Nghiên cứu chiết xuất dầu dừa tinh khiết bằng phương pháp enzym

51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH - HÓA HỌC VÀ sự HÌNH THÀNH CHAT

BÉO TRONG CƠM DỪA
3.1.1.
KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SỈNH HÓA HỌC CỦA QUẢ DỪA.

* Quả chín khô
n: số mẫu, Min: trị số nhỏ nhất, Max: trị số lớn nhất, STDEV: Độ lệch

chuẩn, cv%: Hệ số biến sai

Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ % các hợp phần của quả dừa


ũ2

Bảng 3.1: Trọng lượng quả và các bộ phận của quá *
Quả
Gáo
Xơ

Nước

Cơm

dừa

dừa

tươi
n

100

100

100

100

100.

Trọng lượng (g);
1.120

- Trung bình

STDEV

1.160

280

1620

565

235

153,8

41,7

14,64

18,84

280

460

490

410

410
88

32,2

65,81

19,02

Ồo

cv%

2.500

249,67

140

160

k

- Max

480

'Õ—4

- Min

Theo kết quả khảo sát (bảng 3.1, biểu đồ 3.1), quả đừa Ta xanh có trọng lượng trung
bình là 1.620g, trong đó phần vỏ xơ nặng 565g, gáo 235g, nước dừa 410g và cơm dừa tươi
410g. Tỉ lệ cơm dừa chiếm khoảng 25% trọng lượng quả, thấp hơn đa sô" các giông dừa lai
tạo, đặc biệt là giống dừa cao của An Độ (33%) [106].
về thành phần câu tạo của cơm dừa, kết quả phân tích (bảng 3.2) cho thây ngoài
thành phần chủ yếu là dầu (34,19 ± 0,72%), trong cơm dừa còn có những chất có giá trị
dinh dưỡng khác là protein (4,19 ± 0,18%) và đường (đường tổng sô" 3,80 ± 0,17%).
Thành phần polysaccharide không tan được xác định theo thực nghiệm là 10,71+0,69%.


ũ2

Bảng 3.2: Kết quả phân tích thành phẩn hóa học của cơm
dữa
Thành phần

% cơm dừa tươi

Nước

46,06 ± 2,46

Dầu

34,19 ±0,72

Protein

4,19 ± 0,18

Đường tổng số

3,80 ±0,17

Polysaccharide

10,71 ±0,69

Qua khảo sát những thay đổi thành phần cơm dừa theo tuổi quả (bảng 3.3), có thể xác
định tuổi ưưởng thành của quả dừa là 1 ỉ tháng vì ở giai đọ an này hàm lượng chất khô của
cơm dừa đạt mức cao nhất (53,94 ± 2,46%). Sự tổng hợp protein của cơm dừa giảm dần
theo tháng tuổi, nhưng đối với dầu thì ngược lại. Hàm lượng dầu trong cơm dừa tăng đần
đến mức cao nhất (63,38 ± 1,34%) vào lúc quả dừa đạt 11 tháng; do đó trong khai thác dầu
dừa, cần thu hái quả ở giai đoạn thích hợp nhất là 11 tháng tuổi.


53

Về màu sắc vỏ quả, kết quả khảo sát (hình 3.1) cho thấy quả dừa có vỏ màu xanh lá
cây ở giai đoạn còn non đến 8, 9 tháng tuổi. Được 10 tháng trên vỏ quả bắt đầu xuất hiện
đốm nâu. vết nâu loang đần và phủ gần kín quả ở giai đoan quả ỉ 1 tháng, Đến 12 tháng
tuổi thì vỏ quả khô hoàn toàn.

Bảng 3.3: Sự thay đổi thành phần cơm dừa theo tuổi quả

Dầu

Tuổi quả dừa (tháng)

Chất khô (%)

Protein (% chất khô)

8

35,58 ± 1,41

9,84 ± 0,12

51,20 ±2,61

9

39,47 ± 2,23

9,20 ± 0,31

59,35 + 1,70

10

46,17+ 3,14

8,79 ± 0,81

62,90 ±1,11

11

53,94 + 2,46

7,77 ± 0,33

63,38 ± 1,34

12

50,13 ±2,45

7,10 ± 0,30

62,23 ±1,21

- 0,9918

0,8149

Hệ số tương quan

0,9147

(% chất khô)


Hình 3.1: Sự thay đổi màu sắc của vỏ quả theo tháng tuổi
(Tuổi quả theo thứ tự từ trên xuống và từ trái qua: 8, 9, 10, 11, 12 tháng)

Hình 3.2: Ảnh bố' dọc quả dừa 8 -> 12 tháng tuổi
(Tuổi quả theo thứ tự từ trên xuống và từ trái qua: 8, 9, 10, 11, 12 tháng)

55

3.1.2. KHẢO SÁT CÁC THẢNH PHAN CỬA DẦU
Để xác định các thành phần acid béo của dầu dừa, chúng tôỉ đã tiến hành trích ly dầu,
methyl ester hóa và phân tích bằng máy sắc ký khí. Kết quả được biểu thị trong biểu đồ
3.2, bảng 3.4.

