Nghiên cứu chuyển hóa selen vô cơ thành selen hữu cơ bằng nấm men

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ -- --

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SELEN VÔ CƠ
THÀNH SELEN HỮU CƠ BẰNG NẤM MEN"

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Xuân Phương
Lớp: K20 -1302

Hà Nội – 2017


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáocủa mình
PGS.TS. Vũ Nguyên Thành đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những
kiến thức chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá
trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mở Hà
Nội,Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo Bộ môn đã
động viên chỉdẫn, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành

luận văn này.
Đồng thời, em xin cảm ơnThS. Đinh Thị Mỹ Hằng và tập thể cán bộ
Trung tâm vi sinh vật Công nghiệp, Viện công nghiệp thực phẩm đã luôn nhiệt
tìnhgiúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt công việc.Cuối cùng, em xin
gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động
viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận
của em không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo của
thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy đủ và
hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Xuân Phương
Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3

1.1.

Vài nét về nguyên tố Selen. ..................................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm. ................................................................................................ 3
1.1.2. Phân bố. .................................................................................................. 3
1.1.3. Vai trò của Selen đối với cơ thể, ............................................................. 3
1.2.

Tổng quan về nấm men. .......................................................................... 4

1.2.1. Giá trị dinh dưỡng của nấm men. ............................................................ 4
1.2.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm men.................................... 6
1.2.3. Nguồn dinh dưỡng cho nấm men. ........................................................... 7
1.2.4. Khả năng hấp thụ Selen của nấm men. .................................................... 8
1.3.

Khái quát về nấm men giàu Selen. .......................................................... 9

1.3.2. Tình hình nghiên cứu các sản phẩm nấm men giàu selen. ....................... 9
1.3.3. Ứng dụng và công dụng của nấm men giàu selen. ................................. 10
1.4.

Khái quát về cao nấm men. .................................................................. 11

1.4.1. Cao nấm men và nấm men tự phân. ...................................................... 11
1.4.2. Ứng dụng của cao nấm men. ................................................................. 13
1.5.

Các phương pháp phân tích Selen. ........................................................ 14

1.5.1. Phương pháp phân tích khối lượng. ....................................................... 14
1.5.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. .......................................... 14
1.5.3. Phương pháp huỳnh quang Rơnghen. .................................................... 14
Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

1.5.4. Phương pháp huỳnh quang nguyên tử. .................................................. 15
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16
2.1.

Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy, dụng cụ và thiết bị. ................. 16

2.1.1. Vật liệu và môi trường nuôi cấy. ........................................................... 16
2.1.2. Hóa chất. ............................................................................................... 17
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị. ............................................................................... 17
2.2.

Phạm vi nghiên cứu............................................................................... 18

2.3.

Nội dung nghiên cứu. ............................................................................ 18

2.4.

Phương pháp nghiên cứu:...................................................................... 18

2.4.1. Phương pháp chuẩn bị hóa chất hỗ trợ phân tích. .................................. 18
2.4.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Selen có trong nấm men. ................ 19
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy nấm men. .......................................................... 24
2.4.4. Phương pháp bảo quản nấm men........................................................... 27
2.4.5. Phương pháp thủy phân nấm men giàu Selen hữu cơ. ........................... 27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 29
3.1.

Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng Selen có trong nấm men

phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. .......................................................... 29
3.1.1. Phương pháp tách Selen từ nấm men bằng HNO325% và H2O230%: .... 29
3.1.2. Tách chiết Selen từ nấm men bằng phương pháp đun cách cát. ............. 29
3.1.3. Phương pháp tách Selen từ nấm men bằng phương pháp pháp mẫu bằng
máy phá mẫu Milestone..................................................................................... 30
3.1.4. Kết hợp phá vỡ tế bào nấm men bằng máy phá mẫu Milestone và đun
cách cát. ............................................................................................................ 31
3.2.

Lựa chọn chủng nấm men có khả năng chuyển hóa Selen vô cơ ........... 32

3.3.

Xác định điều kiện môi trường phù hợp cho nấm men chuyển hóa Selen

vô cơ thành Selen hữu cơ. ................................................................................. 36
3.4.

Thử nghiệm thủy phân nấm men giàu selen hữu cơ............................... 39

Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 46
4.1.

Kết luận: ............................................................................................... 46

4.2.

