Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B ( SEN) dạng không độc từ đoạn GEN SEB tự nhiên làm nguyên liệu phục vụ chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB (Luận văn thạc sĩ)

-----------------------------------

12/2014

i Trung tâm H

/>

-----------------------------------------

Chuyên ngành: Sinh h
: 60420114

SINH

12/2014

i Trung tâm H

/>

i Trung tâm H

/>

!
PGS. TS.
Hàn lâm Khoa

giúp tôi

và

hoàn thành
Tôi xin

c

chân thành

chuyên môn.
Tôi
các th

15:

phylococcal enterotoxin B

(SEB)

. TS.

2013 2015.
, tôi xin
và

tháng

Hoài Thu
i Trung tâm H

/>
.

4


Trang
................................................i
...................................................................................................... iii
.......................................................................................................v
.........................................................................................................................1
...........................................................................3
Staphylococcus aureus) .........................3
..................................................................................................3
1.1.2. T i Vi t Nam..................................................................................................6
Staphylococcus aureus .................................................................8
........................................................................................................8
.........................................................................8
.......................................................11
......................................................15
.......................................................................................15
............................................................................................16
...................................................................17
............................................17
...........................................21
................................................................................................23
1.4.1

.....................................................................................23
............................................................24

........................................................................25

i Trung tâm H

/>

.................................26
...............................................26
.........................................................................................................26
......................................................................................................26
....................................................................................28
.........................................................................................28
..........................................................................28
...............................................................................28
......................................29
PCR) ...............................................30
........................................................30
.....................................................................31
-primer ................31
................................................................................32

...............................................................................................................................33
........................................................33
enzym

.............................................................34
........................................................................34
...........35
.............................................35
.............................36

.................................................37
................38

i Trung tâm H

/>

.............................38
........................................................................40
..................................................................42
S. aureus và nhân dòng gen seb..............................42
S. aureus...............................................................42
3.1.2. Nhân dòng gen seb ......................................................................................42
.............................................................................44
seb ........................................................................45
....................................................................................45
...............................................................47
seb
(b+)

.......................48
.....................................48

3.3.2. G

...................................49

3.4. T

gen seb

E. coli BL21 và
.........................................................................................50
oli BL21 .................................50
.........................................51
.............................................................55
Bradford ..............57
..........................................58
................58
a protein wtSEB và mtSEB
LD50 và lô
...............................................................................................................58

i Trung tâm H

a protein wtSEB và mtSEB

LD50 ........60

a protein wtSEB và mtSEB

10xLD50 ......61

/>

K T LU N ...................................................................................................................63
..................................................................................................................63
...........................................................................................64
..............75

i Trung tâm H

/>

µl

Microliter

APS

Ammonium persulphate

bp

Base pair

BSA

Bovine serum albumin

dH2O
DNA

Deoxyribonucleic acid

DNase

Deoxyribonuclease

dNTP

Deoxyribonucleotide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG

K16

-D-1-thiogalactopyranosid

Kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria - Bertani

LD50

Lethal dose, 50%

ml

Milliliter

mtSEB

Mutant SEB

OD

Optical density

PBS

Phosphate buffer saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

S. aureus

Staphylococcus aureus

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

i


K16

SEB

Staphylococcal enterotoxin B

SEs

Staphylococcal enterotoxins

TAE

Tris-acetate-EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris EDTA

TEMED

N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine

v/p

Vòng/phút

v/v

volume/volume

w/v

Weight/volume

wtSEB

Wild type SEB

ii


Tên hình

Trang
S. aureus

Hình 1.1.

9

Hình 1.2. Các y u t gây b nh c a S. aureus

13

15

c c a siêu kháng nguyên

16
S. aureus

Hình 3.1
seb

42
S.

aureus
seb
Hình 3.4.
HindIII.

43

1.2/seb
seb

43

enzym

EcoRI và

S. aureus

44
44

seb

46

Hình 3.7.

47
47

Hình 3.9.

48

pET22(b+)/mtSEB
EcoRI,
HindIII
Hình 3.11

50
E. coli BL21 (DE3)

Hình 3.13.

K16

49

E. coli BL21 mang gen mã hóa mtSEB
c nhau

51
52

iii


E. coli

54
54

SEB
Hình 3.16. Protein mtSEB sau khi tin
SDS-PAGE

-NTA trên gel

56
57

Hình 3.18. Phân tích kh
tc
c hi u c a kháng nguyên tái t h p
v i kháng th kháng l i SEB c a S. aureus

58

50

sau 7 ngày theo dõi

60

50

sau 7 ngày theo dõi

61

m 10xLD50 sau 7 ngày theo
dõi

K16

62

iv


Trang
S. aureus

11
26
27
29

30

ô và gel tách
seb

36
S. aureus

2

57
wtSEB, mtSEB

tiêm 1xLD50
wtSEB, mtSEB
tiêm 3xLD50
3
tiêm 10xLD50

K16

45

wtSEB, mtSEB

59
60
61

v

T c u vàng (Staphylococcus aureus
aureus) là m t trong nh ng nguyên nhân chính gây ng

S.

c th c ph m do chúng ti t

c t ru t staphylococcal enterotoxins (SEs)
siêu kháng nguyên
enzym

các
o

121oC trong 28 phút, các

.T

khác nhau

Trong các
) do S. aureus

(Staphylococcal enterotoxin B

SEB)

n

, ví
-

methicillin.

.