Biểu đồ 3.2: Sự phân bô" các acid béo trong cơm dừa


56

Bảng 3.4: Thành phần acid béo của dầu dừa
Thành phần acid
béo

Chuỗi
carbon

Hàm lượng (%)
Kết quả phân tích
PCFARRD
***

2”
r
(1990)
5
[94]

ƯCA
P
(1990
)
[124
]

Acid béo bão
hòa:
Caproic

C6

-

-

Caprylic

C8

7,23

8,20

Capric

CIO

6,00

5,90

Lauric

C12

Myristic

C14

Palmitic

C16

8,04

Stearic

C18

4,61

Frédérique

Bertrand
(1994)
[135]

-

0,50

0-2

4,10

8,20

8,00

7-10

4,78

7,20

6,40

4-11.

50,05 48,10

43,98

47,30

48,50

45-51

18,86 17,76

20,14

17,00

17,60

17-20

8,49

11,55

8,90

8,40

4-9

3,06

2,63

2,30

2,50

1-5

1,01

1,00

-

Acid béo không
bão hòa:
Palmitoleic
Oleic

C16=
4,59

7,02

8,37

6,30

6,10

2-11

0,62

1,48

3,46

1,90

1,50

0-1

94,79 91,51
87,18
90,90
Tổng acid béo bão
hòa
5,21 8,50 12,84

9,20
Tổng acid béo không
bão hòa
63,28
52,86
62,70
Tổng acid béo C662,20
C12
Lớp cơm dừa phía trong (0 - 5mm) Lớp cơm dừa ở giữa (5 - lOmm)
" Lớp vỏ nâu (10-1 lmm)

91,90

Linoleic

C18"
C182=

7,60
63,40

Đã có nhiều báo cáo về thành phần acid béo của dầu dừa tronơ đó có giông dừa Ta
xanh [8], [94], [124], [135]. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát chi tiết thành phần

57

acid béo tại các vị trí khác nhau trong quả dừa. Khi lây mẫu phân tích, cơm dừa được tách
thành 3 lớp: lớp vỏ nâu ở ngoài cùnơ lớp tronơ cùng tiếp xúc với nước dừa và lớp trung
gian còn lại. Theo Pascual và Cunanan [93], dầu vỏ nâu giàu acid béo không bão hòa hơn
dầu của cơm dừa trắng. Kết quả khảo sát đối với giống dừa Ta xanh Bến Tre cũng cho thấy
có sự khác biệt về thành phần acid béo ở các vị trí khác nhau của cơm dừa (biểu đồ 3.2).
Tổng lượng các acid béo không bão hòa giảm dần từ vùng vỏ nâu bao ngoài cơm dừa
(12,84%) vào trong (5,21%); hàm lượng các triglyceríd mạch ngắn đến trung bình (C6 đến
02) thì biến thiên theo hướng ngược lại: cao nhất ở vùng trong (63,28%), và thấp nhất ở
vùng vỏ nâu của cơm dừa (52,86%). Kết quả này đặc biệt có ý nghĩa trong sử dụng và khai

thác hợp lý nhằm nâng cao giá trị kinh tế của quả dừa vì thành phần aciđ béo là yếu tô"
quan trọng tạo nên tính chất và giá trị của dẫu dừa.
Dầu dừa có độ bão hòa cao, tổng các acid béo bão hòa chiếm 87,18% đến 94,79% .
Độ bão hòa cao đã tạo nên tính bền của dầu dừa so với các loại dầu thực vật khác nên
thường được ứng dụng rộng rãi trong công nshiệp chế biến các thực phẩm cần có thời gian
bảo quản lâu (các loại bánh crackers, bánh cookies, sữa bột, sữa đặc...), các thực phẩm
chiên rán, snack... [124].
Sư khác nhau chủ yếu giữa các acid béo là chiều dài của chuỗi carbon. Kết quả phân
tích cho thấy dẫu dừa chứa một tỉ lệ đáng kể các acid béo mạch ngắn đến trung bình C6 - 02
(52,86% đến 63,28%). Các acid béo mạch ngắn có trọng lượng phân tử nhỏ nên cơ thể dễ
đồng hóa và hấp thu, tạo năng lượng tốt hơn các chất béo nhóm triglyceride bão hòa mạch
dài [124]. Khi nghiên cứu về khả năng tiêu hóa và hâp thu chất béo của cơ thể con người,

các nhà khoa học đã nhận ra rằng các acid béo mạch dài khó tiêu hóa và hiệu quả hấp thu
giảm trong những tuần lễ đầu của trẻ sơ sinh. Ngược lại, các chất béo có chuỗi carbon ngắn
hoặc trung bình (rất giàu trong chất béo của dừa) thì được hấp thu rất tốt, nuay cả đốì với
các cơ thể trẻ sinh non [124]. Vì vậy người ta đã sử dụng những công thức pha trộn dầu
thực vật trong sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng dành cho trẻ em để cung cấp thành phần


