Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp giai đoạn 1 thiết kế véc tơ và chọn tế bào biểu hiện insulin

BỘ Y TẾ







BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ




Tên đề tài:

Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp
Giai đoạn 1: Thiết kế vector và chọn tế bào biểu hiện Insulin







Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Văn Phủng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường đại học Y Hà Nội
Mã số đề tài (nếu có):

7950



Năm 2010

2


Những chữ viết tắt

ĐTĐ Đái tháo đường
BMI Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể)
IDF International Diabetes Federation (Hiệp hội ĐTĐ quốc tế)
PCR Polymerase Chain Reaction
Taq
Thermus aquaticus
TAE Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE)
EMBL European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh
học phân tử châu Âu)
DDBJ ADN Data Bank of Japan (Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản)
NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông
tin sinh học Quốc gia (Mỹ)

3
MỤC LỤC

Nội dung Trang
Đặt vấn đề 5
Chương 1: Tổng quan 6
1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường 6
2. Insulin 7
Lịch sử phát hiện 7
Cấu trúc phân tử 9
Quá trình hình thành insulin trong cơ thể 10
Cơ chế tác động của insulin 11
Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13
Nhu cầu insulin hiện nay 16
Pre-proinsulin và Proinsulin 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21
1. Proinsulin 21
1.1. Vật liệu 21
1.2. Phương pháp 22
1.2.1. Khuếch đại gen proinsulin 22
1.2.2. Tạo vector mang gen proinsulin 22
1.2.3. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp 22
1.2.4. Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen 22
1.2.5. Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS-PAGE 23
1.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp và nhận dạng bằng Western blot 23
2. Đối với insulin: chuỗi A, B 23
2.1. Vật liệu 24
2.2. Hoá chất 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.1. Tách chiết và tinh sạch plasmid 26
2.3.2. Tạo plasmid tái tổ hợp 27
2.3.3. Phương pháp đọc trình tự 27
2.3.4. Phương pháp biểu hiện protein 28
2.3.5. Phương pháp phân tích và nhận dạng protein bằng khối phổ 28
2.3.6. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Ni- NTA 29
2.3.7. Phương pháp cắt loại bỏ đuôi His Tag 29
3. Các tế bào biểu hiện 29
3.1. Vật liệu 29
3.2. Phương pháp 29

4
Chương 3. Kết quả 30
1. Proinsulin 30
2. Chuỗi A, chuỗi B 32
3. Kết quả tế bào biểu hiện 44

Chương 4: Bàn luận 45
Kết luận 47
Kiến nghị 47
Tài liệu tham khảo 48


















5
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường là bệnh được quan tâm từ lâu trên toàn thế giới vì gánh
nặng cho gia đình và xã hội mà nó gây ra.
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 263 triệu người mắc bệnh đái tháo
đường và con số này tiếp tục tăng lên. Ước tính đến năm 2025, con số này sẽ
lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên (so với
hiện nay) ở các nước phát triển là 42%, như

ng ở các nước đang phát triển (như
Việt Nam) có thể sẽ là 170% trong vòng 30 năm tới [1].
Ở Mỹ, có khoảng 14 triệu người mắc bệnh đái tháo đường; hàng năm,
250.000 bệnh nhân đái tháo đường chết vì các biến chứng của bệnh này. Ở
Singapore, tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng lên theo thời gian: năm 1975 là 1,9%;
1984 là 4,7%; 1992 là 8,6% [2].
Ở nước ta, theo Tạ Văn Bình và cộng sự [3], tỷ lệ mắc bệnh chung trên cả
nước là 2,7%; như vậy, có khoảng 2,3 triệu bệnh nhân đang mắc đái tháo
đường, con số này còn tăng lên đồng hành với sự tăng trưởng kinh tế và những
thay đổi về lối sống và các điều kiện sống.
Đặc điểm của bệnh đái đường (đặc biệt là týp 1) là phải dùng Insulin hàng
ngày và phải dùng suốt đời. Với tỷ lệ đái tháo đường như hiện nay, hàng năm cả
nước phải chi một số tiền không nhỏ cho việc mua insulin (khoảng 11.000 tỷ
đồng), chưa kể tiền điều trị nhiều biến chứng của nó. Ở nước ta hiện nay, toàn
bộ insulin đều phải nhập ngoại; vì vậy, nếu tự sản xuất được trong nước, giá
thành thuốc sẽ hạ và điều đó mang lại ý nghĩa kinh tế và xã hội không nhỏ.
Insulin là thuốc đầu tiên sả
n xuất bằng công nghệ tái tổ hợp gen được dùng
cho người từ năm 1978. Nguyên lý của công nghệ này, cho đến nay, không có
gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹ thuật đều được bảo hộ bởi các
Công ty hoặc cơ sở nghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệ sản
xuất insulin của riêng mình đều phải tự làm lấy từ đầu.
Vì những lý do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu này, là bước khở
i đầu,
với hy vọng có thể sản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp
ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội.
Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kế vector biểu hiện insulin và 2)
chọn tế bào biểu hiện insulin.

6
Chương 1. TỔNG QUAN
1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường
Định nghĩa: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay bệnh tiểu đường là một nhóm
các bệnh chuyển hoá được đặc trưng bởi tăng glucose máu mạn tính do hậu quả
của thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc kết hợp cả hai [3, 4].
Phân loại (1999): Theo phân loại đang dùng chính thức và đượ
c chấp nhận
rộng rãi hiện nay [3, 4], bệnh ĐTĐ được phân làm 2 nhóm:
Bệnh đái tháo đường týp 1: Thiếu insulin do tế bào β bị phá huỷ, thường
thiếu hụt insulin tuyệt đối. Nguyên nhân của hiện tượng phá huỷ tế bào β
thường là do tự miễn dịch (qua trung gian tế bào), cũng có khi không tìm thấy
nguyên nhân (vô căn).
Bệnh thường gặp ở người trẻ tuổi (< 35 tuổi), lứa tuổi hay gặp nhấ
t là 10 -
16 tuổi (Michael J. Fowler et al., 2007). Đây là một dạng bệnh nặng, trong đó
các tế bào có nhiệm vụ tiết insulin của tuyến tụy bị phá hủy nên cơ thể không có
insulin để sử dụng. Nếu không điều trị kịp thời và đúng đắn, bệnh nhân sẽ bị
nhiều biến chứng nặng và dẫn đến tử vong (Rother et all., 2007).
Bệnh đái tháo đường týp 2: Do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo
giảm ch
ức năng tế bào β, riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai.
Đái tháo đường type 2 là loại đái tháo đường “không phụ thuộc insulin”.
Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi, người béo phì, trong đó cơ thể vẫn sản
xuất insulin nhưng không sử dụng được, gọi là hiện tượng kháng insulin
(Michael J. Fowler et al., 2007) hoặc sử dụng kém hiệu quả. Bệnh diễn biến từ
từ, có khi không có triệu chứng gì và chỉ
được phát hiện tình cờ qua khám sức

