THIẾT kế mẫu nội KIỂM ĐÁNH GIÁ mức độ xử lý DNA với BISULFITE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---    ---

Nguyễn Thu Trang

THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM
ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---    ---

Nguyễn Thu Trang

THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM
ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

Hà Nội - 2017

Lời cảm ơn
Để có thể hoàn thành tốt luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời
cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Võ Thị Thương Lan – người đã trực tiếp hướng dẫn
em tiến hành đề tài này. Cô đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá
trình làm việc cũng như học tập thời gian qua. Cô không chỉ truyền thụ cho em những
kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong công việc mà còn khơi gợi, bồi đắp tính cẩn thận,
tự giác, đạo đức nghề nghiệp và lòng say mê nghiên cứu khoa học trong em, giúp em
vượt qua khó khăn để tự tin, vững bước trên con đường mình đã chọn.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Phạm Anh Thùy Dương, chị là người
đã chỉ bảo, chia sẻ với em rất nhiều trong công việc và cuộc sống, giúp em có thái độ
nghiêm túc, chỉn chu với mọi việc được giao.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Tạ Bích Thuận, cô là người đã
động viên, khích lệ em rất nhiều trong suốt thời gian qua, giúp em có thể hoàn thành
tốt công việc của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Ngô Thị Hà, CN. Nguyễn Quang Duy và các
bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Y đã luôn bên cạnh, cổ vũ tinh thần và ủng hộ em
trong suốt thời gian qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè
đã luôn tin tưởng, ủng hộ và động viên, giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên

Nguyễn Thu Trang


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Ribonucleic acid

gDNA

: Genomic DNA (DNA hệ gen)

cs.

: Cộng sự

IC

: Internal control (mẫu nội kiểm)

SHOX2

: Short Stature Homeobox 2

ACTB

: Beta actin

CFF

: Cytosine free fragment

dNTPs

: Deoxynucleotide triphosphates

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Real-time PCR

: Phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng

RT-PCR

: Reverse Transcription - PCR (PCR phiên mã ngược)

Ct

: Threshold cycle (chu kì ngưỡng)

UV

: Ultraviolet (tia cực tím)

GMO

: Genetically Modified Organism

SNPs

: Single Nucleotide Polymorphism


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Trang

Bảng 2.1

Trình tự các oligo và mồi sử dụng trong nghiên cứu

24

Bảng 2.2

Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp đoạn IC và

26

UnIC

Bảng 2.3

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR IC và UnIC với

26

cặp mồi Trans-CFF
Bảng 2.4

Thành phần phản ứng PCR IC sau xử lý bisulfite với cặp

27

mồi Shox-UnCFF
Bảng 2.5

Thành phần phản ứng PCR gDNA sau xử lý bisulfite với

27

cặp mồi Shox-Me-F/R
Bảng 2.6

Thành phần và điều kiện phản ứng Real-time PCR khuếch

29

đại mẫu nội kiểm sau khi xử lý bisulfite
Bảng 2.7

Thành phần phản ứng nối IC và UnIC vào vector pTZ57

30

Bảng 2.8

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc

31

với cặp mồi vector pTZ57
Bảng 2.9

Thành phần và điều kiện phản ứng mở vòng plasmid bằng

32

enzyme giới hạn
Bảng 3.1

Kết quả đo nồng độ của IC và UnIC sau khi tinh sạch

36

Bảng 3.2

Giá trị ΔCt trung bình của mẫu chuẩn

41

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát pUnIC ở các nồng độ khác nhau

42

Bảng 3.4

Giá trị ΔCt và tỷ lệ xử lý bisulfite của các nhóm pIC trộn

44

gDNA mẫu máu
Bảng 3.5

Giá trị ΔCt và tỷ lệ xử lý bisulfite của các nhóm pIC trộn
gDNA mẫu bệnh phẩm

46


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1

Chu kì nhiệt PCR

3

Hình 1.2

Hệ thống đầu dò Taqman

5

Hình 1.3

Thuốc nhuộm SYBR Green I

6

Hình 1.4

Sự methyl hóa cytosine đứng trước guanine

14

Hình 1.5

Trình tự DNA trước và sau khi xử lý bisulfite

15

Hình 1.6

Các phản ứng của quá trình xử lý bisulfite

16

Hình 1.7

Phổ hấp thụ UV

18

Hình 1.8

Phân tích ACTB/CFF dựa vào Real-time PCR

19

Hình 2.1

Mô hình IC

21

Hình 2.2

Sơ đồ thiết kế IC từ Oligo-CFF-F, Oligo-CFF-R và cặp

22

mồi Trans-CFF-F, Trans-CFF-R
Hình 2.3

Sơ đồ thiết kế UnIC từ Oligo-UnCFF-F, Oligo-UnCFF-R

22

và cặp mồi Trans-CFF-F, Trans-CFF-R
Hình 2.4

Sơ đồ thí nghiệm

33

Hình 3.1

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn IC và

34

UnIC trên gel polyacrylamide 8%
Hình 3.2

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn IC và

35

UnIC bằng cặp mồi Trans-CFF-F và Trans-CFF-R trên gel
polyacrylamide 8%
Hình 3.3

Kết quả điện di sản phẩm IC, UnIC tinh sạch trên gel
polyacrylamide 8%

36


Hình 3.4

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang

37

đoạn chèn IC (giếng 1-7), mang đoạn chèn UnIC (giếng 814) trên gel agarose 2%
Hình 3.5