Kiến nghị: ............................................................................................. 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 47

Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Hàm lượng vitamin của nấm men bia sấy khô [6]................................. 5
Bảng 1.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả thủy phân nấm men.................. 12

Bảng 2.1. Tỉ lệ dung dịch đệm và Stock Selen………………………………20
Bảng 2.2. Giá trị OD của nồng độ Selen. ........................................................... 21
Bảng 2.4. Các chủng nấm men sử dụng để chọn lọc. ......................................... 24
Bảng 3.1. Kết quả định lượng selen sau khi tách chiết bằng HNO3 25% và
H2O230%........................................................................................................... 29
Bảng 3.2. Kết quả định lượng Selen trong nấm men bằng phương pháp đun cách
cát. .................................................................................................................... 30
Bảng 3.3. Kết quả định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp phá mẫu
bằng máy. .......................................................................................................... 31
Bảng 3.4. Kết quả định lượng Selen trong nấm men bằng phương pháp phá mẫu
bằng máy và đun cách cát. ................................................................................. 32
Bảng 3.5. Khối lượng chế phẩm nấm men giàu selen thu được sau khi nuôi cấy
trên môi trường YM. ......................................................................................... 34
Bảng 3.6. Khối lượng chế phẩm nấm men giàu selen thu được sau khi nuôi cấy
trên môi trường Malt 5◦Bx. ............................................................................... 34
Bảng 3.7. Các điều kiện cơ bản trước và sau khi nuôi nấm men giàu Selen ...... 36
Bảng 3.8. Sinh khối thu được và hàm lượng Selen toàn phần và vô cơ tự do của
nấm men khô giàu Selen.................................................................................... 37
Bảng 3.9. Ảnh hường của của nồng độ selen vô cơ bổ sung ban đầu tới khả năng
chuyển hóa selen của nấm men ......................................................................... 37
Bảng 3. 10. Hiệu suất thủy phân nấm men giàu selen tính theo phương pháp sấy.
.......................................................................................................................... 43

Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
Hình 2.1. Đường chuẩn Selen. ........................................................................... 21
Hình 3.1. Sơ đồ nuôi cấy nấm men giàu selen .................................................. 33
Hình 3.2. Trạng thái nấm men lúc 0 giờ. ........................................................... 38
Hình 3.3. Trạng thái nấm men sau khi chuyển hóa selen vô cơ thành ................ 38
Hình 3.4. Quy trình thủy phân nấm men bằng phương pháp sinh học................ 39
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thủy phân bằng phương pháp hóa học....................... 41
Hình 3.6. Sau khi quá trình thủy phân kết thúc. ................................................. 42

Nguyễn Xuân Phương – 1302


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên đầy đủ

YM

Yeast Malt

GSHPx

Glutathionine peroxydase

CNTP

Công nghệ thực phẩm

FDA

Food and Drug Administration

HIV

Human Immuno-deficiency Virus

Nguyễn Xuân Phương – 1302


MỞ ĐẦU
Vào những năm đầu của thế kỷ 20, Selen được nhìn nhận như một nguyên
tố độc hại, nó có thể gây què và tử vong cho các động vật ăn cỏ.Vai trò của Selen
đã được nhiều nhà khoa học chú ý; lúc này tác dụng của Selen mới được công
nhận. Ở một nồng độ nhất định, Selen được nhìn nhận như một nguyên tố vi
lượng thiết yếu cho người và động vật. Thực tế, ở lĩnh vực chăn nuôi, người ta
nhận thấy nếu thức ăn thiếu Selen thì súc vật sẽ mắc các bệnh loạn dưỡng cơ,
tăng tiết dịch,…
Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ học ở Nhật Bản, New Zealand, … cho
thấy tại một số địa phương nếu hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn thấp thì tỷ
lệ người mắc bệnh ung thư, bệnh tim mạch,vô sinh, viêm khớp,… cao hơn các
nơi khác. Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng Selen có vai trò quan trọng
trong quá trình hô hấp tế bào vì nó có liên quan đến sinh tổng hợp Co - enzyme,
là thành phần cấu tạo nên Gluthathion peroxydase (GSHPx) - một enzyme chống
lại quá trình oxy hóa lipid và giảm hoạt hóa vitamin E,… Hay gần đây, các nhà
nghiên cứu đã tìm ra bằng chứng cho thấy selen ảnh hưởng tới hệ thống miễn

dịch, nó có ảnh hưởng lớn tới sự sống cả các bệnh nhân HIV.Selen có thể được
coi là chất chống oxy hóa quan trọng, giúp cơ thể loại bỏ các gốc tự do, các
peroxit độc hại. Như vậy,Selen đã tham gia vào việc tăng cường hệ thống oxy
hóa của cơ thể. Sự thiếu hụt Selen trong cơ thể sẽ có thể gây ra 40 bệnh ở người
như suy thoái võng mạc, suy giảm miễn dịch, ung thư, viêm khớp, tim mạch,…
Chính vì Selen có tác dụng lớn như vậy mà ngày càng có nhiều nghiên
cứu, thử nghiệm tạo các chế phẩm Selen. Từ những thử nghiệm bổ sung Selen
cho động vật, sau đó được nghiên cứu áp dụng trên người đã cho thấy một điểm
sáng cho việc khắc phục sự thiếu hụt Selen. Thoạt đầu người ta sử dụng Selen vô
Nguyễn Xuân Phương - 1302