Hi n nay,
SEB

hãng Tetracore, hãng Advnt, hãng Alexeter

Tuy nhiên, các

này

; kháng nguyên trong
c có th bi

i không phù h p v i que th nh p ngo i và n u nh p que th

nhanh, chúng ta s không ch
t o ra kháng

c ngu n khi c n thi t.

c nghiên c u
yên

gây mi n d ch s n xu t kháng th

K16

1


n thi

n nguyên li u quan tr ng ch

t o que th phát hi n nhanh SEB ph c v nhu c u hi n nay

c.

lý do trên, chúng

tài
SEB

seb
SEB

nhanh

seb
S. aureus
gen seb
amino acid Histidine thành Tyrosine.
seb

seb
ánh giá tính
háp Western blot.
.

K16

2


C
(Staphylococcus aureus)

.

Theo WHO/FA

(Mead et al., 1999). S. aureus
(Scallan et al., 2011).

S. aureus
(Jablonski, Bohach, 1997).
có liên
quan

.

(Denys, 1894).
1907,

d

, Owen

al., 1930).

(Dack et
vú

(Barber, 1914).

K16

3


S. aureus t

staphylococc

Jordan, Burrows, 1934).

do S. aureus

(Wieneke et al., 1993).
S. aureus

(Genigeorgic, 1989).
S. aureus
(1999-

-

(Haeghebaert et al., 2002).
Hennekinne
(Hennekinne et al., 2012).
S. aureus
S. aureus
(Haran et al., 2012).
et al., 2011), Brazil (Arcuri et al., 2010), Ireland
(Murphy et al., 2010),

(Unaydin et al., 2011)
bò. Viêm

(Syne et al., 2013)
8

Brazil

vú bò có

CFU/ml (Peles et al., 2007)
S. aureus

trùng (Do Carmo et al., 2002)

328

293

et al., 2004).

S. aureus (Scherrer

S. aureus
S. aureus

K16

4


(Peles et al., 2007). Tuy nhiên, S.
aureus

là do
(Peles et al., 2007).

thì S. aureus là tác nhân gây
(Syne et al., 2013).

S. aureus
27,1% (46/170).

S. aureus

t
S. aureus
(Syne et al., 2013).

Trong
1998-2008 (Bennett et al., 2013)

là
S. aureus

55% các
S. aureus
(44%) do sai sót trong

.
có 45% (45/100) các

các
S. aureus.

Georgia
S. aureus kháng methicillin là 3%

4%

(Jackson et al., 2013).

Louisiana

S. aureus (Pu et al.,

, và
2009).

S. aureus
nesota và New Jersey

(

al., 2012).

S. aureus
(Hanson et al., 2011);
(Waters et al., 2011).

K16

et

S. aureus
trên

5


cho chúng ta
S. aureus

(Loir et al., 2003). Ví

khác nhau
d ,

Anh và M , th t và các s n ph m t th t là nh ng th c ph

các v ng

ng g p trong

c th c ph m do t c u (Genigeorgis, 1989), ngoài ra thì th t gia c m,

salad và bánh cu

bi n (Minor, Marth, 1972).

lo i th c ph

các

n ng th c ph m do t c

trùng thì ph bi

t

c Anglo-Saxon, các s n ph m t s a thì t n su t cao

c khác (De Buyser et al., 2001).
1.1.2. T i Vi t Nam
Theo

c

l

l

-45% tr
S. aureus (

et al., 2003).

S. aureus

u
et al., 2003;

et al.,

2005).
Giai

òng (76,4%),

(72 - 88%), Kon tum (88 - 100%),
(53,8%).

K16

6


n

S. aureus
ngày 15/07/2013
bánh mì

S. aureus.

Sta

S. aureus.
S. aureus

Pasteu
5,4.104
ta

Vào ngày
20/09/2013

Hà Giang có 47 h c sinh b ng

c nh p vi

i th t l n

nhi m vi khu n t c u vàng S. aureus ( G

1/7/2014,

thành
ng trình

N
.
y

K16

là v

7


Salmonella

có
ylococci).

S.

aureus

Salmonella và Clostridium perfringens (Rosec, Gigaud, 2002;
Normanno et al., 2004).
Staphylococcus aureus

ae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus.
Staphyococcus aureus Rosenbach 1884.

men Coalugase và không có men Coagulase.
gulase

S. aureus.

Hình

K16

8


S. aureus

Staphyloc

Staphylococcus. S. aureus

v

-

(Hình 1.1).

S. aureus

Hình 1.1.

S. aureus
S. aureus
S. aureus,

enzym
S. aureus

Có hai

coagulase:

bound
do

free

áp lam kính giúp

coagulase

(Collins et al., 1995).

S. aureus

K16

9


NaCl (

2002).
S. aureus

òng S. aureus
-2 ngày nuôi

(Collins et al., 1995).
S. aureus có màu
-

-5
rite K2TeO3

(Sande, McKillip, 2002).

S. aureus

,
30o

l

o

o

C,

o

C) (Schmitt et al., 1990), pH
S. aureus là

(Bergdoll, 1989)

(Chaibenjawong,
Foster, 2011).
(Loir et al., 2003). S. aureus

(Kusumaningrum et al., 2002).
kháng:
S. aureus
có nha bào khác.
K16

10


S. aureus

các dòng S. aureus
ng dòng này ngày càng
Staphylococcus aureus

sang S. aureus

nhiên,
S. aureus

(Todar, 2005).
hình thành

dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus)

(Todar, 2005).

1
-

fribrinolysin (staphylokinase); catalase, coagulase; hyaluronidase;

lactamase

SER và SEU) (Martin et al., 2004).
1.

S. aureus

Protein
TSST-1

K16

11


Exfloliative exotoxin (ETA, ETB)

Fribrinolysin(enzym
Staphylokinase)

in.
enzym

.
-

- hemolysin)

- toxin

Trung hòa sphingomyelinase

photphorylcholine và creamide
- toxin

- toxin

các
-Valentine leukocidin

Panton

K16

Valentine leukocidin

12