b n v ng nên các auxin nhân t o khó b oxy hóa b i các enzyme. IAA
c s d ng do kém b n v i nhi

ng dùng

khá cao: 1,0 - 30


15

ng s d ng t 0,001 - 10 mg/l. Chúng có hi u qu
sinh lý

th p [18], [19].

+ Cytokinin

Cytokinin

n s phân chia t bào, s phân hóa ch i b

nh. Trong

ng nuôi c y mô, Cytokinin c n cho s phân chia t bào và phân hóa ch i t
c m mô s o ho c t

ng phát sinh ch i ph . Các Cytokinin

c s d ng trong nuôi c y bao g m: Kinetin (6-furfurylaminopurine); BA
(6-benzylaminopurine) [18].
ng Cytokinin s
Auxin/Cytokinin

d

ng t

0,5 - 5,0 mg/l. T l

ng nuôi c y quy t

nh s phân hóa c a mô theo

ng t o r , t o ch i hay mô s o [19].
Nghiên c u c

y không ph i các ch t kích

ng ngo i sinh tác d

cl pv

Phân chia t bào, phân hoá và bi

ng n i sinh.

u khi n b ng s

gi a các hoocmon ngo i sinh và n i sinh. Tác
Cytokinin có tác d ng quy

ng ph i h p c a auxin và

n s phát tri n và phát sinh hình thái c a t bào

và mô. Nh ng nghiên c u c a Skoog cho th y t l auxin/Cytokinin cao thì thích
h p cho s hình thành r , và th p thì thích h p cho quá trình phát sinh ch i. N u t
l này

m

cân b ng thì thu n l i cho phát tri n mô s o (callus). Das (1958) và

Nitsch (1968) kh

nh r ng ch khi tác d

ng th i c a auxin và Cytokinin

thì m i kích thích m nh m s t ng h p ADN, c m ng cho s phân chia t bào.
uc
n ti p theo thì c

c c m ng b i
ng t ng h p c a c hai ch t kích thích.

nh vai trò c a Cytokinin trong quá trình phân
chia t bào c th là Cytokinin
cho quá trình này di n ra m
h

u khi n quá trình chuy n pha trong mitos và gi
ng. Cytokinin

c t ng h p b i r và

ng phát tri n [1], [20].
+ Gibberellin
H p ch t này có tác d ng kích thích s giãn t bào theo chi u d c, giúp kéo
t thân cây, phá ng c a phôi, c ch t o r ph

o ch i ph .


16

Ngoài ra GA3 còn

n s ra hoa c a m t s th c v t và rút ng n th i

ng c a cây [18].
-

t trong nh ng thành ph n có vai trò cung c p dinh

ng cho mô nuôi c

c bi t, trong nuôi c

ng nuôi c

ng làm r n hóa

ng dùng cho nuôi c y mô t bào th c v t là t 0,4 -

0,8% [12].
- pH: Là y u t quan tr ng

ng r

ch t trong t

n kh

i các

ng nuôi c y pH thích h p nh t là 5,6

- 5,8 [12].

Theo PGS.TS. Ngô Xuân Bình và cs [1]: Trong nuôi c y mô, t bào g m 5
n sau:
-

n 1:

n chu n b
nh toàn b quy trình nhân gi ng in vitro.

n quan tr ng quy
M

n này là ph i t

c nguyên li u th c v

vào nuôi c y.
M

bên ngoài vào ph

l s ng cao, t

m b o các yêu c u sau: T l nhi m th p, t

ng nhanh.

K t qu c

n này ph thu c vào cách l y m u, và th i gian x lý di t

khu n. V t li

c ch

ng, ch i

n thân, m nh, lá, r .
-

n 2: Tái sinh m u nuôi c y

M

n này là tái sinh m

mô nuôi c
ng (t l auxin/Cytokinin
Tuy nhiên bên c
c
chuy n hoá.

ng s phát tri n c a

u khi n ch y u b ng các ch
ng nuôi c y.
n tu i c a m

u hòa sinh