58

acid béo tương tự như trong sữa mẹ. Hiện nay dầu dừa là nguồn cung cấp MCT (Medium
Chain Triglycerid) chủ yếu trong các công thức sữa, các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt [74].
Acid béo chủ yếu của dầu dừa là acỉd lauric (C12) chiếm 44 - 50%. Điều này cho

thấy tầm quan trọng của dầu dừa đôi với công nghệ sản xuất mỹ phẩm và chất tẩy rửa vì
chính acỉd béo này là chất tạo bọt cho xà phồng.
Kêt quả nghiên cứu của Nguyễn Trung Phong và cộng sự [13] với 2 giống dừa công
nghiệp là dừa PB121 và dừa Ta, thu thập ở Bến Tre và Long An, cho thấy không có sự khác
biệt đáng kể về thành phần acid béo giữa các giông dừa được khảo sát. Padolina và cộng
sự [90] cũng đã khảo sát 4 giông dừa của Philippines và cũng được kết quả tương tự.

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐlỂiM ENZYM CỦA CƠM DỪA VÀ PHổI DỪA
5.2.1. KHẢO SÁT Sự HÌNH THÀNH PHổỉ DỪA:
Quả dừa thuộc loại quả hạch, cấu tạo từ ngoài vào trong có vỏ và hạt.
Phần phôi nhũ có phôi nhũ lỏng là nước dừa và phồi nhũ đặc là cơm dừa. Phôi
của quả dừa trưởng thành có hình trụ, nằm trong cơm dừa, dưới lỗ mẫm. Lúc nảy

mầm, vùng ở đầu gần lá mầm mọc dài ra, kéo chồi và rễ mầm chui ra ngoài lỗ
mầm, phần còn bên trong quả sẽ phát triển thành một khôi hành gọi là phổi dừa.
Phổi dừa có vaỉ trò hấp thu chất dinh dưỡng để nuồi cây con. Đó là một thể xốp,
phát triển thể tích rất nhanh theo sự phát triển của chồi [135]. Kết quả khảo sát mối tương
quan giữa chiều cao chồi và kích thước phổi dừa (bảng 3.5, hình 3.3,
3.4, 3.5, 3.6) cho thây phổi dừa phát triển đầy đủ (chiếm hết thể tích khoang) khi
chiều cao chồi đạt 30 cm.


59

Bảng 3.5: Chiều cao chồi và kích thước phổi dừa

STT
Chiều cao
Thể tích
Thể tích
chồi (cm)

khoang

phổi dừa

1

7-10

quả dừa
3 7 0 3± 5 1 , 4
(cm )

2

15 -20

384 ±44,5

3

30-40

422 ± 15,3

(cm3)
11 5 +
17,1
319 ±
11 , 4
422 ±

15,3

4

60-70

415 ±25,0

415 ±25,0

Tỉ lệ giữa thể tích
phổi dừa và khoang

quả dừa (%)
31,1
83,1
100
100


Hình 3.3: Thể tích khoang quả và
phối dừa, chồi cao 7cm

Hình 3.4: Thể tích khoang quả và phổi
dừa, chồi cao 15cm

Hình 3.5: Thể tích khoang quả và Hình 3.6: Thể tích khoang quả và phổi phổi dừa, chồi cao 30cm dừa, chồi cao

60cm


3.2.2. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN TRONG CƠM DỪA VÀ PHỔI DỪA: bảng 3.6
Bảng 3.6: Hàm lượng protein hòa tan trong cơm dửa và phối dừa
Giai đoạn
Hàm lượng protein hòa tan (mg/g chất khô)
Chiều cao
Cơm dừa

Phổi dừa
chồi (cm)
7- 10
5,22 ± 0,52
2,78 ± 0,06
1
2

15-20

6,92 ± 0,40

5,23 ± 0,53

3

30-40

9,25 ±0,91

6,17 ±0,30

4

60-70

6,16 ±0,25

7,96 ± 0,32

Kết quả khảo sát hằm lượng protein hòa tan trong cơm dừa và phổi dừa của quả dừa nảy mầm đo bằng phương pháp
Lowry (bảng 3.6) cho thấy hàm lượng protein hòa tan trong cơm dừa cao hơn trong phổi dừa. Trong cơm dừa, hàm lượng
protein hòa tan tăng dần theo sự phát triển của chồi, đạt cao nhất (9,25 mg/g chất khô) vào giai đoạn chồi cao 30 - 40cm,
sau đó giảm. Trong phổi dừa, hàm lượng protein hòa tan cũng tăng dần, đạt 7,96 mg/g chất khô khi chồi cao 60 - 70cm.