khỏe định kỳ có thử đường trong máu và nước tiểu (Eberhart, MS; Ogden C,
Engelgau M, Cadwell B, Hedley AA and Saydah SH et all., 2004).
Tình hình bệnh ĐTĐ ở nước ta đã được công bố trong nhiều nghiên cứu:
Tỷ lệ mắc bệnh ở Hải Phòng 0,3% (1991), Huế 0,7% (1996); ngoại thành Hà
Nội 0,61%, nội thành 4,35% (Cường, 2004). Tỷ lệ trung bình của cả nước là
2,7% (đã điều chỉnh, tỷ lệ thô là 3,5%) (Bình, 2006) [3]. Tỷ lệ mắc bệ
nh ở các
khu vực khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê: Miền núi và Tây Nguyên
2,1%; đồng bằng 2,7%; trung du và miền biển 2,2% và thành phố 4,4% [3, 5].
Theo phân loại của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế và Tổ chức Y tế thế
giới, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường của Việt Nam nằm trong khu vực II (tỷ lệ
2-4,99%), giống các nước khác trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan,
Indonesia và thấp hơn các nước khu vực III (tỷ lệ 5-7,99%), nh
ư Nhật bản, Hàn
Quốc, Malaysia, Singapore, Australia [6].

7
Tỷ lệ mắc bệnh đái đường có xu thế tăng theo sự tăng trưởng kinh tế và
các thay đổi về xã hội: Hà Nội, năm 1991 là 1,1%; năm 2004 là 2,45% [5].
Theo một thống kê khác của Bệnh viện Nội tiết trung ương, chi phí trung
bình hàng ngày cho bệnh nhân đái đường (không có biến chứng) cao gấp 7,47
lần lương tối thiểu (thời điểm thống kê) [3, 5].
Ở Anh, khoảng 1,6 triệu người bị ĐT
Đ. Ở Mỹ, số người bị ĐTĐ tăng từ
5,3% năm 1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng nhanh. Những người lứa
tuổi trên 65 bị ĐTĐ gấp hai lần người lứa tuổi 45-54 [7].
Chẩn đoán xác định bệnh ĐTĐ bằng định lượng đường máu: lúc đói
≥126 mg/dl (≥7 mmol/l), thử ít nhất 2 lần liên tiếp; sau ăn hoặc bất kỳ lúc nào
≥200 mg/dl (
≥11,1 mmol/l).

Biến chứng và hậu quả của đái tháo đường:
Nếu không được phòng và chữa kịp thời, bệnh ĐTĐ dễ gây biến chứng.
Có thống kê đã cho thấy: 44% người bệnh đái tháo đường bị biến chứng thần
kinh, 71% có biến chứng về thận, 8% bị biến chứng mắt (giảm thị lực, có thể
dẫn đến mù lòa). Các biến chứng thường gặp khác có th
ể kể ra sau đây [3, 8]:
- Tim mạch: có thể gây đột quị, rối loạn tuần hoàn ngoại vi.
- Suy giảm tình dục, liệt dương.
- Hoại tử chi: có thể phải cắt cụt.
- Nhiễm trùng cơ hội.
Các yếu tố nguy cơ đối với bệnh ĐTĐ:
- Tiền sử gia đình có liên quan với bệnh ĐTĐ.
- Tiền sử s
ản khoa, thai kỳ.
- Chỉ số BMI cao, thừa cân, béo phì, vòng eo lớn.
- Tăng huyết áp.
- Ít hoạt động thể lực.

2. Insulin
Lịch sử phát hiện
Năm 1869, Paul Langerhans [9], một sinh viên ở Viện giải phẫu bệnh
Berlin, khi học cấu trúc của tuỵ dưới kính hiển vi, đã phát hiện ra rằng, có một
số đám nhỏ tế bào (“little heaps of cells”; về sau gọi là islets of Langerhans,
tiểu đả
o Langerhans) chưa thấy có tài liệu nào mô tả. Phát hiện này đã được
nhiều nhà nghiên cứu thời đó chú ý, đặc biệt là về mặt cấu trúc và chức năng
của chúng.