Kết quả điện di pIC (giếng 1) và pIC (giếng 2) trên gel

37

agarose 1%
Hình 3.6

Kết quả điện di trên gel agarose 1% các plasmid IC trước

38

(giếng 1) và sau khi cắt (giếng 2) với enyme giới hạn ScaI.
Giếng 3: plasmid UnIC sau khi cắt với ScaI
Hình 3.7

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR mẫu MT15 và

39

MT15-XL với cặp mồi Trans-CFF và Shox-UnCFF trên
gel polyacrylamide 8%
Hình 3.8

Đồ thị so sánh giá trị ΔCt của ba nhóm mẫu chuẩn

41

Hình 3.9

Đường chuẩn pUnIC ở các nồng độ khác nhau, từ 0.4 pg

43

đến 200 pg
Hình 3.10

Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite giữa ba nhóm pIC phối

45

trộn cùng gDNA mẫu máu. Mẫu chuẩn pUnIC được sử
dụng làm đối chứng tương đương với pIC được xử lý hoàn
toàn với bisulfite
Hình 3.11

Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite giữa ba nhóm pIC được

47

phối trộn cùng gDNA mẫu bệnh phẩm. Mẫu chuẩn pUnIC
được sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC được
xử lý hoàn toàn với bisulfite
Hình 3.12

Kết quả giải trình tự pIC ở một số mẫu sau xử lý bisulfite

48

Hình 3.13

(A) Kết quả giải trình tự pIC ở mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng

49

IC. (B) Kết quả giải trình tự vùng promoter gen SHOX2 ở
mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng IC


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 2
1.1.

KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG ................................................................ 2

1.1.1.

Giới thiệu về kỹ thuật PCR ..................................................................... 2

1.1.2.

PCR định lượng (Real-time PCR) .......................................................... 3

1.1.3.

Ứng dụng của kỹ thuật PCR định lượng ................................................. 7

1.2.

MẪU NỘI KIỂM........................................................................................... 9

1.2.1.

Mẫu nội kiểm DNA .............................................................................. 10

1.2.2.

Mẫu nội kiểm RNA............................................................................... 12

1.3.

QUÁ TRÌNH XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE ........................................... 13

1.3.1.

Giới thiệu về phương pháp xử lý DNA với bisulfite ............................ 13

1.3.2.

Nguyên tắc của quá trình xử lý DNA với bisulfite ............................... 15

1.4.

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DNA SAU XỬ LÝ BISULFITE ................. 17

1.4.1.

Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ .................. 17

1.4.2.

Định lượng DNA sau xử lý bisulfite bằng Real-time PCR .................. 18

1.4.3.

Xác định mức độ xử lý DNA với bisulfite ........................................... 19

CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 21
2.1.

THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM........................................................................... 21

2.2.

NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................... 24

2.2.1.

Nguyên liệu ........................................................................................... 24

2.2.2.

Hóa chất ................................................................................................ 25

2.2.3.

Thiết bị .................................................................................................. 25

2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 25

2.3.1.

Phương pháp xử lý DNA với bisulfite .................................................. 25


2.3.2.

Phương pháp PCR ................................................................................. 25

2.3.3.

Phương pháp Real-time PCR ................................................................ 28

2.3.4.

Phương pháp tách dòng ........................................................................ 29

2.3.5.

Phương pháp biến nạp .......................................................................... 30

2.3.6.

Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc .......................................................... 31

2.3.7.

Phương pháp tách plasmid .................................................................... 31

2.3.8.

Phương pháp cắt enyme giới hạn .......................................................... 32

2.3.9.

Phương pháp điện di ............................................................................. 32

2.3.10. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ................................................. 33
2.3.11. Phương pháp giải trình tự gen .............................................................. 33
2.3.12. Phương pháp phân tích thống kê .......................................................... 33
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 34
3.1.

THIẾT KẾ IC VÀ UnIC.............................................................................. 34

3.1.1.

Tổng hợp đoạn IC và UnIC .................................................................. 34

3.1.2.

Tách dòng IC và UnIC .......................................................................... 36

3.1.3.

Kiểm tra tính đặc hiệu của IC ............................................................... 38

3.2.

KHẢO SÁT pUnIC (MẪU CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG pIC) ................. 40

3.2.1.

Khảo sát giá trị ΔCt của mẫu chuẩn ..................................................... 40

3.2.2.

Dựng đường chuẩn pUnIC .................................................................... 42

3.3.

KHẢO SÁT LƯỢNG pIC CHO QUÁ TRÌNH XỬ LÝ BISULFITE ........ 43

3.3.1.

Đánh giá mức độ xử lý bisulfite cho các nồng độ khác nhau của pIC . 43

3.3.2.

Giải trình tự ........................................................................................... 48

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 51
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 52


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng đòi
hỏi độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Một công cụ hữu hiệu giúp nâng cao độ
tin cậy cho các thử nghiệm phân tử là sử dụng các mẫu đối chứng nội kiểm. Đối chứng
nội kiểm tham gia kiểm soát các quy trình, phản ứng mà không ảnh hưởng đến bản
chất phân tử đích, đảm bảo kết quả chính xác với có độ tin cậy cao. Các mẫu nội kiểm
được sử dụng nhiều cho các quy trình tách chiết và khuếch đại DNA/RNA góp phần
xây dựng các hệ thống phát hiện những biến đổi di truyền hay chẩn đoán mầm bệnh
hiệu quả.
Các biến đổi di truyền ngoại sinh đã trở thành dấu chuẩn phân tử trong chẩn
đoán bệnh. Trong đó, hiện tượng methyl hóa được nghiên cứu phổ biến hơn cả do sự
methyl hóa quá mức của một số gen có liên quan chặt chẽ tới quá trình hình thành và
phát sinh ung thư. Trong các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu hiện tượng
này, xử lý DNA với bisulfite có những ưu thế hơn hẳn các phương pháp khác. Tuy
nhiên, hầu như chưa có một hệ thống nội kiểm nào thực sự hoàn thiện để kiểm soát quá
trình xử lý bisulfite. Việc bổ sung mẫu nội kiểm cho phương pháp phân tích methyl
hóa này sẽ góp phần kiểm định tính chính xác của kết quả, hỗ trợ chẩn đoán và tiên
lượng đúng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá
mức độ xử lý DNA với bisulfite” nhằm đưa ra một công cụ hỗ trợ việc kiểm soát quá
trình xử lý bisulfite và đánh giá được mức độ xử lý DNA với bisulfite. Đề tài được

thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học Phân tử
thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc Gia Hà Nội.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG

1.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) là một trong
những phát minh quan trọng nhất trong lĩnh vực kỹ thuật sinh học phân tử. PCR là nền
tảng cho một loạt các tiến bộ khoa học như giải trình tự hệ gen, biểu hiện gen trong hệ
thống tái tổ hợp và các nghiên cứu di truyền phân tử như xác định huyết thống hay
chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng [59]. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm
1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Kể từ khi ra đời, kỹ thuật này đã gây ra một cuộc
cách mạng thực sự trong nghiên cứu sinh học, có ý nghĩa lớn trong lĩnh vực chẩn đoán
và cải tiến di truyền [48].
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA trong ống nghiệm dựa trên
hoạt động của enzyme DNA polymerase bền nhiệt, cho phép khuếch đại một sợi khuôn
ban đầu thành hàng triệu bản sao. Cơ chế của quá trình này tương tự như quá trình sao
chép DNA trong tế bào nhưng đoạn DNA khuếch đại được giới hạn bởi cặp mồi đặc
hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ vào hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được kéo
dài để hình thành mạch mới [45]. Nguyên liệu để tạo thành sản phẩm PCR là bốn loại
nucleotide bao gồm adenine, thymine, cytosine, và guanine (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP – gọi chung là dNTPs) [18]. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì lặp lại nối tiếp

nhau với 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp và tổng hợp. Ở giai đoạn một, DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao (90oC – 97oC), khi đó phân tử DNA mạch kép được tách thành hai
mạch đơn. Trong giai đoạn hai, nhiệt độ được giảm phù hợp cho sự bắt cặp bổ sung
giữa đoạn mồi và DNA khuôn (tùy thuộc vào Tm của mồi). Ở giai đoạn ba, nhiệt độ
được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Nhờ hoạt tính của
DNA polymerase, các nucleotide lần lượt được gắn vào primer theo nguyên tắc bổ

2


sung với mạch khuôn [35]. Kết quả là vùng DNA đích được sao chép thành bản sao
giống hệt với khuôn mẫu ban đầu. Sản phẩm của chu kỳ trước trở thành khuôn cho chu
kỳ tiếp theo. Quá trình sao chép chọn lọc này được lặp lại nhiều chu kì liên tiếp chính
xác và nhanh chóng nhờ máy luân nhiệt PCR [18].

Hình 1.1. Chu kì nhiệt PCR. (1) nhiệt độ tăng cao khoảng 95oC để biến tính
mạch đôi DNA, (2) nhiệt độ được giảm phù hợp cho mồi bắt cặp bổ sung với
DNA khuôn, (3) nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho hoạt động tổng hợp mạch mới
của DNA polymerase [40].

Nhằm cải thiện hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng PCR, nhiều cải biến trong
phương pháp đã được sử dụng thay cho PCR truyền thống. Các biến thể của PCR có
thể kể đến như: PCR đa mồi (multiplex PCR); PCR lồng (nested PCR); PCR phiên mã
ngược (RT-PCR) và PCR định lượng (PCR thời gian thực – Real-time PCR) [30].
1.1.2. PCR định lượng (Real-time PCR)
Real-time PCR đã trở thành một trong những phương pháp định lượng được sử
dụng rộng rãi nhất bởi phổ phân tích rộng, có khả năng khuếch đại mẫu trong ống
nghiệm lên hàng tỷ bản sao với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt, kết quả khuếch
đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu kỳ của phản ứng nhiệt. Cơ sở của kỹ thuật này
dựa trên cường độ phát màu huỳnh quang được máy ghi nhận tương quan với nồng độ

sản phẩm PCR được khuếch đại tại thời điểm tương ứng [62]. Phản ứng Real-time
PCR được đặc trưng bởi chu kì tại thời điểm bắt đầu phát hiện được tín hiệu khuếch đại

3


của mẫu. Giá trị này được gọi là chu kì ngưỡng hay Ct, đây là thời điểm mà tín hiệu
huỳnh quang của mẫu lớn hơn tín hiệu huỳnh quang nền. Các mẫu khác nhau sẽ có Ct
khác nhau phụ thuộc vào số lượng phân tử DNA đích ban đầu [27].
Hiện nay có nhiều loại hóa chất khác nhau có khả năng phát hiện tín hiệu huỳnh
quang dùng trong phản ứng Real-time PCR. Một số hóa chất được dùng phổ biến có
thể kể đến như: đầu dò đánh dấu huỳnh quang Taqman, đầu dò phân tử Beacons, đầu
dò lai, mồi Scorpion, thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green [23].
Đầu dò TaqMan:
Đầu dò Taqman là những oligo nucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu trên
phân tử DNA đích. Đầu 5’ của đầu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter), đầu 3’
gắn chất hấp thụ (quencher) để hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter.
Trong quá trình PCR, khi Taq polymerase kéo dài chuỗi đến vị trí đầu dò Taqman gắn
trên sợi khuôn, Taq polymerase sẽ cắt bỏ đầu dò nhờ hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease. Khi
đó reporter của đầu dò Taqman sẽ được giải phóng rời xa quencher và có khả năng
phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích [52]. Một số chất phát huỳnh quang
có thể gắn ở đầu 5’ của đầu dò bao gồm FAM (6-carboxyfluorescein), TET
(tetrachloro-6-carboxyfluorescein),