3.2.3. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYM CELLULASE VÀ HEMICELLULASE TRONG CƠM DỪA VÀ PHổI DỪA:

Kết quả khảo sát hoạt độ enzym cellulase và hemicellulase trong cơm dừa và phổi dừa được trình bày trong bảng
3.7.
Qua khảo sát quả dừa Ta xanh đang nảy mầm, chúng tôi nhận thây kết quả như sau:
-

Hoạt độ cellulase và hemicellulase của phổi dừa (58,1 lUI/g chất khô và 45,47UI/g chất khô) cao

hơn hoạt độ cellulase và hemicellulase của cơm dừa (1,37 Ul/g chất khô và 5,98 Ưl/g chất khô).
- Hoạt độ cellulase và
chồi dừa cao 15 -

20cm; sau đó giảm dần khi chồi dừa phát triển

- Hoạt độ celỉulase và
chồi dừa cao 30
2Ĩảm thấp.

hemicellulase của phổi dừa cao

- 40cm; sau

nhất ở giai đoạn
cao hơn.

hemicellulase của cơm dừa cao nhất ở giai đoạn
giai đoạn này hoạt độ cellulase và hemiceỉlulase


Như vậy trong phổi dừa enzym đã được hình thành và thể hiện hoạt tính sớm hơn trong cơm dừa, Kết quả này có
thể góp phần trong lý giải về nguồn gốc của các enzym này trong quả dừa. Theo những nghiên cứu gần đây của
Sugimura và Murakami [107], có 3 khả năng giải thích nguồn gốc các enzym thủy phân
vách tế bào cơm dừa. Có thể chúng được tổng hợp bởi phôi và được tiết vào cơm dừa, hoặc được tổng hợp trong cơm dừa
khi có dấu hiệu cảm ứng của phôi, hoặc đã hiện diện và dự trữ trong cơm dừa, sau đó được hoạt hóa bởi thông tin điều hòa
phát ra từ phôi. Quá trình tiêu hóa cơm dừa của phổi dừa được thực hiện dần từng lớp, đầu tiên phân hủy vách và màng tế
bào, tiếp đến là sử dụng các thành phần tế bào chất. Lớp biểu bì của phổi dừa được xem là tầng sinh các enzym [140].
Chúng tôi thấy rằng ở những vùng tiếp xúc với phổi dừa thì cơm dừa mỏng dần và tiết ra nhiều dầu ở dạng tự do. De

Mason và cộng sự (trích dẫn bởi [ỉ35]) khi nghiên cứu trên cây chà là cũng đã có kết luận tương tự rằng chính phôi đã làm
hoạt hóa và kích thích việc giải phóng endo-í3-D-hemicellulase dự trữ trong tế bào của nội nhũ.
Theo kết quả nghiên cứu của Frédérique Bertrand trên giông dừa GOA thì cơm dừa của quả dừa nảy mầm không có
hoạt tính ceỉlulase, hoạt độ hemicelỉuỉase là 1,8 Ul/g. Trong phổi dừa thì hoạt độ celluỉase ỉà 15 Ul/g, hoạt độ hemicelluỉase
là 10 Ul/g [135]. Điều này chứng tỏ rằng có một đặc điểm chung của các giông dừa là hoạt độ enzym cellulase và
hemicellulase của phổi dừa cao hơn hoạt độ enzym cellulase và hemicellulase của cơm dừa.
3.3. NGHIÊN CỨU THƯ NHẬN ENZYM CYTOLASE TỪ CƠM DỪA VÀ PHỔI DỪA
Trong thiên nhiên, enzym celluỉase và hemicelỉulase không tồn tại ở dạng tinh khiết mà thường ở dạng kết hợp với
nhau. Phức hợp enzym này tham gia vào việc thủy phân vách tế bào thực vật nên được gọi chung là cytolase [11]. Các kết
quả nghiên cứu nêu trên đã khẳng định quả dừa Ta xanh trong quá trình nảy mầm cũng sản sinh ra hệ enzym cytoỉase để
thủy phân vách tế bào nội nhũ, cung cấp

các chất đinh dưỡng nuôi cây con. Nguồn nguyên liệu có thể thu nhận enzym cytolase
được xác định là cơm dừa và phổi dừa.
Vách các tế bào thực vật có bản chất polysaccharide và có câu trúc xơ. Sự hiện diện
của các chất xơ ỉàm cản trở quá trình chiết xuất dầu và protein có trong cơm dừa. Các
nghiên cứu của Niwa, Chandrasekaran, King, Rao và cộng sự (trích dẫn bởi [135]) về
phương pháp chiết xuất protein trong bà dừa bằng con đường enzym đều dựa trên giả
thuyết rằng thành phần chính của cơm dừa là cellulose. Tuy nhiên, một số công trình khác
của Rao, Mukherjee, Balasubramaniam và cộng sự (trích dẫn bởi [135]) đã chứng minh
rằng trong c ơ m dừa còn có một lượng lớn hemicellulose, Theo Balasubramaniam [35], ở
giai đoạn quả chín, thành phần các polysaccharides .của cơm dừa có 61% galactomannane,
26% mannane và chỉ có 13% cellulose. Theo Rinaudo [142], các polysaccharides trung