8
Về cấu trúc, người ta nhận thấy, chúng không có các đường thông với các

ống dẫn trong tuỵ [10]; về chức năng, Edouard Laguesse [11] gợi ý rằng, các
đảo này có thể sản xuất ra những chất có vai trò điều hoà trong quá trình tiêu
hoá.
Để làm rõ nhận định này, con trai của Langerhans, Archibald, đã làm hết
mình, giúp cha tìm hiểu cơ chế điều hoà trong quá trình tiêu hoá và đã thu được
nhiều kết quả quan trọng [10].
Hai mươi năm sau phát hiện của Langerhans, năm 1889, Oscar
Minkowski, một nhà nộ
i khoa người Đức đã phối hợp với Joseph von Mering
[12], cắt bỏ tuỵ của một con chó khoẻ mạnh để xem xét ảnh hưởng của nó tới
tiêu hoá. Sau vài ngày mất tuỵ, người nuôi chó nhận thấy, có nhiều ruồi đến bâu
vào nước tiểu của con chó này. Khi thử nước tiểu của nó, người ta thấy có
đường. Đó là phát hiện đầu tiên về mối liên quan giữa tuỵ và đái tháo đường.
Đến năm 1901, sau nhiều bướ
c nghiên cứu lớn, Eugene Opie đã chứng
minh mối liên quan rõ ràng giữa đảo Langerhans với ĐTĐ: “bệnh ĐTĐ là do
phá huỷ đảo Langerhans và chỉ xảy ra khi chúng bị phá huỷ hoàn toàn hoặc một
phần”.
Trong 2 thập kỷ tiếp theo, một số nghiên cứu đã đi theo hướng xử lý tuỵ
động vật để thu lấy chất điều trị ĐTĐ (Zuelzer 1906, Scott 1912, Kleiner 1919).
Năm 1921, Nicolae Paulescu [13], Giáo sư trường đại h
ọc Y Dược Bucharest
(Hungary), là người đầu tiên công bố đã tách được insulin và ông đã gọi nó là
pancrein.
Năm 1920, Frederic Banting (Canada) [14] thấy rằng, các chất tiết
(secretions) của tuỵ đã phá huỷ (các?) chất tiết [secretion (s?)] của đảo
Langerhans; vì vậy, không thể chiết xuất chất này từ tuỵ và cho rằng, chất tiết
“nội tuỵ” đã điều hoà glucose máu nên nó có thể đóng vai trò là chìa khoá trong
điều trị ĐTĐ.
Năm 1921, cũng vẫn là Banting, khi phẫu thuật, ông nhận thấy rằng, có

thể làm tắc một số độ
ng mạch của tuỵ để làm teo phần lớn nhu mô tuỵ nhưng
không ảnh hưởng tới các đảo Langerhans. Ông nghĩ rằng, có thể làm teo như
thế để thu lấy chất tiết tương đối thuần khiết từ các đảo này. Ông đã thực hiện
thành công ý tưởng này tại trường đại học Toronto (Canada) và sau này, ông đã
được nhận giải thưởng Nobel về công trình này [15]. Khi các tế bào “tiêu hoá”
của tuỵ bị phá huỷ, hàng nghìn đảo Langerhans vẫn còn l
ại, nhóm nghiên cứu
đã thu được chất tiết ra từ các đảo (islet) này, họ gọi tên là isletin (chất mà hiện
nay gọi là insulin). Dùng isletin tiêm cho những con chó đã bị cắt tuỵ, nhóm
nghiên cứu đã giữ được cho chúng sống trong vài tháng; trong khi đó, những
con chó không được tiêm thì chết rất nhanh.

9
Khi động vật bị lấy mất tuỵ, nồng độ glucose máu tăng cao, một hình ảnh
giống như bệnh đái tháo đường. Nhóm nghiên cứu này, về sau, phối hợp với
James Collip [14], nhà hoá sinh, đã thành công trong tinh chế isletin và tiến
hành thử lâm sàng.
Ngày 11 tháng 01 năm 1922, bệnh nhân (Leonard Thompson, 14 tuổi) đái
tháo đường đầu tiên, nằm ở bệnh viện đa khoa Toronto, đã được tiêm insulin.
Tuy nhiên, insulin này chưa được tinh chế tốt nên Thompson đã bị dị ứng n
ặng
và việc tiêm bị tạm dừng. Mười hai ngày tiếp theo, Collip đã làm việc suốt ngày
đêm để cải tiến quy trình tinh sạch insulin và đã thu được insulin với chất lượng
cao hơn. Đến ngày 23/01/1922, liều thứ 2 đã được tinh chế xong và lại được
dùng cho bệnh nhân. Kết quả thử lần này thật hoàn hảo, hầu như không có tác
dụng phụ nào và nó đã làm hết hoàn toàn đường niệu của bệnh nhân.
Năm 1922, Best [14] đã c
ố gắng cải tiến các kỹ thuật của mình để có thể
thu được một lượng lớn hơn insulin, đáp ứng cho nhu cầu điều trị cấp bách của

nhiều bệnh nhân lúc đó; tuy nhiên, các chế phẩm này đều không đủ độ tinh
sạch. Hãng dược phẩm Eli Lilly đã mời Best cộng tác và sau đó họ đã vượt qua
được nhiều khó khăn lớn để có thể sản xuất một l
ượng lớn insulin tinh khiết.
Ngay sau đó, insulin này được thương mại hoá.
Trước khi có các nghiên cứu y học, trên thị trường chỉ có các insulin
nguồn gốc từ động vật; vào những năm 50, người ta đã biết được trình tự acid
amin của insulin [16] và insulin “người” đã được tập đoàn Genentech sản xuất
bằng công nghệ gen, với E. coli, lần đầu tiên trên thế giới năm 1977 [17].
Cấu trúc bậc 1 của insulin được F. Sanger [16], nhà sinh học phân tử

người Anh, xác định năm 1955. Đây là protein đầu tiên trong y học được xác
định chính xác trình tự các acid amin. Năm 1958, ông được nhận giải Nobel
Hoá học cho công trình này [18]. Năm 1969, Hodgkin [19] đã xác định cấu trúc
bậc 3 của insulin bằng nhiễu xạ tia X, dẫn tới phát triển các kỹ thuật ghi hình
tinh thể. Bà được giải Nobel Hoá học cho công này vào năm 1969. Năm 1977,
Yalow [18] được nhận giải Nobel Y học về phát triển kỹ thuật miễn dịch phóng
xạ dùng cho insulin.
Cấu trúc phân tử
(Hình 1)
Phân tử insulin người gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A gồm 21 amino
acid và chuỗi B gồm 30 amino acid [2, 20]. Hai cầu nối disulfur (A7 - B7, A20
- B19) như hai sợi dây “buộc” chặt hai chuỗi với nhau. Trong chuỗi A còn có
một cầu nối disulfur giữa gốc A6 và A11 đảm bảo cho phân tử ổn định hình
dạng trong không gian. Một điều đặc biệt là, cả 3 cầu nối này đều bất biến ở tất
cả các dạng insulin của động vật (Sanger et all., 1988) [21]. Ho
ạt tính của
insulin sẽ mất khi gẫy các cầu nối này [22], [2, 23, 24].