JOE

(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-

carboxyfluorescein), HEX (hexacholoro-6-carboxyfluorescein), hoặc VIC (4,7,2trichloro-7-phenyl-6-carboxyfluorescein). Ánh sáng huỳnh quang của các reporter này
có thể được hấp thụ bởi một số quencher tại đầu 3’ như TAMRA (6carboxytetramethylrhodamine) hay DABCYL [4-(48-dimethyl aminophenylazo)

benzoic acid] [39]. Khi được giải phóng bởi Taq polymerase, các reporter phát huỳnh
quang, cường độ phát quang được ghi nhận sau từng chu kỳ PCR.

4


Hình 1.2. Hệ thống đầu dò Taqman. (A) Sau khi sợi đôi DNA bị biến tính, mồi và
đầu dò Taqman sẽ gắn đặc hiệu vào trình tự đích. Sự phát huỳnh quang không xảy
ra do tín hiệu huỳnh quang của reporter bị quencher hấp thụ. (B) Trong quá trình
kéo dài chuỗi, reporter ở 5’ đầu dò sẽ bị phân cắt bởi Taq polymerase nhờ hoạt
tính 5’ – 3’ exonuclease. Nhờ vậy, reporter được giải phóng sẽ phát huỳnh quang
khi nhận ánh sáng kích thích [23].

Đầu dò phân tử Beacon
Đầu dò Beacon có cấu trúc phân tử sợi đơn DNA dạng kẹp tóc, cũng có reporter
ở một đầu và quencher ở đầu còn lại. Chính vì có cấu trúc kẹp tóc nên khi phân tử dạng
tự do trong dung dịch, reporter và quencher sẽ ở gần nhau và không phát huỳnh quang.
Khi đầu dò Beacon lai với trình tự đích, reporter và quencher bị tách rời nhau dẫn đến
reporter phát huỳnh quang dưới tác dụng của ánh sáng kích thích. Phương pháp này
chủ yếu dùng để phát hiện đột biến điểm, định lượng các mầm bệnh và phát hiện giới
tính phôi [23].
SYBR Green I
SYBR Green I là thuốc nhuộm có khả năng liên kết với sợi đôi DNA. Ở trạng
thái tự do, SYBR Green I không thể phát huỳnh quang nhưng khi liên kết với sợi đôi
DNA thì thuốc nhuộm này có khả năng phát huỳnh quang dưới tác dụng của ánh sáng

5


kích thích. Cũng chính nhờ cơ chế này, SYBR Green I có thể sử dụng với bất kì cặp

mồi và trình tự đích nào. Chi phí tiến hành phản ứng cũng ít tốn kém hơn so với dùng
đầu dò. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phản ứng dùng SYBR Green I sẽ kém hơn so với
dùng đầu dò phát huỳnh quang do nguy cơ khuếch đại cả các sản phẩm phụ không đặc
hiệu hoặc sản phẩm nhị hợp của mồi (primer dimer) [23]. Việc so sánh đường cong
nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm trong phản ứng là một giải pháp nhằm khắc phục
nhược điểm trên [40]. Bên cạnh đó, cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cao và quy trình tối
ưu giúp hạn chế việc xuất hiện sản phẩm phụ trong phản ứng. Một số kỹ thuật sử dụng
Hot Star Taq cũng làm giảm hình thành primer dimer [23].

Hình 1.3. Thuốc nhuộm SYBR Green I. (A) SYBR Green I ở trạng thái tự do,
không phát ra ánh sáng huỳnh quang. (B) Sau khi SYBR Green I liên kết với
sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang [23].

Real-time PCR được cho là ưu việt hơn hẳn các kỹ thuật khác trong việc định
lượng biểu hiện gen với độ chính xác cao mà không cần điện di kiểm tra sản phẩm sau
khuếch đại [51]. Để xác định được chính xác số lượng bản sao ban đầu trong mẫu thì
phải tiến hành thực hiện Real-time PCR cùng với mẫu chuẩn có số lượng DNA đích
ban đầu đã biết (định lượng tuyệt đối). Đường biểu diễn mối quan hệ giữa chu kì
ngưỡng với số lượng bản sao ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường chuẩn
(standard curve) [46]. Có hai thông số dùng để đánh giá độ chính xác và tin cậy của
đường chuẩn. Thông số thứ nhất là hệ số tương quan R2, dùng để đánh giá thao tác pha