tính của bã dừa có câu tạo gồm 30% cellulose và 70% hemicellulose. Vì hemicellulose là
thành phần cấu tạo chủ yếu của vách tế bào cơm dừa nên trong ứng dụng chiết tách dầu
dừa, chúng tôi sẽ đặt trọng tâm vào chọn lựa điều kiện thích hợp để đạt được hiệu quả thu
nhận chế phẩm tủa có hoạt tính hemicellulase cao nhất.

3.3.

L NGHIÊN cứu THƯ NHẬN CHẾ PHAM TỦA ENZYM CYTOLASE TỪ

CƠM DỪA.
3.3.1.1. K h ả o s á t ả n h h ư ở n g của (NH^SO^ kết quả trong bảng 3.8.
Phương pháp kết tủa enzym thông dụng nhất là sử dụng các loại muôi như

ammonium sulphate [(NH4)2S041, là loại muôi hòa tan tốt trong nước và hầu như không
ảnh hưởng đến hoạt tính của các enzym [27]. Kết quả thí nghiệm với nguyên liệu cơm
dừa cho thấy phải đến nồng độ (NH 4)2S04 70% bão hòa mới tủa được phân đoạn protein
có hoạt tính hemicellulase. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hoạt độ của các
chế phẩm Ec khi tủa ở 2 nồng độ 70% và 80% bão hòa của (NH 4)2S04 (42,87 Ul/g Ec và
42,36 Ul/g Ec). Tuy nhiên tổng đơn vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ cơm dừa khi tủa


ở nồng độ (NH4)?S04 80% bão hòa là 3,69 Ul/g Cd, cao hơn có ý nghĩa thông kê so với
khi tủa ở nồng độ (NH4)2S04 70% bão hòa (3,37 Ưl/g Cd).
Như vậy đối với tác nhân kết tủa là (NH4)2S04 thì nồng độ 80% bão hòa cho hiệu quả
thu nhận hemicellulase tốt nhất. Ở nồng độ này, chế phẩm Ec có hoạt độ hemicellulase là

42,36 Ul/g, hoạt độ celỉulase là 9,73 Ưĩ/g.
3*3.1.2. Khảo sẩt ảnh hưởng của NaCl: kết quả trong bảng 3.9.
Bảng 3.9: Ẩnh hưông của nồng độ NaCl đến hiệu quả thu nhận chế phẩm Ec
Hoạt độ enzym
Nồng độ Hiệu suất thu nhận
Hemicelỉulase
Cellulase
NaCl (%
(%)
UI /g Cd
ưl/g Ec
UI /g Cd

UI /g Ec
bão hòa)

60

6,91 ±0,28

0,45

6,49

0,08

1,17

70

3,93 ±0,38

0,13

3,24

0,10

2,65

80

3,86 ±0,30

0,25

6,49

0,07

1,79

90

3,77 ±0,14

0,24

6,49

0,27

7,20

1,09

98,97

65,00

59,74

0,53

10,10

0,15

3,44

cv%
LSD (0,05)

NaCl là loại muôi thực phẩm, gỉá rẻ và sử dụng an toàn. Kết quả thử nghiệm sử dụng
muôi này để kết tủa enzym cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê về tổng đơn

vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ cơm dừa giữa các thí nghiệm nồng độ NaCl khác nhau,
về hoạt độ của chế phẩm Ec sau khi tủa, kết quả cũng tương tự (khác biệt khồng đáng kể
giữa các thí nghiệm). Do đó nồng độ NaCl được chọn trong trường hợp này là 60% độ bão
hòa.
Chế phẩm Ec tủa ở nồng độ NaCl 60% bão hòa có hoạt độ hemiceìỉulase là 6,49UI/g,
hoạt độ celìulase là l,17ƯI/g.

3.3.1.3* Khảo sát ảnh hưởng của C2H5OH: kết quả trong bảng 3.10.