10

Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin người
Phân tử insulin gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A, 21 amino acid và chuỗi B, 30 amino
acid. Hai cầu disulfur (A7 - B7, A20 - B19) là các liên kết đồng hóa trị; cầu thứ 3 nằm trong
chuỗi A (6-11)


Quá trình hình thành insulin trong cơ thể (Sơ đồ 1)
Insulin được tạo ra từ tiền thân của nó là proinsulin. Phân tử insulin hoạt
động được tạo thành từ protein tiền thân này bằng quá trình thủy phân protein
(proteolytic) dưới tác dụng của các enzym trypsin của tuyến tụy
(endopeptidases PC1, PC2, PC3) [25]. Cuối cùng, insulin được đóng gói và
chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để
giải phóng. Quá trình này gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thủy phân
để cắt đoạn peptide tín hiệu, gồm 23 axit amin ở
đầu amin tự do của pre-proinsulin để tạo thành phân tử proinsulin chứa ba liên
kết cầu disulphur.
Giai đoạn 2: Thủy phân tiếp để cắt rời đoạn peptid C (35 acid amin) để tạo
thành phân tử insulin hoàn thiện (có hoạt tính), bao gồm 51 acid amin, thực
hiện chức năng của nó trong cơ thể [26].
Có thể tóm tắt quá trình hình thành insulin trong cơ thể theo sơ đồ dưới
đây:

11



Sơ đồ 1: Các bước hình thành insulin

trong cơ thể [27]
1. Dịch mã và chuyển vị trí: gen pre-proinsulin
được dịch. Sản phẩm của gen này là một
protein chứa chuỗi B, C và A và một
peptide tự tín hiệu.
2. Gấp nếp (folding), oxy hoá và cắt peptid tín
hiệu.
3. Chuyển từ lưới nội bào (ER) qua bộ Golgi,
đóng gói.
4. Cắt đoạn peptid C, còn lại hai đoạn B và A.
5. Hoàn thiện phân tử insulin chín.
Cơ chế tác động của insulin (Sơ đồ 2)
Insulin tác dụng bằng cách gắn vào receptor đặc hiệu nằm trên màng tế
bào của hầu hết các mô. Không chỉ các mô đích chịu tác dụng của insulin là
gan, cơ, và mô mỡ mà còn ở các mô khác như tế bào máu, tế bào não và tế bào
sinh dục [24], [2, 22]. Receptor insulin là một glycoprotein xuyên màng gồm 2
tiểu đơn vị α nằm hoàn toàn ở màng ngoài tế bào, chứa vùng gắn insulin và 2
tiểu đơn vị là β, một protein xuyên màng có hoạt tính tyroxin kinase. Bố
n đơn
vị này gắn đối xứng với nhau bằng cầu nối disulfur.
Khi insulin gắn với tiểu đơn vị α, nó sẽ kích thích hoạt tính tyroxin
kinase của phần β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng, kết quả tạo ra một
loạt các phản ứng phosphoryl hoá trong tế bào đại diện cho chất truyền tin thứ 2
của insulin, dẫn đến thể hiện một loạt các tác dụng trên chuyể
n hoá glucid,
lipid, protid bằng cách hoạt hoá hệ thống vận chuyển glucose và ion, tăng vận
chuyển glucose vào tế bào, hoạt hoá hoặc bất hoạt enzym, tác động trên tổng
hợp protein và sao mã gen [2, 23], [28].

12

Sơ đồ 2: Tác động của insulin tới sự hấp thu glucose
Insulin gắn vào receptor của nó (1) rồi hoạt hoá nhiều hệ protein (2). Những protein này
gồm chuyển vị trí của Glut-4 transporter đến màng sinh chất và thu nhận glucose (3), tổng
hợp glycogen (4), phân huỷ glycogen (5) và tổng hợp acid béo (6)[29]
Insulin đóng vai trò quan trọng trong toàn bộ quá trình chuyển hoá
carbonhydrat, lipid, protid, sinh ra năng lượng duy trì quá trình hoạt động và
phát triển của cơ thể [2].
Trên chuyển hoá glucose: Tác dụng hạ đường huyết do làm tăng tính
thấm của màng tế bào đối với glucose, làm glucose vận chuyển vào trong tế bào
dễ dàng [2, 28], thúc đẩy tổng hợp glycogen ở gan, do hoạt hoá hexokinase và
glycogen synthase, đồng thời ức chế huỷ glycogen ở gan do ức chế
phosphorylase [2, 22], ức chế tân tạo glucose ở gan, do đó làm giảm nguyên
liệu tạo glucose [2, 8], tăng dự trữ và sử dụng glucose ở gan, cơ và mô mỡ [2,
22].
Trên chuyển hoá lipid: Làm giảm acid béo tự do trong vòng tuần hoàn và
thúc đẩy dự trữ tryglycerid ở mô mỡ [2, 23].
Trên chuyển hoá protid: Làm tăng tổng hợp protein do tăng thu nhận acid
amin vào tế bào và kích thích hoạt tính của ribosome, ức chế quá trình oxi hoá
acid amin, ức chế sự giáng hoá protein ở cơ và các mô khác, do đó giảm hầu hết
các acid amin trong máu. Đồng thời ức chế tân tạo glucose từ acid amin [22],
[23].

Trên chuyển hoá năng lượng: Insulin đóng vai trò quan trọng trong việc
duy trì và điều hoà chuyển hoá năng lượng [28].