6


loãng mẫu và lấy khuôn có chính xác không. Giá trị này phải đạt trên 0.99. Thông số
thứ hai là hiệu suất khuếch đại E%, giá trị này chấp nhận được trong khoảng từ 90%
đến 110% [43]. Ngoài ra, định lượng PCR có thể thực hiện thông qua mẫu chuẩn có số
lượng DNA tham chiếu (định lượng gián tiếp). Phương pháp này còn được gọi là
phương pháp ΔΔCt vì nguyên tắc định lượng của phương pháp dựa trên việc so sánh

giá trị chu kì ngưỡng (Ct) của mẫu nghiên cứu với mẫu đối chứng. Mẫu đối chứng vừa
được dùng làm tham chiếu để định lượng vừa được dùng để kiểm tra hiệu suất của
phản ứng. Thông thường, mẫu nghiên cứu có thể là mẫu được điều trị/xử lý còn mẫu
đối chứng là mẫu không bị điều trị/xử lý; hoặc mẫu nghiên cứu là mẫu bệnh phẩm còn
mẫu đối chứng là mẫu không mắc bệnh. Công thức tổng quát tính mức độ điều
trị/nhiễm bệnh của mẫu nghiên cứu so với mẫu đối chứng được trình bày như sau [57]:
Tỷ lệ điều trị/nhiễm bệnh của mẫu nghiên cứu = Tỷ lệ mẫu đối chứng x 2-ΔΔCt
ΔΔCt = (Ct gen khảo sát – Ct gen đối chứng)mẫu nghiên cứu - (Ct gen khảo sát – Ct gen đối chứng)mẫu đối chứng

1.1.3. Ứng dụng của kỹ thuật PCR định lượng
Xác định tải lượng virus
Kỹ thuật Real-time PCR giúp định lượng acid nucleic của virus trong mẫu bệnh
phẩm ở người như máu, huyết thanh hay nước tiểu. Đường chuẩn dùng để định lượng
có thể được xây dựng từ plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn là đoạn gen đích hoặc mẫu
chuẩn được cung cấp bởi kit thương mại để đảm bảo tính ổn định cho kết quả. Kết quả
định lượng này dùng để đánh giá mối quan hệ giữa tải lượng virus (số bản sao virus
trên một đơn vị thể tích) với tiến triển của bệnh lý nhiễm virus hoặc đánh giá hiệu quả
của điều trị kháng virus [16]. Solange và cs. (2014) lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật
Real-time PCR để xác định tải lượng virus viêm gan B (HBV) trong các mẫu huyết
thanh của 80 bệnh nhân ở Côte d’Ivoire, Tây Phi. Kết quả cho thấy phương pháp định
lượng có độ nhạy lâm sàng tốt (5 IU/ml tương đương 14 copy/ml), độ đặc hiệu cao, yêu
cầu lượng mẫu thấp (100 – 500 µl huyết tương hoặc huyết thanh) rất phù hợp để ứng

7


dụng trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị lâm sàng [59]. Ngoài ra, Real-time PCR còn
được sử dụng để phát hiện và định lượng các mầm bệnh virus gây hại cho cây trồng và
vật nuôi, ví dụ như virus gây bệnh đậu mùa ở cừu (Sheeppox virus) được định lượng
bằng kỹ thuật Real-time PCR sử dụng đầu dò phát huỳnh quang TaqMan trong nghiên

cứu của Balinsky và cs. năm 2008 [4] hay virus khảm lúa mỳ (Wheat yellow mosaic
virus) được phát hiện và định lượng thông qua RT-qPCR trong nghiên cứu của Liu và
cs. năm 2013 [47].
Nghiên cứu biểu hiện gen
PCR định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR) được sử dụng phổ biến trong
nghiên cứu biểu hiện gen với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và khả năng xác định mức độ
biểu hiện gen một cách nhanh chóng. Các gen quản gia có sự biểu hiện ổn định trong tế
bào như GAPDH hay β-actin thường được sử dụng làm đối chứng dương trong phân
tích biểu hiện gen [62]. Gutala và cs. (2004) đã tiến hành nghiên cứu biểu hiện một số
gen quản gia (β-actin, 18S rRNA, và GAPDH) ở mô não của bệnh nhân Alzheimer sau
khi tử vong 12 giờ. Kết quả phân tích RT-qPCR của nhóm nghiên cứu cho thấy biểu
hiện của β-actin và 18S rRNA có sự khác biệt với mẫu đối chứng, trong khi GAPDH
vẫn có mức độ biểu hiện tương tự như đối chứng. Kết quả này cho thấy GAPDH rất
phù hợp để sử dụng làm gen nội kiểm khi nghiên cứu mô não bệnh nhân mắc
Alzheimer [22]. Bên cạnh các phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen khác như
Northern blotting, lai tại chỗ, cDNA arrays; RT-qPCR cho thấy ưu điểm trong việc
định lượng mRNA của các gen có mức độ biểu hiện thấp trong tế bào bởi RT-qPCR là
phương pháp định lượng có độ nhạy và chính xác cao nhất. Giulietti và cs. (2001) cũng
lựa chọn phương pháp định lượng này để nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen mã hóa
cho cytokine – một gen có mức độ biểu hiện rất thấp nhưng liên quan đến nhiều quá
trình quan trọng trong phản ứng miễn dịch, phản ứng viêm hay quá trình thải loại trong
cấy ghép tạng [23].

8


Phát hiện các biến đổi di truyền
Một trong những ứng dụng rất quan trọng nữa của kỹ thuật Real-time PCR là
phát hiện và định lượng các biến đổi liên quan đến acid nucleic như đột biến gen, đa
hình nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism, viết tắt là SNPs) hay phát hiện sinh

vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism, viết tắt là GMO). Trong nghiên cứu
sinh vật biến đổi gen, phương pháp định lượng Real-time PCR cho phép phân tích
GMO với dung lượng lớn nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Cottenet và
cs. (2013) đã sử dụng Real-time PCR đa mồi để phát hiện cùng lúc 47 đoạn gen khác
nhau với giới hạn phát hiện đạt khoảng 1-16 bản copy [9]. Lang và cs. (2011) đã sử
dụng kỹ Real-time PCR với mồi đặc hiệu allen để phát hiện hai đột biến gen có liên
quan tới ung thư đại trực tràng là KRAS và BRAF với giới hạn phát hiện của kỹ thuật
lên đến 10 bản sao DNA mang đột biến [41]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lương Thị
Lan Anh và cs. (2017) đã cho thấy việc ứng dụng thành công kỹ thuật Real-time PCR
trong phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ
tim trẻ tuổi. Mặc dù hạn chế về cỡ mẫu nhưng đây là công bố đầu tiên ở Việt Nam
nghiên cứu phát hiện đột biến -455G/A bằng kĩ thuật Real-time PCR, mở đầu cho các
nghiên cứu tiếp theo, góp phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim [1].
1.2.