1


cơ, ví dụ như Selenat và Natri selenite. Năm 1987, cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp thuận sử dụng Sodium selenite và Natri
selenat ở mức 0,3 ppm trong thức ăn gia súc. Tuy nhiên, ta phải cẩn trọng với
độc tính của Selen vô cơ, vì nếu dùng quá liều có thể gây tai biến hay tử vong.
Những nghiên cứu cho thấy Selen dạng hữu cơ có thể dễ dàng hấp thụ và
cũng an toàn hơn so với Selen vô cơ. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về việc
tìm nguồn Selen dạng hữu cơ. Người ta tiến hành tìm trên cây cối, nhưng hàm
lượng trên cây cối thay đổi theo mùa, đất đai,… gây nên nhiều trở ngại. Chính vì
vậy mà hướng nuôi cấy nấm men trong môi trường có Selen vô cơ trên nên cần
thiết hơn bao giờ hết.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài:“Nghiên cứu chuyển hóa Selen vô cơ thành Selen hữu cơ bằng nấm men”.
Mục tiêu nghiên cứu:
- Lựa chọn được chủng và điều kiện môi trường cho nấm men có khả
năng chuyển hóa Selen vô cơ thành Selen hữu cơ.
Nội dung đề tài:

- Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng Selen có trong nấm men
phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
- Lựa chọn chủng nấm men có khả năng chuyển hoá Selen vô cơ thành
Selen hữu cơ.
- Xác định điều kiện môi trường phù hợp cho nấm men chuyển hoá
Selen vô cơ thành Selen hữu cơ.
- Thử nghiệm thủy phân nấm men giàu Selen hữu cơ tạo sản phẩm nấm
men giàu Selen hòa tan.

Nguyễn Xuân Phương - 1302

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vài nét về nguyên tố Selen

1.1.1. Đặc điểm
Tên quốc tế: Selenium.
Kí hiệu hóa học: Se.
Nguyên tử lượng: 78,96.
Selen là nguyên tố hóa học thuộc nhóm VI A trong bảng tuần hoàn các
nguyên tố, có số thứ tự 34, cấu hình electron lớp ngoài cùng là: 4s ଶ 4pସ . Các
nguyên tố cùng nhóm với Selen là: Oxy, Lưu huỳnh, Telu và Poloni [2, 12].
Vạch phổ hấp thụđặc trưng và nhạy nhất của Selen là vạch 196,1 nm được
sử dụng khi dung kỹ thuật F - AAS và ETA – AAS [10, 19, 20].
Tính chất hóa học của Selen rất giống Lưu huỳnh, chúng đều thể hiện mức
oxy hóa -2; +4; +6 tương ứng với các hợp chất Sulfid – Selenid; Sulfit – Selenit;

Sulfat – Selenat.
1.1.2. Phân bố
Trong thực vật, Selen thường tập trung ở các cây thuộc họ Đậu, họ Cà
phê, Nhàu, Keo giậu, lúa mì và một số loài nấm.Trong động vật, Selen có nhiều
trong cá đặc biệt là da và gan cá ngừ, cá nục, cá thu [2, 4, 12].
1.1.3. Vai trò của Selen đối với cơ thể
Trước đây, Selen được coi là nguyên tố có độc tính cao vì ở những vùng
đất giàu Selen thường gặp một số bệnh ở súc vật và người như rụng lông, yếu
cơ,… Thế nhưng đến năm 1949, Claton và Bauman đã nhận thấy rằng hàm
lượng Selen trong khẩu phần ăn có tác dụng ngăn chặn sự phát sinh ung thư ở
Nguyễn Xuân Phương - 1302

3


chuột. Năm 1958, người ta nhận ra lợi ích của Selen đối với sức khỏe con người
và động vật. Ngày nay, Selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng,
không thể thiếu được cho hệ thống bảo vệ cơ thể chống gốc tự do và có nhiều vai
trò sinh học khác [4, 12].
Selen là chất antioxidant, có thể hạn chế sự oxy hóa các LDL cholesterol
nên ngăn chặn quá trình tạo mảng xơ vữa động mạch – nguyên nhân gây cao
huyết áp, thiếu máu cục bộ ở các cơ quan, thiểu năng tuần hoàn não. Ngoài ra
Selen đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm do nó có thể làm ổn định
Lysosom vì màng Lysosom không nguyên vẹn là nguyên nhân của quá trình
viêm. Các hợp chất của Selen và của Co – enzyme Q có khả năng chống oxy hóa
các lipit ở màng tế bào, phân hủy các peroxyd đã thành trong tế bào nên Selen
đảm bảo sự vẹn toàn của tế bào, làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể, kéo dài
sự sống của con người [12, 27].Sự thiếu hụt Selen trong cơ thể có thể dẫn đến
các hội chứng: giảm khả năng sinh trường, giảm trương lực cơ, tổn thương thần
kinh, suy giảm miễn dịch, bệnh tim mạch, hoại tử gan, xơ hóa tụy, giảm sắc tố

mô, các dạng ung thư và có thể dẫn đến tử vong.
1.2.