13
Công nghệ sản xuất Insulin tái tổ hợp
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sản xuất insulin tái tổ hợp, nhưng tất cả đều

dựa trên những nguyên tắc chung giống nhau. Không có phương pháp nào trực
tiếp sản xuất ra insulin hoàn chỉnh mà đều gián tiếp qua một số phương pháp.
Có hai phương pháp tiếp cận chính [30]:
Phương pháp thứ nhất: Tạo ra Proinsulin, gồm 3 chuỗi peptide (A, B và C), sau
đó cắt chuỗi C để tạo thành insulin hoàn ch
ỉnh (gồm chuỗi A và B). Sản xuất
theo con đường proinsulin chỉ cần lên men và tách chiết. Các bước chính được
tóm tắt như sau:
Bước 1: Tách gen mã hoá cho proinsulin.
Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 11. Có thể dùng cDNA từ ngân hàng
gen hoặc từ tuyến tuỵ. Nếu tách từ tuỵ thì đầu tiên phải tách mRNA, sau đó
dùng RT-PCR để thu lấy cDNA. Do mRNA người thường có đuôi poly A nên
sử dụng chuỗi poly T để bắt cặp với đuôi poly A đó để thu mRNA rồ
i tiến hành
cắt cầu A-T để thu được mRNA thuần, dùng cho RT-PCR.
Bước 2: Thiết kế plasmid tái tổ hợp.
Cắt gen proinsulin và plasmid bằng enzyme hạn chế rồi nối chúng lại
bằng ADN ligase của phage T4. Trong thành phần của vector biểu hiện, phải có
promotor mạnh để giúp cho gen có thể biểu hiện được trong vi khuẩn. Mặt
khác, cần phải thiết kế trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển
insulin ra ngoài tế bào chất.
Bước 3: Biến n
ạp plasmid vào E. coli.
Dùng kỹ thuật xung điện hoặc Ca
++
. Quá trình chọn lọc trực tiếp khuẩn
lạc xanh-trắng trên đĩa môi trường nuôi cấy. Sau đó, cần kiểm tra trình tự đoạn
nucleotid đã được cài vào hay chưa bằng giải trình tự gen rồi so sánh với trình
tự gốc.
Bước 4: Lên men.

Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục trong các điều kiện tối ưu nhằm
kích thích vi khuẩn sinh sản tối đa để thu được nhiều sinh khối nhấ
t.
Bước 5: Tiền tinh sạch.
Sau lên men, tiến hành tách tế bào và khử trùng bằng nhiệt. Dùng
lysozyme để phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng một hỗn hợp chất tảy rửa để tách
lớp màng lipid. Proinsulin được tách ra khỏi các mảnh vỡ tế bào bằng phương
pháp ly tâm và lọc.
Bước 6: Hoạt hoá.

14
Hệ thống E. coli có khả năng biểu hiện insulin nhưng không có khả năng
hoạt hoá in vivo. Do đó phải thực hiện quá trình hoạt hoá insulin bằng cách xử
lý với các dung dịch đệm, giúp nó đạt được cấu trúc bậc 4; sau đó, dùng
enzyme đặc hiệu, trypsin, để phân cắt proinsulin. Khi đó, sản phẩm thu được
mới có hoạt tính cần thiết.
Bước 7: Tinh sạch insulin.
Thường dùng phương pháp sắc ký, tách, các kỹ thuật bộ
c lộ sự khác nhau
về điện tích, kích thước và ái lực đối với nước của phân tử sắc ký như sắc ký
trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lọc gen. Quá trình sắc ký được
giám sát bằng cách phân tích các protein đặc hiệu nhờ ELISA. Độ tinh sạch của
insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất nhờ
những phòng thí nghiệm chuyên nghiệp. Cuối cùng, insulin được tinh thể hoá.
Phương pháp thứ 2:
Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Phương pháp này tránh được phải sản xuất các enzyme đặc hiệu cần thiết
để biến proinsulin thành insulin. Nhà sản xuất chỉ cần 2 gen nhỏ: một gen cho
chuỗi A, một gen cho chuỗi B. Do đã biết trình tự chính xác của 2 gen này nên
có thể tổng hợp được chúng. Mỗi phân tử ADN sau đó được chèn vào các

plasmid. Các bước tiếp theo của quá trình sản xuất chuỗi A và chuỗi B tương tự
như sản xu
ất proinsulin. Tuy nhiên, ở giai đoạn cuối, hai chuỗi A và B được
trộn với nhau và nối bằng các cầu disulffur qua phản ứng oxy hoá-khử nhờ một
chất oxy hoá.
Ngoài E. coli, ngày nay, người ta còn dùng nấm men, Saccharomyces
cerevisiae, trong sản xuất insulin. Phương pháp này có ưu điểm là nấm men tạo
ra các phân tử insulin gần như hoàn chỉnh cấu trúc không gian. Điều đó làm
giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch làm giả
m giá
thành sản phẩm.
Các mốc chính trong lịch sử sản xuất insulin:
- Năm 1922, Fnedrick Banting và Chartes Best ở Toronto, Canada chiết
xuất được insulin từ tụy bò và đã sử dụng nó trong điều trị, mở ra triển vọng to
lớn cho ĐTĐ [31], [32], [33].
- Năm 1936, Hagedorn, bác sĩ người Đan Mạch đã kết hợp insulin và
protein tạo nên Protamine có tác dụng kéo dài và sau đó kết hợp với kẽm tạo ra
protamine kẽm insulin (PZI) có tác dụng kéo dài 24 - 72h [31], [32].
- Năm 1946, Hagedorn đã sản xuất được Isophan (NPH) có tác dụng trung
gian, hiệu quả điều trị ĐTĐ rất tốt [31].

15
- Trong những năm 1963-1965, insulin được tổng hợp nhân tạo bằng
phương pháp hoá học, nhưng giá thành rất cao, không phù hợp trong chữa bệnh
[2].
- Năm 1969, Clowfoot Hodgkin đã xác định được cấu trúc bậc 3 của
insulin.
- Năm 1978, Herbert Boyer (Genentech) sản xuất thành công insulin tái tổ
hợp trong vi khuẩn E. coli [33].
- Năm 1982, Eli Lilly đã dùng phương pháp hoá học để biến đổi proinsulin