MẪU NỘI KIỂM
Mẫu nội kiểm (Internal Control – IC) được thiết kế phục vụ mục đích đánh giá,

kiểm tra chất lượng một quy trình hay một phản ứng. IC là phân tử thứ hai có thể được
tách chiết hay khuếch đại độc lập cùng với phân tử đích trong cùng một thí nghiệm. IC
được coi là mẫu chuẩn cho việc khảo sát một mô hình phân tử, các hóa chất dùng cho
phản ứng hay kiểm tra các thông số hoạt động của máy [44].
Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật phân tích ở mức độ phân tử như tách chiết DNA,
tách chiết RNA, khuếch đại gen đều sử dụng IC để kiểm soát chất lượng. Xét về mặt
bản chất phân tử đối với các kỹ thuật liên quan đến acid nucleic, có hai loại IC được sử

9


dụng là DNA và RNA. Trong đó, những IC mang bản chất DNA thường được sử dụng

để kiểm soát quy trình tách chiết, phản ứng khuếch đại gen (PCR, Real-time PCR) và
các quy trình xử lý DNA còn những IC mang bản chất RNA thường được sử dụng làm
đối chứng cho quá trình liên quan đến tách chiết RNA, RT-PCR hay định lượng RTPCR [7, 32,33].
1.2.1. Mẫu nội kiểm DNA
Kể từ đầu những năm 1990, ứng dụng kỹ thuật PCR vào phát hiện các phân tử
hay mầm bệnh đã chiếm ưu thế rất lớn với nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, những
khó khăn trong việc lặp lại các kiểm nghiệm này đã được báo cáo với nguyên nhân đến
từ một loạt các yếu tố như thay đổi hệ thống máy, hiệu suất của các loại DNA
polymerase hay sự có mặt của các chất ức chế [32]. Ngoài ra, các yếu tố chủ quan từ
nguồn vật liệu mẫu hay người thực hiện cũng ảnh hưởng đến tính ổn định, chính xác
của số liệu. Việc thiết kế bổ sung các đối chứng nội kiểm chính là một trong những giải
pháp giúp tăng độ lặp lại và đảm bảo tính chính xác của các thử nghiệm. Sử dụng IC là
các phân tử DNA không phải trình tự đích trong cùng một ống thí nghiệm với đoạn
DNA đích sẽ giúp kiểm soát quy trình và tăng độ tin cậy cho kết quả vì các IC này sẽ
cùng chịu tác động của mọi yếu tố cùng với mẫu nghiên cứu [32, 54].
Đối với các nghiên cứu liên quan PCR, IC được khuếch đại đồng thời với gen
đích trong cùng phản ứng. Có hai chiến lược chính được dùng để thiết kế IC đó là IC
có cạnh tranh hoặc không cạnh tranh với gen đích [32]. Nếu IC được khuếch đại bằng
cặp mồi giống với cặp mồi đặc hiệu cho gen đích thì xảy ra sự cạnh tranh giữa gen đích
và IC. Sử dụng IC cạnh tranh như vậy giúp phát hiện sự có mặt của chất ức chế trong
phản ứng đồng thời giảm nguy cơ tạo ra các sản phẩm không đặc hiệu do sử dụng các
cặp mồi khác nhau [3, 12]. Tuy nhiên, IC cạnh tranh có thể ảnh hưởng tới độ nhạy phát
hiện DNA đích, đòi hỏi người làm phải thiết kế thí nghiệm chặt chẽ, tính toán tỷ lệ
phân tử, trình tự, cấu trúc IC thật hợp lý. Trong đó, thông số quan trọng nhất cần xem

10


xét chính là nồng độ IC. Quá nhiều IC dẫn đến sự cạnh tranh cao, thậm chí lấn át DNA
đích, đồng thời khả năng phát hiện chất ức chế của IC giảm, đặc biệt với các tín hiệu