Tổng quan về nấm men

1.2.1. Giá trị dinh dưỡng của nấm men
Nấm men là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa một hàm
lượng protein khoảng 52%, gồm nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể. Theo
Mitchell và công sự (1927, 1945) thực phẩm nấm men chứa hàm lượng protein
ngang hoặc cao hơn so với thực phẩm khác như bột đậu nành (21,4%), bột bắp
(3,5%), đậu (5%).
Trong nấm men bia chứa lipit, trong đó có 23,1% lipit rắn (bão hòa hoặc
no) và 76,1% lipit lỏng (chưa bão hòa hoặc chưa no). Lipit rắn gồm axit palmitic
Nguyễn Xuân Phương - 1302

4


(61,3%) và axit stearic (38,3%). Trong thành phần lipit lỏng của nấm men bia có
axit linoleic. Trong lipit của nấm men bia còn chứa các phosphatic – lecithins và
xealin [6, 9].
Chất khoáng chiếm 5 – 11% có vai trò quan trọng trong hoạt động của
nấm men, đặc biệt là phosphor có thành phần phosphatide, nucleoprotein.Ngoài
ra, trong tế bào nấm men còn chứa các ion kali, magie, sắt, lưu huỳnh và axit
silicic [9]. Nấm men còn cơ acid amin cần thiết cho cơ thể, β-glucan, trehalose,
mannan, vitamin – đặc biệt là vitamin nhóm B và các hợp chất tạo mùi thơm.
Bảng 1.1.Hàm lượng vitamin của nấm men bia sấy khô [6].
Thành phần
Biotin (Vitamin H)
Riboflavin (Vitamin B2)

Acid pantothenic (Vitamin B3)

Hàm lượng (µg/g)
0,6 – 0,7
30 – 60
2 – 19

Tiamin (Vitamin B1)

24 – 50

Pyridoxin (Vitamin B6)

14 – 39

Nicotinanit (Vitamin B5)

370 – 375

Nấm men đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng trong đời sống. Nấm
men giàu protein, vitamin, các acid amin cần thiết, chất khoáng,… mà nấm men
được sử dụng trong thực phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, thực phẩm chức năng
hay được sử dụng như một chất điều vị trong công nghệ thực phẩm và cũng như

Nguyễn Xuân Phương - 1302

5


là nhân tố quan trọng trong việc tạo nên các sản phẩm như rượu, bia, bánh mì, có

mặt trong thuốc, mĩ phẩm,…
Ngoài ra, dịch tự phân của nấm men có khả năng giúp thực vật chống lại
một số bệnh do nấm và VK gây ra bằng cách tăng cường khả năng bảo vệ tự
nhiên của thực vật. Nấm men hoặc các sản phẩm nấm men bổ sung thêm vào
thức ăn vật nuôi sẽ giúp tăng cường hệ VSV đường ruột, giúp vật nuôi kháng lại
các bệnh về đường ruột, tăng trọng lượng, tăng sản lượng sữa, trứng.Cao nấm
men giàu nitrogen, vitamin, chất khoáng và các hợp chất kích thích tăng trưởng
nên được sử dụng trong các môi trường nuôi cấy VSV.
1.2.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm men
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm
men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. Điều
kiện thích hợp để nấm men sinh trường khi nhiệt độ 28-30°C, pH = 4,4, nồng độ
dịch nuôi cấy: 13-15%.
Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh
khối rất lớn sau 1 thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp
này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia
thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái phát triển.Tế bào chỉ già
khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa.
Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hượng
tượng tế bào già thể hiện khá rõ.Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc
lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vệt sẹo.Vệt sẹo này sẽ không có
khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo
thời gian [6].
Nguyễn Xuân Phương - 1302