- tiền insulin, thành insulin có hoạt tính. Insulin người, sản xuất bằng k
ỹ thuật
ADN tái tổ hợp, lần đầu tiên trên thế giới, đã được đưa ra thị trường với tên
thương phẩm là Humulin [33].
- Năm 1987, tổng hợp insulin thành công trong tế bào nấm men [34].
Tình hình sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước:
Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổ hợp
nhưng chỉ dừng lại ở mức độ tiếp cận như
trường đại học Y Hà Nội [35, 36],
đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [37-41]. Trung tâm Công nghệ Sinh học
thành phố Hồ Chí Minh đã mô hình hóa thành công một quy trình sản xuất
insulin và đang thử nghiệm sản phẩm trên động vật [38]. Chưa có cơ sở nào
thực sự sản xuất được insulin, ngay cả ở quy mô phòng thí nghiệm.
Tình hình sản xuất insulin trên thế giới:
Từ năm 1977, Eli Lilly đã dùng phương pháp hoá học để biến đổi tiền
insulin thành insulin có hoạt tính và loại insulin này đã trở thành thuốc sản xuất
bằng công nghệ gen đầu tiên được cấp phép dùng cho người [33]. Đến những
năm 90, quy trình này được cải tiến nhờ thay E. coli bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae, loại nấm này có khả năng biến đổi sản phẩm sau quá
trình dịch mã, nhờ vậy, quá trình sản xuất insulin đơn giản hơn [2].
Nhiều nước đã sản xuất insulin tái tổ hợp, như M
ỹ, Đức, Pháp. Tuy vậy,
tất cả các nước đều có bản quyền riêng mà ở nước ta, chưa thấy có tổ chức nào
đứng ra mua một trong các bản quyền này [2].

Về công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp:
Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều
dựa trên các chủng nấm men hoặc vi khuẩn như đã nói ở trên, kết hợp với các
kỹ thuậ
t gen để sản xuất insulin người. Người ta nuôi cấy các chủng này trên

quy mô lớn, trong những bồn lên men bằng thép. Sau đó, insulin được tách ra
và tinh sạch đến sản phẩm cuối cùng. Đứng đầu trong lĩnh vực này là công ty

16
Bio-Technology General. Họ đã sử dụng một dạng protein dung hợp (fusion
protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu
hiện trong tế bào E. coli làm tăng hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và
tăng hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nối. Sau đó, proinsulin được
chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B. Tiếp đó là
công ty Hoechst, họ dùng phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm biểu hiện một
dạng dẫn xuất mới c
ủa insulin hoặc biểu hiện pre-proinsulin trong E. coli; tạo
các cầu nối disulfur in vitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc
clostripain/carboxypeptidase B; cuối cùng tạo ra insulin. Tập đoàn Novo
Nordisk cũng dùng phương pháp này để biểu hiện mini-proinsulin trong nấm
men, sau đó xử lý mini-proinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin [2].
Tập đoàn Eli Lilly thì dùng phương pháp sản xuất theo kiểu “hai chuỗi” riêng
biệt, sử dụng Escherichia coli, thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro để
tạo cầu n
ối disulfur. Hiện nay, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến
hơn, biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương
pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi
A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin [2].
Gần đây nhất, người ta đã đưa thành công gen insulin vào thực
vật và sản xuất được insulin từ thực vật, đặc biệt là từ cây rum
(safflower). Hướng sản xuất m
ới này hứa hẹn giảm được giá thành
insulin và việc dùng insulin sẽ thuận lợi hơn, tự nhiên hơn do việc dùng thực
phẩm trong bữa ăn hàng ngày mà lại có chứa insulin [2, 42, 43].

Nhu cầu insulin hiện nay
Trước khi khám phá ra hoạt động của insulin, bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ
không có cơ hội có một cuộc sống khoẻ mạnh, đặc biệt là bệnh nhân ĐTĐ typ I.
Ngày nay, số người sử dụng insulin sản xu
ất bằng kỹ thuật di truyền ngày một
tăng. Năm 1996, ở Mỹ chi phí cho điều trị ĐTĐ là 90 tỷ USD [1, 2]. Theo hãng
Eli Lilly, năm 2001, 95% số bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới đã sử dụng insulin
người.
Các nước phát triển đã dùng insulin tái tổ hợp thay cho insulin có nguồn
gốc động vật. Hầu hết các công ty lớn đã ngừng hẳn việc sản xuất insulin động
vật do nhữ
ng nhược điểm đáng kể của nó so với insulin tái tổ hợp.
Năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh đái tháo đường ước tính
khoảng 4.000 đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu cầu về
insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp
insulin cho điều trị bệnh đái tháo đường đang thiếu hụt. Từ những thập niên
1920 cho đến những nă
m đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách

17
tách chiết từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có
sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi
A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó
gây ra những tác dụng không mong muốn (dị ứng) khi sử dụng insulin dạng
này. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều
khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo
và bò đã
được phát triển bằng cách sử dụng phản ứng chuyển peptide
(transpeptidation). Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên
tại Công ty Genentech (Mỹ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm

1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công
nghệ sinh học vào dược phẩm thành công.
Insulin trên thị trường hiện nay:
Insulin đang được bán trên thị trường dưới d
ạng thuốc tiêm, có 3 loại
chính, phân theo thời gian tác động của chúng:
1. Loại tác dụng nhanh: có tác dụng sau tiêm khoảng 5 phút và kéo dài 6-8
giờ. Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết tinh và được hoà tan dưới
dạng dung dịch trong suốt.
2. Loại tác dụng trung bình: có tác dụng sau khoảng 2 giờ tiêm và kéo dài
khoảng 18 giờ. Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua
kẽm hoặc protamine để hình thành một phứ
c hợp protein với một tỷ lệ insulin
tự do và insulin phức hợp nhất định để tạo ra một insulin có hoạt tính nằm giữa
insulin nhanh và insulin chậm.
3. Loại tác dụng chậm: có tác dụng sau khoảng 7 giờ và kéo dài khoảng 36
giờ. Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua kẽm hoặc
protamine để hình thành một phức hợp protein bền, theo đó insulin được giải
phóng chậm.