ức chế yếu. Kết quả âm tính giả hoàn toàn có khả năng xảy ra [11, 32]. Khi sử dụng IC
không cạnh tranh với gen đích, cặp mồi khuếch đại IC và gen đích khác nhau nên hai
trình tự sẽ được khuếch đại đồng thời, độc lập và không cạnh tranh với nhau. Tuy
nhiên, nhược điểm của việc dùng loại IC này là kết quả có thể không phản ánh chính
xác sự khuếch đại trình tự đích do khác biệt giữa hiệu suất bắt cặp của hai cặp mồi với
hai trình tự khác nhau. Vì vậy, thành phần nucleotide và kích thước IC cũng như cặp
mồi khuếch đại cần được thiết kế hợp lý trước khi tiến hành [32].
Bên cạnh việc sử dụng IC cho quá trình khuếch đại DNA thì IC còn được sử
dụng cho các khâu tách chiết, tinh sạch DNA, đặc biệt với các đoạn DNA đích khó
tách chiết từ mẫu mô thực vật, nấm hoặc các mầm bệnh như virus, vi khuẩn. Hughes và
cs. (2006) đã tiến hành tách chiết đồng thời hệ gen của mầm bệnh nấm Phytophthora
ramorum gây rụng lá và hệ gen cây vật chủ. Quá trình tách chiết nấm được coi là đảm
bảo chất lượng nếu tín hiệu khuếch đại gen quản gia của cây vật chủ dương tính [33].
Luciano và cs. (2007) đã xây dựng mô hình định lượng gen GA2OX2 của loại thực vật
gây ảo giác Salvia divinorum trong hỗn hợp thực vật bằng kỹ thuật Real-time PCR sử
dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green. Mô hình nghiên cứu này cần phối trộn
mẫu thực vật gây ảo giác với mẫu thực vật không gây ảo giác theo tỷ lệ khối lượng
trước khi tách chiết (100/0%, 80/20%, 60/40%, 40/60%, 20/80%, 10/90%, 0/100%), vì
vậy việc sử dụng gen quản gia làm nội kiểm không phù hợp. Luciano và cs. đã bổ sung
50 ml dung dịch chứa gDNA của thực vật mô hình Arabidopsis thaliana (0.02 mg/ml)
vào mẫu cần tách chiết như một nội kiểm thay thế, đảm bảo hóa chất và thao tác trong
quá trình tách chiết DNA đạt chất lượng tốt, tránh hiện tượng âm tính giả [49].
Trong quá trình xác định DNA bị methyl hóa tại CpG, xử lý DNA với bisulfite
là quy trình phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc, biểu hiện gen

11


[56]. Tuy nhiên, hệ thống kiểm soát nội bộ cho quy trình này chưa được nghiên cứu
nhiều. Một số nghiên cứu có đề cập đến việc sử dụng IC kiểm tra DNA đã được xử lý

với bisulfite hay chưa. Cankovic và cs. (2013) đã sử dụng vùng promoter gen COL2A1
làm IC cho quá trình xử lý bisulfite [8]. Vùng promoter gen này không bị methyl hóa ở
cả tế bào lành và tế bào ung thư nên việc khuếch đại được DNA sau xử lý của đoạn gen
này sẽ đảm bảo gDNA đã được xử lý với bisulfite, đủ lượng cho việc phân tích methyl
hóa các vùng DNA cần nghiên cứu khác [8]. Urich và cs. (2015) cũng sử dụng DNA
không bị methyl hóa làm IC cho quá trình xử lý bisulfite. Nhóm nghiên cứu bổ sung ʎDNA (DNA ngoại lai không bị methyl hóa) vào mẫu trước khi xử lý bisulfite, ʎ-DNA
này có vai trò là đối chứng cho quá trình xử lý DNA với bisulfite. Ngoài ra, với mẫu
thực vật, có thể sử dụng trực tiếp vùng gen lục lạp làm IC vì đây là vùng DNA không
bị methyl hóa. Các IC này có vai trò tương tự như IC trong nghiên cứu của Cankovic
(2013) [8, 60]. Có thể thấy, IC trong các nghiên cứu này mới chỉ kiểm tra có DNA
được xử lý bisulfite hay không mà chưa chỉ ra được quá trình xử lý bisulfite có diễn ra
hoàn toàn hay chưa. Việc xây dựng một đối chứng nội chuẩn có khả năng kiểm soát
được mức độ xử lý DNA với bisulfite sẽ có ý nghĩa và vai trò quan trọng trong việc
hoàn thiện các quy trình nghiên cứu methyl hóa DNA.
1.2.2. Mẫu nội kiểm RNA
Cũng giống với IC bản chất DNA, IC là RNA được sử dụng để kiểm soát nội bộ
các quá trình tách chiết, khuếch đại RNA. Nguyên tắc thiết kế IC cũng phụ thuộc vào
mục đích, nhu cầu của nghiên cứu liên quan đến phát hiện, tách chiết mầm bệnh virus
mang bản chất RNA. Một nhược điểm khi sử dụng RNA làm đối chứng đó là sợi RNA
kém bền và dễ dàng bị phân hủy bởi RNase. Để khắc phục nhược điểm này, đoạn IC
RNA thường được đóng gói như hạt virus giúp ổn định sợi RNA và kiểm soát được
quá trình tách chiết virus [13]. Năm 2004, Beld và cs. đã phát triển quy trình chẩn đoán
phát hiện enterovirus (EV) RNA trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR. Quy

12


trình này được kiểm soát bằng một IC RNA. Đây là IC cạnh tranh với trình tự đích,
được đóng gói tái tổ hợp giống như hạt phage MS2 và thả vào mẫu bệnh phẩm cho
phép kiểm soát hiệu quả của cả quá trình tách chiết và quá trình khuếch đại bằng RTPCR. Độ nhạy phát hiện của IC RNA là 150 bản copy/ml [7]. Năm 2005, Dreier và cs.