16

Ec

Bảng 3.10: Ẩnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả thu nhận chế phẩm
Nồng độ
Hiệu
H o ạ t đ ộe n z y m
suất
ethanol
thu nhận
Hemicellulase
Cellulase
UI /g

Cd
0,49

UI /g
Ec
12,74

UI /g
Cd
0,31

0,71

16,69

0,33

7,81

0,79

16,86

0,36

7,67

±

1,21

20,95

0,51

8,73

±

0,79

12,43

0,51

7,95

cv%

8,58

4,09

4,32

3,77

LSD (0,05)

0,09

1,47

0,04

0,69

(%)

(%)

57,6

3,81 ±0,30
4,24
0,32
4,69
0,34
5,78
0,66
6,36
0,56

64

68,6
72
76,8

±
±

Ul/g Ec
8,00

Dung mồi hữu cơ cũng là một trong những tác nhân làm ảnh hưởng đến tính hòa
tan của enzym do làm giảm hằng số điện môi của môi trường [18], [129]. Những dung

môi thường được dùng nhất để kết tủa enzym là C 2H5OH (ethanol) và acetone [129].
Tuy nhiên, vì acetone khá đắt tiền, không phù hợp cho nghiên cứu ứng dụng nên chúng
tôi chỉ thí nghiệm với 1 loại dung môi là ethanol 96°. Quá trình kết tủa enzym bằng
ethanol được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ lạnh 4°c.
Theo kết quả thí nghiệm, hiệu suất thu nhận enzym tăng dần theo nồng độ
ethanol; tổng đơn vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ cơm dừa cao nhất ở nồng độ
ethanol 72% (1.21UI /g Cd), nhưng sau đó giảm (khác biệt có ý nghĩa thống kê). Khi
tủa bằng ethanol 72% thì hoạt độ hemicelluỊase của chế phẩm Ec cũng cao nhất (20,95
UI /g Ec). Các nồng độ ethanol thấp hơn chưa tủa được hoàn toàn những phân đoạn có
hoạt tính enzym nên hoạt độ của chế phẩm Ec thấp. Tuy nhiên ethanol là loại dung môi
dễ làm giảm hoạt tính enzym [39], [130], nến chế phẩm Ec tủa ở nồng độ cao hơn 72% có
hoạt độ giảm thấp (khác biệt có ý nghĩa thống kê).

17

Như vậy nồng độ ethanol thích hợp để tủa Ec được xác định là 72%. Chế phẩm Ec khi
tủa với ethanol 72% có hoạt độ hemicellulase là 20,95 Ưl/g và hoạt độ cellulase là 8,73 ưl/g.

33.1.4.

So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa: bảng 3.11

Bảng 3.11: Hiệu quả của các phương pháp kết tủa Ec

Phương pháp kết tủa
Tổng đơn vị hoạt độ
hemicellulase thu nhận từ

Hoạt độ
hemicellulase của

cơm dừa

chế phẩm Ec

(Ưl/gCd)

(ƯI/gEc)

3,69

42,36

bão hòa

0,45

6,49

3. Ethanol, nồng độ 72%

1,21

20,95

cv%

17,58

18,06

LSD (0,05)

0,59

7,91

1. (NH4)2S04 , nồng độ 80%
độ bão hòa
2. NaCl, nồng độ 60% độ

So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa Ec, có thể kết luận như sau:

- Trong điều kiện thí nghiệm, tổng đơn vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ cơm dừa đạt
cao nhất khi kết tủa bằng (NH4)2S04 ở nồng độ 80% độ bão hòa;


É>
y

phương pháp kết tủa bằng NaCl ở nồng độ 60% độ bão hòa cho kết quả thu nhận enzym
kém nhất (khác biệt có ý nghĩa thông kê).
- Chế phẩm Ec thu nhận bởi phương pháp kết tủa bằng (NH 4)2S04

ờ

nồng độ

80% độ bão hòa có hoạt độ hemicellulase cao nhâ't; chế phẩm Ec thu nhận bởi phương
pháp kết tủa bằng NaCl ở nồng độ 60% độ bào hòa có hoạt độ hemicelluỉase thấp nhất.
Những sự khác biệt này có ý nghĩa thông kê.

3.3.2.

NGHIỀN

cứu

THƯ NHẬN CHẾ PHAM

TỦA

EN2YM CYTOLASE TỪ

PHỔỈ DỪA.
3.3.2.I. Khảo sát ảnh hưởng của (NH4)2S04: kết quả trong bảng 3.12

Bảng 3.12: Ẩnh hưởng của nồng độ (NH4)2S04đến hiệu quả thu nhận chế
phẩm Ep

Nồng độ
Hiệu suất
Hoạt độ enzym

(NH ) so
4

2

4

thu nhận

Hemicellulase

(% bão hòa)

(%)

Ưl/g Pd

50

13,50 ± 1,94

3,68

60

14,66 ± 1,13

70
80

ưl/g Pd

UI /g Ep

27,26

2,58

19,07

3,81

25,99

2,99

20,40

18,61 ± 1,40

7,33

39,36

5,41

29,07

19,30 ±0,96

8,82

45,72

5,07

26,29

18,72

12,73

13,84

11,63

0,92

5,90

cv%
LSD (0,05)