6


1.2.3. Nguồn dinh dưỡng cho nấm men
1.2.3.1. Nguồn dinh dưỡng Cacbon (C)

Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực
tiếp tinh bột, cellulose, hemicellulose.Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose,
fructose, maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose,
melibiose.Ngoài ra những dạng liên kết với COଶ đều cần thiết cho nấm men như
axit pyruvic, axit cacbonic và các axit hữu cơ khác [6].
1.2.3.2. Nguồn dinh dưỡng Nito (N)
Nguồn nito cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những
hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ.Nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nito
chính là muối amoni: amoni sulfat, phosphate, muối axetat, malat,…Nấm men
tiêu hóa tốt axit amin tự nhiên, các nucleotide purin, pyrimidin, protein, một số
amin, còn pepton kém hơn và không sử dụng protein.Các axit amin đóng vai trò
là nguồn dinh dưỡng nito và cacbon.Nấm men chỉ sử dụng axit amin dạng tự
nhiên.Hàm lượng nito phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí,
chủng loại nấm men [5].
1.2.3.3. Chất vô cơ
Các nguyên tố vô cơ rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho là cần thiết
nhất, tiếp đến là kali, magie, lưu huỳnh,…
Phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các
nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphate, phospholipid,…Các hợp chất
phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là
trao đổi chất hydrocacbon trong vận chuyển năng lượng.Trong phòng thí nghiệm
vi sinh người ta thường dùng muối KHଶ POସ và K ଶ HPOସ làm nguồn P và K.
Nguyễn Xuân Phương - 1302

7


Lưu huỳnh có trong protein và Co - enzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá
hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp enzyme, protein. Trong môi trường nuôi cấy
nấm men thường có (NHସ )ଶ SOସ làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Nguyên

tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như: mangan, đồng, sắt,
kẽm,… [6].
1.2.3.4. Vitamin
Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm
men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám
(cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme, rỉ đường. Trong
các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở quy mô nhỏ có
thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải, cải bắp, cà chua, khoai tây,… làm
nguồn vitamin bổ sung vào môi trường [6].
1.2.4. Khả năng hấp thụ Selen của nấm men
Trong quá trình nuôi cấy, hầu như tất cả Selen sẽ thay cho lưu huỳnh trong
các axit amin chứa lưu huỳnh (ví dụ methionine) từ đó hình thành
Selenomethionine. Do sự tương đồng với lưu huỳnh trong methionine,
Selenomethionine trở thành một phần của protein trong nấm men. Nhờ cách này
mà Selen trong nấm men có giá trị dinh dưỡng, mang lại nhiều lợi ích cho động
vật và con người.
Selen trong nấm men giàu Selen có thể được hấp thụ thông qua các kênh
hấp thụ axit amin và peptide nên hấp thụ cao hơn so với Selen vô cơ, nâng cao
hiệu quả của Selen, giải quyết vấn đề thiếu thụ Selen.Các thành phần hóa học
chính của Selen trong nấm men selen là: Selenomethionine, Selenocystein,
Selnocystine.
Nguyễn Xuân Phương - 1302

8


1.3.

Khái quát về nấm men giàu Selen

1.3.1. Khái niệm nấm men giàu Selen
Nấm men giàu Selen là một dạng thực phẩm hữu cơ có chứa Selen và nó
đóng vai trò quan trọng đối trong dinh dưỡng của con người và động vật.Trong
những điều kiện thích hợp, nấm men sẽ tích lũy Selen vô cơ, và kết hợp chúng
thành các hợp chất hữu cơ trong quá trình nuôi cấy. Lượng Selen hữu cơ có thể
đạt đến 2000 ppm.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu các sản phẩm nấm men giàu Selen
Ở Nhật Bản, Yamada Koichi (1977) đã nuôi cấy Saccharomyces uvarum,
nhiệt độ 30°C trong 3 ngày ở môi trường Malt có nồng độ Selen 10 µg/ 1ml môi
trường, đã thu được những nấm men có hàm lượng Selen 2000 µg/1g sinh khối
khô. Waptanabe (1980) đã nuôi cấy S. cerevisiaeở 26°C, điều kiện hiếu khí,
trong môi trường chứa Selen, sinh khối thu được có độc tính thấp, sản phẩm
được dùng để phòng bệnh thiếu Selen cho gà.Ở Trung Quốc, Huang Xiang Xian
và cộng sự (1988) đã nuôi cấy nấm men S.cerevisiae trong môi trường có từ 3-10
µg selen/1ml, ở 28°C trong 24 giờ, đã thu được những sinh khối nấm men có
hàm lượng từ 935 – 1100 µg selen/1g sinh khối khô [15].
Ở Đức, Pháp, Canada, nhiều hãng đã thành công trong việc nuôi cấy nấm
men giàu Selen để làm thuốc cho người hoặc dùng cho chăn nuôi.Người ta đã
nghiên cứu và xác định nấm men giàu Selen có thành phần chủ yếu là
Selenomethionin. Nguyên liệu nấm men giàu Selen có mặt trong khá nhiều chế
phẩm thuốc được dùng để dự phòng và điều trị các bệnh ung thư, tim mạch,
phòng chống lão hóa,… Những chế phẩm thuốc đó là:
Tại Đức có Protecton với thành phần: vitamin C: 500 mg, vitamin E:
400IU, β-Caroten: 15mg, selen trong nấm men: 50µg.Ở Pháp, Celnium là dạng
Nguyễn Xuân Phương - 1302