18
Pre-proinsulin và Proinsulin
Cấu trúc phân tử của pre-proinsulin và proinsulin (Hình 2):


Hình 2. Sơ đồ cấu tạo và trình tự amino acid của proinsulin
Proinsulin được hình thành từ pre-proinsulin. Pre-proinsulin là một chuỗi
peptid dài có 109 amino acid, gồm 4 chuỗi peptid ngắn: chuỗi peptid tín hiệu
(signal peptide), chuỗi peptid B, C và A. Ở tế bào chất, pre-proinsulin bị thuỷ
phân, tách ra peptid tín hiệu ở đầu N tận, gồm 23 acid amin. Phần còn lại là
proinsulin có cấu tạo chuỗi polypeptid đơn gồm 86 acid amin.
Phân tử proinsulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoảng hơn 6000 dalton,
được cấu tạo bởi 3 chuỗ
i peptid A, B, và C. Chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi
B gồm 30 acid amin liên kết với nhau bằng hai cầu nối disulphur và chuỗi
peptid C gồm 35 acid amin, còn gọi là chuỗi peptid nối. Việc định lượng peptid
C cho biết lượng insulin trong máu là nội sinh hay ngoại sinh, cũng có tác dụng
phân biệt giữa ĐTĐ týp I và ĐTĐ týp II [23].
Gen mã hoá proinsulin:
Nghiên cứu bộ gen người cho thấy, gen mã hoá proinsulin cũng như
insulin nằm ở nhiễm sắc thể số 11, trên cánh ngắn (11p) gắn gen IGF và gen β -
globin. Gen proinsulin đã được tách, t
ạo dòng và giải trình tự vào những năm
70 của thế kỷ XX, gồm 2 vùng: vùng mang mã di truyền (coding region) và
vùng không mang mã di truyền (no coding region).
Vùng mang mã di truyền có kích thước 1430 bp, có 2 intron, intron thứ
nhất nằm giữa đoạn trình tự mã hoá chuỗi peptid tín hiệu và chuỗi peptid B;
intron thứ 2 nằm giữa đoạn gen mang mã di truyền mã hoá chuỗi peptid C.

19

Đoạn gen mang mã di truyền mã hoá 4 chuỗi peptid trong cấu trúc của
phân tử pre-proinsulin: chuỗi peptid tín hiệu, chuỗi peptid B, chuỗi peptid C và
chuỗi peptid A.
Vùng không mang mã di truyền chia làm 3 cụm gen ký hiệu class I, class
II và class III. Trong vùng không mang mã, có các trình tự điều hoà, trình tự
tăng cường hoạt động gen (exon splicing enhance) và các trình tự lặp lại
(repeats) [34].
Quá trình tổng hợp trong cơ thể:
Khi nồng độ glucose máu tăng, ngay lập tức ARN thông tin của insulin
được dịch mã, tạo nên một chuỗi đơn ban đầu gọi là preproinsulin trong t
ụy.
Pre-proinsulin bao gồm một trình tự tín hiệu đầu amin, cần thiết để tiền
chất hormon này đi qua được màng lưới nội chất tham gia vào quá trình sau
dịch mã. Quá trình sau dịch mã loại đi những phần không cần thiết cho hormon
có hoạt tính sinh học. Khi đã vào màng lưới nội chất thì đoạn trình tự tín hiệu
của pre-proinsulin không còn cần thiết nữa. Bằng việc thuỷ phân loại bỏ đi đoạn
peptid tín hiệu củ
a nó trong suốt quá trình đi vào các tuyến nội tiết, proinsulin
được tạo ra [44, 45].
Một số nghiên cứu về proinsulin trên thế giới:
Proinsulin đã được nghiên cứu nhiều trước đây, từ cấu trúc phân tử đến
quá trình chuyển hoá và sự biểu hiện của nó.
Năm 1967, Steiner và Chance phát hiện ra cấu trúc phân tử proinsulin.
Năm 1981, Peter Gens và Geore Choury đã biểu hiện pre-proinsulin chuột bằng
tế bào thận khỉ [46], [47]. Đến năm 1983, Orgad Lans đã biểu hiện gen
proinsulin ngườ
i bằng hệ thống tế bào của động vật có vú. Năm 1992,
Masahiko đã nghiên cứu biểu hiện proinsulin có biến đổi trên dòng tế bào COS
- 7 [48].
Gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu với gen proinsulin nguyên bản hay

đã được biến đổi nhằm tạo insulin dễ dàng hơn, như nghiên cứu của Chol Soo
Shin Seung năm 1997, G. Chang năm 1998 tạo mini-proinsulin [49]. Năm
2003, C.W Hayo đã biểu hiện proinsulin có các điểm cắt đặc hiệu cho việc tạo
insulin thu
ận lợi hơn. Cũng trong năm 2003, proinsulin người đã được Zhi -
Song Qiao biểu hiện và nghiên cứu cả quá trình sắp xếp lại cấu trúc (refolding)
sau biểu hiện [50].
Một số nghiên cứu proinsulin ở Việt Nam:
Một nghiên cứu được công bố của Trường Đại học Khoa học tự nhiên,
Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, với sự kết hợp của công ty

20
Ajinomoto. Đó là nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người
tái tổ hợp trong E. coli. Các tác giả đã biểu hiện thành công mini-proinsulin,
nhưng chưa nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của protein này sau biểu
hiện và về các điều kiện tối ưu trong quá trình biểu hiện [37, 38, 40, 41]. Từ
năm 2007, trường đại học Y Hà Nội cũng đã nghiên cứu và biểu hiện thành
công proinsulin [35, 36].

21
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chiến lược nghiên cứu:
Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra được chuỗi A và chuỗi B để làm
nguyên liệu tạo ra phân tử insulin hoàn chỉnh. Để đạt mục tiêu đó, đề tài đã tiếp
cận bằng 2 cách: tạo proinsulin (gồm chuỗi A, B và C nối với nhau) và tạo riêng
biệt chuỗi A và chuỗi B:
1. Đối với Proinsulin
1.1. Vật liệu
- cDNA Proinsulin tuyến tuỵ người c

ủa hãng Ambion, Mỹ (Catalog
#: AM3322, Human pancreas cDNA, Ambion Inc, USA).
- Mồi (5’-3’):
Pins-Fw: cgc gga tcc atg ttt gtg aac caa
Pins-Rv: ccg ctc gag gtt gca gta att ctc
- Vector biểu hiện: pET 28a (+) (Novagen, pET-28a ADN, Catalog #:
69864-3).
pET28a (+) có kích thước 5369 bp, có điểm khởi đầu phiên mã của
pBR322, gen kháng kanamicin, chứa promoter lac được cảm ứng bằng IPTG
(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) khi biểu hiện (Sơ đồ 3).