ƯI/gEp

Celluỉase

16.97
1,80

Đối với nguyên liệu phổi dữa (Pd), kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng nồng độ
(NH4)2S04 thì hoạt độ hemicellulase tăng; tổng đơn vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ

phổi dừa (8,82 UI /g Pd) và hoạt độ hemicellulase của


70

Bảng 3.13: Ẩnh hưởng của nồng độ NaCl đến hiệu quả thu nhận chế phẩm ____Ep
Nồng độ
Hiệu suất
Hoạt độ enzym
NaCl

thu nhận

Hemicelluỉase

(% bão hòa)

(%)

Ul/g Pd

60

14,48 ± 1,88

4,72

32,57

1,31

9,06

70

18,31 ± 1,79

4,86

26,65

1,33

7,21

80

20,50 ± 2,33

5,05

24,62

1,43

6,97

90

20,61 ± 1,70

4,24

20,57

1,50

7,28

cv%

13,36

13,47

8,89

8,07

LSD (0,05)

1,13

6,32

0,22

1,11

UI /g Ep

Celluỉase
UI /g Pd

Ul/g Ep

Bảng 3.14: Ẩnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả thu nhận chế phẩm
_________________________________Ẹfi____________________________________
Nồng độ Hiệu suât
Hoạt độ enzym
ethanol

thu nhận

(%)

(%)

57,6
64
68,6
72
76,8

Hemicellulase

Cellulase

UI /g Pd

UI /g Ep

UI /g Pd

UI /g Ep

11 , 2 0 ± 2 , 4 1

0,76

6,80

1,69

15,06

17,92 ±
1,86

0,99

5,52

2,18

12,14

18,78 ±2,46

0,87

4,66

1,33

7,08

18,72 ±
1,59

0,52

2,78

0,81

4,31

26,22 ±3,51

0,20

0,77

0,96

3,67

cv%

8,58

7,12

3,92

2,69

LSD (0,05)

0,13

0,66

0,12

0,52


71

3.3.2A So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa: bảng 3.15

Bảng 3.15: Hiệu quả của các phương pháp kết tủa Ep

Phương pháp kết tủa
Tổng đơn vị hoạt độ
hemicellulase thu nhận từ
phổi dừa (Ưl/gPd)

Hoạt độ hemicelỉulase của
chế phẩm Ep
(UI /g Ep)

- (NH4)2S04 (nồng độ 70%
độ bảo hòa)
- NaCl (nồng độ 60% độ

7,33

39,36

bão hòa)
- Ethanol (nồng độ 64%)

4,72
0,99

32,57

5,52

cv%

8,47

7,41

LSD (0,05)

0,68

3,66

So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa Ep, có thể kết luận như sau:
- Trong điều kiện thí nghiệm, tổng đơn vị hoạt độ hemicellulase thu nhận từ phổi dừa đạt
cao nhất khi kết tủa bằng (NH4)2S04 ở nồng độ 70% độ bão hòa; phương pháp kết tủa bằng
ethanol ở nồng độ 64% cho kết quả thu nhận enzym thấp nhất (khác biệt có ý nghĩa thống
kê).
- Chế phẩm Ep thu nhận bởi phương pháp kết tủa bằng (NH^SOị ở nổng độ 70% độ
bão hòa có hoạt độ hemicelỉuỉase cao nhất; chế phẩm Ep thu nhận bởi phương pháp kết tủa
bằng ethanol ở nồng độ Ố4% có hoạt độ hemicellulase thấp nhất. Những sự khác biệt này có
ý nghĩa thông kê.

Từ những kết quả nghiên cứu nêu trên, có thể kết luận rằng có thể thư nhận enzym
cytolase từ nguyên liệu cơm dừa và phổi dừa của quả dừa Ta xanh nảy mầm, Một đặc điểm


72

chung được phát hiện là nồng độ của các tác nhân được thử nghiệm như (NH 4)2S04, ethanol,
dùng để tủa enzym từ nguyên liệu cơm dừa cao hơn nồng độ của những chất này dùng để
tủa enzym từ nguyên liệu phổi dừa, chứng tỏ Ec khó tủa và ít nhạy cầm với các tác nhân tủa
hơn so với Ep. Đốì với phổi dừa, việc sử dụng tác nhân kết tủa là NaCl cũng mang lại hiệu
quả. Hoạt độ chế phẩm Ep tủa bằng NaCl cao hơn hoạt độ chế phẩm Ep tủa bằng ethanol
trong khi đối VỚI Ec thi kết quả ngược lại. Giải thích điều này có thể liên quan đến đặc