9


men bia nuôi trong môi trường đặc biệt chứa Selen. Thuốc được sử dụng để thay

đổi cơ địa cho bệnh nhân.
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có rất nhiều chế phẩm chống oxy hóa
chứa Selen, chủ yếu ở dạng viên nang mềm, ngoài ra nó cũng được bào chế ở
dạng viên nén, thuốc tiêm.Trong các chế phẩm này, Selen thường dưới dạng hữu
cơ trong nấm men. Chưa dừng lại ở thuốc, nấm men giàu Selen còn được bổ
sung vào thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản dưới dạng men tiêu hóa, thuốc thú
y,…
1.3.3. Ứng dụng và công dụng của nấm men giàu Selen
Selen của nấm men là Selen hữu cơ nên không có độc tính như Selenite vô
cơ.Selen vô cơ rất độc hại, có thể ảnh hưởng đến hệ thành kinh trung ương.
Việc bổ sung nấm men giàu Selen đã được chứng minh là có lợi cho nhiều
loài động vật, đặc biệt là ở trạng thái miễn dịch của động vật sinh trưởng và sinh
sản, năng suất. Điều này không những giúp vật nuôi khỏe hơn mà còn tăng được
chất lượng thịt, sữa, trứng.Từ đó mang lại lợi ích kinh tế cho các nhà chăn
nuôi.Selen hữu cơ được cung cấp từnấm men giàu Selen đã cho thấy sự khác biệt
về tính khả dụng sinh học và sự trao đổi chất so với các dạng selen vô cơ
[30].Selen hữu cơ từ nấm men và Selen vô cơ đều giúp tăng sức đề kháng, nâng
cao khả năng khử các phân tử gây oxi hóa,bệnh tật và Selen hữu cơ lại có tính
hấp thụ, chuyển hóa cao hơn Selen vô cơ; chưa kể đến làm ô nhiễm môi trường
ít.Bổ sung Selen vào chế độ ăn uống bằng cách sử dụng các sản phẩm chứa nấm
men giàu Selen sẽ giúp chống lại oxy hóa. Hơn nữa, nấm men giàu Selen đã
được sử dụng trong hàng loạt các nghiên cứu nhằm đánh giá tầm của quan trọng
của Selen trong sự tiến triển của một loạt các bệnh truyền nhiễm và thoái hóa
[26].Đã có một thử nghiệm ngẫu nhiên ở cả nam lẫn nữ, với những người có
Nguyễn Xuân Phương - 1302

10


HIV dương tính. Việc bổ sung nấm men giàu Selen hằng ngày đã cho thấy được

sự ngăn chặn quá trình tiến triển của virut HIV-1 [21]. Selen trong nấm men đã
làm giảm sự tiến triển của bệnh HIV, tình trạng Selen thấp đã cho thấy nó có liên
quan đến sự gia tăng lây nhiễm HIV [13]. Ngoài virut HIV thì còn có virut cúm,
virut Coxsackie B (liên quan đến bệnh tim, keshan,…) [15]. Chính vì tác dụng
oxy hóa, hỗ trợ rất nhiều cho sức khỏe mà nấm men giàu Selen được sử dụng
trong rất nhiều lĩnh vực như dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, chăn nuôi,…
1.4.

Khái quát về cao nấm men

1.4.1. Cao nấm men và nấm men tự phân
Cao nấm men (hay chiết xuất nấm men) là tên gọi phổ biến cho các hình
thức khác nhau của sản phẩm chế biến từ nấm men, mà khi đó nấm men được
chiết bằng cách loại bỏ thành tế bào và giải phóng các chất bên trong, phân giải
chúng thành một hỗn hợp nhỏ hơn, giàu dinh dưỡng. Phần còn lại, không bị phân
hủy bởi enzyme sẽ được thủy phân, tách ra nhờ thiết bị ly tâm và loại bỏ.Phần
chiết xuất tách ra sẽ được đem sấy thành dạng sệt hoặc dạng bột [16].
Theo Eurasyp, thành phần chính của cao nấm men gồm: (tính theo vật chất
khô),gồm có: Protein chiếm 50 – 70%; Đạm amin: 3- 5,2%; Carbohydrate tổng
số: 4 – 13%; Lipit: tồn tại với hàm lượng thấp, muối có hoặc không có tùy vào
mục đích sử dụng. Ngoài ra, trong cao nấm men còn chứa nhiều vitamin như
vitamin Bi, B2, B5, B12, Panthonic axit, Inositol, Niacin, Biotin, Folic axit,…
Tự phân là hiện tượng khi ta cho những tế bào còn sống và những tế bào
đã chết nhưng còn tươi nguyên của động vật, thực vật sống vào một môi trường
nhất định thì các thành phần bên trong tế bào sẽ tự tác dụng với axit và bị phân
hủy thành các phân tử nhỏ li ti, các axit amin, chất đường, nucleotide… thấm
qua thành tế bào và đi ra bên ngoài.
Nguyễn Xuân Phương - 1302