đã thiết kế hệ thống phát hiện virus viêm gan C (Hepatitis C Virus – HCV) trong mẫu
bệnh phẩm bằng phương pháp Real-time RT-PCR, sử dụng IC là thực khuẩn thể phage
MS2. IC được thả vào mẫu bệnh phẩm, kiểm soát từ quá trình tách chiết đến khuếch
đại virus. Cặp mồi khuếch đại IC được thiết kế trong vùng trình tự mã hóa cho enzyme
sao chép của MS2 nên IC không cạnh tranh với trình tự đích của virus HCV. Kết quả
cho thấy IC có độ nhạy phát hiện tốt và độ ổn định cao trong điều kiện bảo quản -20oC,
4oC và nhiệt độ phòng [13]. Việc sử dụng mẫu IC để kiểm soát các quy trình liên quan
đến phát hiện virus vì vậy mà có ý nghĩa hết sức quan trọng và cần thiết.
Hiện nay có nhiều kit thương mại cung cấp mẫu nội kiểm để kiểm soát các khâu
tách chiết, phát hiện và định lượng virus. Ví dụ như bộ kit định lượng GeneProof
Hepatitis B Virus (HBV) PCR Kit. Bộ kit này sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện DNA
của virut HBV có mặt trong mẫu bệnh phẩm. Mẫu nội kiểm được cung cấp có bản chất
là DNA, được dùng cùng mẫu bệnh phẩm từ khâu tách chiết đến Real-time PCR giúp
đánh giá được hiệu suất thu hồi sau tách chiết và kiểm tra sự có mặt của chất ức chế
trong phản ứng PCR [19]. Bộ kit phát hiện và định lượng virus Zika trong mẫu huyết
thanh, huyết tương hoặc nước tiểu: Zika Virus RT-PCR Kit U.S. cũng cung cấp mẫu
nội kiểm RNA để kiểm tra các khâu tách chiết RNA và phản ứng Real-time RT-PCR,
tránh xảy ra hiện tượng âm tính giả [55].
1.3.

QUÁ TRÌNH XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE

1.3.1. Giới thiệu về phương pháp xử lý DNA với bisulfite
Methyl hóa DNA là yếu tố di truyền ngoại gen đóng vai trò quan trọng trong
nhiều quá trình sinh học như quá trình biệt hóa, điều hòa gen, ổn định cấu trúc hệ gen.

13


Đặc biệt, quá trình này còn liên quan tới sự hình thành khối u và phát sinh ung thư

[56]. Methyl hóa DNA là một biến đổi hóa học cộng hóa trị, kết quả là thêm một nhóm
methyl (-CH3) vào cacbon ở vị trí số 5 của cytosine đứng trước guanine (CpG) nhờ các
enzyme DNA methyltransferase, một số trường hợp có thể là CpA hoặc CpT [2]. Điểm
đặc biệt là các vị trí CpG không phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen người mà thường tập
trung xuất hiện ở một số vùng được gọi là các đảo CpG. Các đảo này dài khoảng 200
bp đến vài kb, phân bố chủ yếu trong vùng promoter hoặc exon của 50% - 60% các gen
trong hệ gen người [6].

Hình 1.4. Sự methyl hóa cytosine đứng trước guanine [37].

Để phân biệt được cytosine bị methyl hóa với cytosine không bị methyl hóa,
Frommer và cs. đã nghiên cứu và phát triển quy trình xử lý DNA với bisulfite cho phép
biến đổi cytosine không bị methyl hóa thành uracil trong khi cytosine bị methyl hóa sẽ
không bị biến đổi [17].

14


Hình 1.5. Trình tự DNA trước và sau khi xử lý bisulfite [29].

Như vậy, quá trình xử lý bisulfite đã trở thành trung gian giúp đưa thông tin di
truyền ngoại gen (methyl hóa CpG) khó phát hiện thành trình tự DNA có sự khác biệt
rõ rệt giữa dạng methyl hóa và không bị methyl hóa. Từ đó, methyl hóa DNA có thể dễ
dàng được nghiên cứu và phát hiện bằng các kỹ thuật sinh học phân tử thông thường
như PCR hay các phương pháp lai DNA [10]. Đến nay, quá trình xử lý DNA với
bisulfite này vẫn được coi là “tiêu chuẩn vàng” cho phân tích methyl hóa DNA giúp
phát hiện và định lượng methyl hóa ở từng nucleotide C [37].
1.3.2. Nguyên tắc của quá trình xử lý DNA với bisulfite
Quá trình biến đổi DNA bằng bisulfite là phản ứng hóa học xảy ra trong điều
kiện khắc nghiệt. Phản ứng được tối ưu trong điều kiện pH thấp, nhiệt độ cao và thời

gian ủ kéo dài dẫn đến DNA bị đứt gãy đáng kể [59]. Quá trình biến đổi này bao gồm
ba bước chính được tóm tắt trong Hình 1.6.

15


Hình 1.6. Các phản ứng của quá trình xử lý bisulfite [26].

 Bước một (Sulphonation): Bisulfite (HSO3-) phản ứng với cytosines dẫn đến
hình thành một chất trung gian 5,6-dihydrocytosine-6-sulfonat (dẫn xuất
cytosine-bisulfite);
 Bước hai (Hydrolic Deaminination): Sự thủy phân dẫn xuất cytosine-bisulfite
tao thành dẫn xuất uracil-bisulfite. Quá trình xảy ra tốt hơn với sợi đơn DNA
trong pH có tính acid khoảng giá trị 5;
 Bước ba (Disulphonation uracil-bisulphite): Bisulfite bị loại bỏ khi đưa phản
ứng về pH kiềm [24, 34].
Bisulfite ưu tiên biến đổi cytosine thành uracil trong sợi đơn DNA, trong khi đó
dẫn xuất cytosine methyl lại chịu nhiệt tốt hơn nên không bị biến đổi. Kết quả sau khi
PCR là uracil được khuếch đại như thymine trong khi cytosine bị methyl vẫn là
cytosine [37]. Nồng độ bisulfite cao dẫn đến sự biến đổi hoàn toàn cytosine không bị
methyl hóa thành uracil nhưng làm đứt gãy DNA [20, 31]. Nguyên nhân chính dẫn đến
đứt gãy DNA là do quá trình depurimin và quá trình depyrimidin dẫn đến gãy các liên
kết N-glycoside [59]. Ngược lại, nếu nồng độ bisulfite thấp hơn nhiều so với lượng

16