điểm của nguyên liệu. Dịch chiết cơm dừa có thành phần chất khô và độ nhớt cao nên khả
năng hòa tan của NaCl trong môi trường này kém và hiệu quả kết tủa thấp hơn so trường
hợp nguyên liệu phổi dừa.
Phương pháp kết tủa enzym hiệu quả nhất là dùng (NH 4)2S04 nồng độ 80% bão hòa
đôi với nguyên liệu cơm dừa và 70% bão hòa đốì với nguyên liệu phổi dừa. Ngoài tác dụn^
tạo nên sản phẩm tủa có hoạt tính cao, (NH4)2S04 còn góp


73

phần làm ổn định hoạt tính chế phẩm trong quá trình bảo quản và sử
dụng [41], [129]. Đây cùng ià phương pháp thu nhận enzym kinh tế nhất

vì (NH4)2S04 có giá khá rẻ và có thể tái sử dụng.
3.3.3. KHẢO SÁT CÁC YỂư Tố ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CHẾ PHẨM
CYTOLASE THU NHẬN TỪ QƯẢ DỪA.
3.3.3.L Ảnh hưởng của pH: biểu đồ 3.3, 3.4.

pH

4

4,4

4,8

5,2

5,6

6

7

8

Biểu đồ 3.3: Ẩnh hưởng của pH đến hoạt độ hemiceỉlulase của Ec

Biểu đổ 3.4: Ẩnh hưửng của pH đến hoạt độ hemiceỉỉulase của Ep
pH là một trong những yếu tô" ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng và hoạt tính xúc tác của enzym [18], [95]. Kết quả
thí nghiệm cho thây cả hai chế phẩm Ec và Ep đều thể hiện hoạt tính hemicellulase cao nhất khi phản ứng xúc tác được
thực hiện ở pH 7. Điều này thông thường vì hầu hết các sinh vật đều thích nghi ỗ mối trường có pH sần trung tính [95].
Theo kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, khoảng pH tôi thích của các enzym khác nhau dao động rất lổn, thường từ 3,5
đến 6 [84]. Hoạt độ hemicellulase của enzym Hemicellulase Sigma và của dịch chiết protein cơm dừa (giống GOA) cao
nhất ở pH 5 [135]. Mannanase của các ỉoài nám mốc có hoạt độ cao nhất trong điều kiện acid, pH 3,6 đến 5,5 [49]. Chế

phẩm hemicellulase của Deerland Enzyme Inc., một loại B-mannanase thu nhận từ Aspergiỉlus niger, có pH tối thích là 4,
pH ổn định 3 - ố [58]. Chế phẩm Pentosanase thu nhận từ Trichoderma sp, (Deerland Enzyme Inc.) có pH tối thích là 5, pH

ổn định 3-7 [59].
Ki-Haeng Cho và cộng sự mới đây đã báo cáo phân lập được từ đất một chủnơ vi khuẩn mới có khả năng sản sinh

nhiều mannanase có hoạt tính cao trong môi trường acid và trung tính, pH 5 đến 7. Đó là chủng Bacillus sp. WL-1 được
phân lập từ đất [49]. Một sô" chủng Bacilỉus mới được phát hiện lại có khả nảng sản sinh các mannanase kiềm tính.
Mannanase từ chủng Bacillus sp. NI6-5 có pH tốì thích 9-10, vùng pH ổn định là 8,5 đến 10 [80]. Patenĩ IP-030470Ố đã
mô tả một mannanase thu nhận từ Baciỉlus sp. có hoạt tính cao nhất ở pH 8 đến 10. Patent JP- 63036774 có báo cáo một
loại mannanase kiềm từ chủng vi khuẩn Bacillus sp, FERM P-8856. Patent WO 91/18974 cũng mô tả một loại mannanase


có hoạt tính ở pH rất kiềm. Chủng Baciỉỉus sp. AM001 có khả năng sản sinh 3 loại mannanase ngoại bào có pH tối thích ỉầ
8-9 (Trích dẫn bỏi [80]).

Các mannanase có hoạt tính cao trong vùng pH gần trung tính đặc biệt có ý nghĩa trong ứng dụng làm chất bổ sung
thức ăn gia súc vì trong các cơ quan tiêu hóa của ỈỢn và các loài có móng, vùng tiêu hóa nơi mannanase tác động có pH
khoảng 6,5 [49]. Đặc điểm này của chế phẩm enzym thu nhận từ quả dừa cũng rất thuận ỉợi khi ứng dụng trong chiết dầu
dừa vì pH tự nhiên của dịch sữa dừa cũng ở khoảng 6,5.
3.3*3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ: biểu đồ 3.5, 3.6.


Biểu đồ 3.5: Ẩnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ hemicellulase của Ec

Biểu đồ 3.6: Ẩnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ hemicellulase của Ep
Nhiệt độ là yếu tô" quan trọng nhất ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng do enzym xúc tác. Tuy nhiên do có bản châ"t
sinh học, mỗi enzym chỉ hoạt động trong một khoảng nhiệt độ nhất định không làm enzym biến tính hoặc mất hoạt