11

Quá trình tự phân của nấm men là quá trình xảy ra khi tế bào nấm men đã
chết, vách tế bào không còn khả năng tự bảo vệ và sẽ bị phá hủy bởi chính các
enzyme ở trong tế bào. Lúc này các chất ở trong tế bào chất như protein,
nucleotide, …cũng sẽ bị chính hệ thống enzyme này tấn công và phá hủy.
Cao nấm men được sản xuất bằng phương pháp tự phân, ngoài việc gồm
các phần nhỏ li ti thì còn chứa rất nhiều chất dinh dưỡng tốt cho cơ thể như
vitamin, các loại muối khoáng.
Quá trình tự phân chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau: pH, nhiệt
độ và thời gian.Nấm men có khả năng tự phân trong pH từ 4-6, nhưng thường sẽ
được tự phân ở pH 5.5. Nhưng ở điểm pH này dung dịch tự phân dễ nhiễm
khuẩn. Chính vì vậy người ta thường thêm Ethyl acetat và Chitosan để ngăn cản
vi khuẩn phát triển [33].Thời gian tự phân thích hợp là từ 15-24 giờ [11].
Nhiệt độ: Nấm men tự phân ở nhiệt độ dưới 50°C. Nhiệt độ tối ưu là 45°C
[18, 34], ở nhiệt độ quá cao thì quá trình tự phân không tốt, điều này có thể do
enzyme bị biến tính ở nhiệt độ cao.
Bảng 1.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả thủy phân nấm men
[29,16, 24].
Hiệu quả tự phân (%)
Nhiệt độ
45
48
51
54

Nấm men bánh mì

Nấm men bia

47.5
48.6
50.3
41.1

49.6
49.2
47.3
39.4

Để kết thúc quá trình tự phân thì nhiệt độ sẽ được tăng lên làm enzyme
mất hoạt tính, thanh trùng, đồng thời loại bỏ khí sinh ra trong quá trình tự phân.
Nguyễn Xuân Phương - 1302

12


Hiện nay, người ta sử dụng enzyme bổ sung thêm vào để làm quá trình thủy
phân tốt hơn, nhanh hơn.
1.4.2. Ứng dụng của cao nấm men
1.4.2.1. Làm thức ăn chăn nuôi
Viện Chăn nuôi đã nghiên cứu thành công chế biến nấm men thải của quá
trình sản xuất bia ở Việt Nam thành dạng bột có chất lượng cao, hàm lượng
protein 47 – 48% với sức có mặt đầy đủ của các loại axit amin không thay thế.
1.4.2.2. Nguyên liệu trong thực phẩm, thực thẩm chức năng, dược phẩm
Khi sản xuất các loại nước chấm, cao nấm men có thể làm tăng vị Umami,
bổ sung thêm đạm (1% cao nấm men sẽ làm tăng thêm 1 độ đạm), khử vị chát
của muối, khử mùi khó chịu của cá trong nước mắm,… Hay chúng được sử dụng
ở dạng bột hoặc dạng sệt để bổ sung vào mì gói, hạt nêm, thông thường từ 1 10% khối lượng gói gia vị để nước súp ngon hơn và giống vị nước xương hơn.
Đưa chiết xuất nấm men vào các loại nước giải khát như nước ép trái cây,

nước ngọt, cà phê, trà…với nồng độ 0,05 – 0,2% sẽ giúp tăng vị ngon, vị béo,
kéo dài hậu vị.
Ngoài ra, các nhà sản xuất dược phẩm còn sử dụng cao nấm men trong
việc sản xuất thuốc giúp trị tiêu chảy, ăn ngon miệng, xóa mụn trứng cá kinh
niên, cung cấp vitamin B cho cơ thể. Cao nấm men giúp hoạt tính của các
enzyme trong đường ruột để giảm các triệu chứng tiêu chảy như các hoạt tính
disaccharidase, saccharidase, maltase và lactase. Cao nấm men chứa nhiều
chromium giúp tăng hoạt động của insulin, rất tốt cho các bệnh nhân tiểu đường.
1.4.2.3. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Nguyễn Xuân Phương - 1302

13


Cao nấm men còn là nguồn bổ sung các chất dinh dưỡng trong môi trường
nuôi cấy vi sinh.Cao nấm men rất giàu đạm, vitamin và các hợp chất kích thích
sinh trưởng. Do đó nó được sử dụng như một thành phần của môi trường nuôi
cấy vi sinh và thường dùng nuôi cấy các vi sinh vật sản xuất kháng sinh, dược
phẩm, vitamin, axit hữu cơ và probiotic [11].
1.5.