Sơ đồ 3: Sơ đồ cấu tạo pET28a(+)

22
Vùng đa tách dòng (multi-cloning site, mũi tên đậm ngược chiều kim đồng hồ) chứa các vị trí
cắt của BamH I và Xho I.

- Chủng tế bào E. coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thi
λ
-
recA1
gyrA96
∆
lacU169 (
Φ
80 lacZ∆M15)] (Catalog #: DA-10, MCLAB) được dùng
làm chủng để nhân bản plasmid. Chủng E. coli BL21 (DE3) [F -, ompT, hsdS
(r
B

- m
B
), gal (DE3)] được dùng để biểu hiện proinsulin.
- Enzyme giới hạn được lựa chọn theo thiết kế mồi và vector là Bam HI
và Xho I của Invitrogen.

1. 2. Phương pháp
1.2.1. Khuếch đại gen proinsulin
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi Pins trên hệ thống GeneAmp
PCR System 9700 (Applied Biosystem) với công thức cho 25 µl phản ứng là:
0,4 µM cho mỗi mồi, 5 µl đệm 5x, 1 µM dNTPs, 1 µl Taq ADN polymease, 1 µl
cDNA và thêm nước đủ đến 25 µl. Điều kiện cho phản ứng: 95
o
C trong 5 phút;
35 chu kỳ: 95
o
C trong 30 giây, 52
o
C trong 30 giây, 72
o
C trong 60 giây

và một
chu kỳ: 72
o
C/7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%; đồng
thời thu lại sản phẩm, làm sạch sản phẩm bằng kít “PCR purification kit“
(QIAGEN) để dùng cho nhân dòng.
1.2.2. Tạo vector mang gen proinsulin
- Xử lý vector pET 28a(+) và sản phẩm PCR tinh sạch với enzym giới

hạn BamHI và XhoI.
- Điện di sản phẩm phản ứng trên gel agarose 1,5%
- Xử lý băng sản phẩm (lý thuyết): cắt băng sản phẩm trên gel và tinh
sạch bằng bộ kít Gel extraction kit của QIAGEN. S
ản phẩm thu được sau tinh
sạch chính là sản phẩm của sự nối ghép tạo giữa pET28a với gen proinsulin tại
các vị trí cắt của BamHI và XhoI.
1.2.3. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp
Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E. coli DH5a bằng phương
pháp sốc nhiệt (42
o
C trong 42 giây). E. coli mang plasmid tái tổ hợp được sàng
lọc bằng cách cấy trên môi trường thạch có kanamicin 50 µg/ml. Tách chiết
plasmid này bằng phương pháp Birnboin [51]. Plasmid thu được, được ký hiệu
là pET-PINS.
1.2.4. Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen

23
Những khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có kanamicin 50 µg/ml là
những khuẩn lạc có mang plasmid, chọn vài khuẩn lạc để kiểm tra bằng PCR
với chu trình như trên, điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% và thang ADN
100 bp để kiểm tra sản phẩm, PCR cho kết quả dương tính với proinsulin thì
khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp. Khi một khuẩn lạc nào đó được xác
định là có mang plasmid tái tổ hợp mong đợi (mang gen proinsulin) thì cấ
y
chuyển chúng sang môi trường LB để thu sinh khối, tách plasmid bằng
QIAprepSpin Miniprep Kit (QIAGEN). Plasmid tái tổ hợp được giải trình tự
theo phương pháp Sanger [21] với BigDye terminator v3.1 của Applied
Biosystems. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự proinsulin chuẩn
bằng phần mềm BLAST.

1.2.5. Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS -PAGE
Tương tự như tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp, plasmid
tái tổ hợp cũng được biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3) (42
o
C/42
giây), sau đó nuôi cấy sàng lọc kiểm tra và được nuôi cấy trong môi trường LB,
có bổ xung kanamicin (50 µg/ml), nuôi ở 37
o
C, lắc 200 vòng /phút. Khi mật độ
tế bào A
600
đạt 0,8 thì bổ sung chất cảm ứng, IPTG (Isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside), nồng độ 1 mM nhằm cảm ứng biểu hiện proinsulin.
Thu sinh khối và phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong đệm PBS, điện
di trên gel polyacrylamid 15% có SDS (SDS-PAGE) (Laemmli 1970), có thang
chuẩn protein, thu hình ảnh và phân tích kết quả.
1.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực và nhận dạng bằng
Western blot
Sắc ký ái lực được thực hiện trên cột 1,0 x 120 cm (Amersham
Biosciences) với ProPond Resin, cân bằng cột với 250 mM NaH
2
PO
4
, pH 8,0.
Mẫu được hoà tan trong đệm cân bằng và cho qua cột. Thôi (elute) cột bằng
Imidazole 3M, pH 6,0. Thể tích mỗi phân đoạn là 2 ml, kết quả được kiểm tra
bằng OD
280
và điện di trên SDS-PAGE để phân tích kết qu¶. Sau đó, sản phẩm
được nhận dạng bằng Western blot.

2. Đối với insulin: chuỗi A, B
Chiến lược (Sơ đồ 4)


24

Sơ đồ 4: Chiến lược sản xuất insulin theo hướng “hai chuỗi”



2.1. Vật liệu
- Vector tái tổ hợp pET14bInsA chứa chuỗi A và pET14bInsB chứa
chuỗi B được thiết kế và xác định ở trường đại học tổng hợp Osaka, Nhật Bản
(Sơ đồ 5).

25

Sơ đồ 5: Sơ đồ cấu tạo vector pET14b
Vector này chứa các vị trí cắt đặc hiệu của NcoI và BamHI
- Vector pET32c (Novagen) được cài chuỗi A, B lấy từ pET14bIns tại
Viện Công nghệ sinh học (Sơ đồ 6):

Sơ đồ 6: Sơ đồ cấu tạo vector pET32
- Chủng tế bào E. coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thi
λ
-
recA1
gyrA96
∆

lacU169 (
Φ
80 lacZ∆M15)] (Catalog #: DA-10, MCLAB) được dùng
làm chủng để nhân bản plasmid. Chủng E. coli BL21 (DE3) [F -, ompT, hsdS
(r
B
- m
B
), gal (DE3)] được dùng để biểu hiện insulin.