Các phương pháp phân tích Selen

1.5.1. Phương pháp phân tích khối lượng
Chuyển những hợp chất Selenat (SeOସ ଶି ), Selenit (SeOଷ ଶି ) trong các mẫu
thử về Selen, nguyên tố kết tủa đỏ bằng các chất khử như: khí sulfuro, ion sắt(II),
ion đồng(I), thioure; thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô rồi đem cân khối lượng và tính
kết quả. Có thể cho Selen tác dụng với thuốc thử O-diamino thơm tạo phức
Piazoselenol kết tủa, thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô, cân và tính kết quả [1, 2, 12].

1.5.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Selen được nguyên tử hóa chuyển thành các nguyên tử tự do ở dạng hơi.
Các nguyên tử tự do ở trạng thái cơ bản được kích thích bằng năng lượng của
ánh sáng, ngọn lửa, lò, tia lửa điện, hồ quang… sẽ chuyển sang trạng thái kích
thích. Từ trạng thái kích thích khi chuyển về trạng thái cơ bản các nguyên tử sẽ
phát ra các bức xạ có bước song λ = 196,1 nm. Hàm lượng Selen trong mẫu tỷ lệ
với cường độ bức xạ và tuần theo định luật Lambert – Beer – Buger [14].
1.5.3. Phương pháp huỳnh quang Rơnghen.
Phương pháp huỳnh quang Rơnghen xác định theo vạch Kα. Khi tiến hành
xác định trên máy Philips với ống W, Mo và LiF, chất chuẩn ngoại là keo Cu-Se.
Độ nhạy phép xác định đạt cỡ 0,3µg/5g mẫu. Để tăng độ nhạy, Se được tách ra
dạng nguyên tố dùng chất khử là 4,5 diamin – tiopyrramidin trong etanol hay
Nguyễn Xuân Phương - 1302

14


HCl 5N và NaI. Nguyên tố Se sau đó được kết tủa trên một màng lọc, giới hạn
phát hiện đạt được là 140mg/g mẫu.
Se cũng được xác định trực tiếp khi có mặt Sb, Zn, As, Ge, Cu trên máy
đo phổ huỳnh quang với anot W (20mA, 50kV) và tinh thể LiF. Độ nhạy phép
xác định là 1 µg [31].
1.5.4. Phương pháp huỳnh quang nguyên tử.
Ngoài ra, Thomson đã nghiên cứu xác định As, Se, Sb, Te với chất khử
NaBH4pha trong NaOH nồng độ 0,5%, khí hidrua sinh ra được dẫn trực tiếp vào
ống cuvet Pyrex được treo vào một cái giá, giới hạn phát hiện của phương pháp
là 0,06 đến 0,1 ng/ml [25].

Nguyễn Xuân Phương - 1302

15


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy, dụng cụ và thiết bị

2.1.1. Vật liệu và môi trường nuôi cấy
Vật liệu:
Các chủng nấm men Saccharomyces carlsbergensis vàSaccharomyces
cerevisaedo Trung tâm Visinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm
cung cấp.
Môi trường nuôi cấy:
-

Môi trường YM có thành phần gồm (g/l): Cao Malt: 3; Cao nấm

men: 3; Glucose: 10; Peptone: 5; pH: 7.0 ÷ 7.2. Thanh trùng môi trường ở
121°C trong 15 phút.
- Môi trường Malt:
Chuẩn bị nước Malt qua các bước như sau:Cân 1 kg Malt đã được nghiền
nhỏ (xay vỡ), đun cùng 4 lít nước. Đun sôi trong ở 45°C trong 15 phút. Sau đó
tăng nhiệt độ lên 52°C và giữ ở nhiệt độ như vậy trong 30 phút. Sau 30 phút tăng
nhiệt độ lên 62-65°C và tiếp tục đun 60 phút. Hết 60 phút, ta tăng nhiệt độ lên
70°C và giữ trong 30 phút. Sau đó lọc bằng vải lọc, rồi dùng 0,5-1 lít nước sôi để
rửa lại. Kết thúc quy trình, ta sẽ thu được 4,5-5 lít dịch Malt, lúc này đun sôi 10
phút.
Xác định lượng chất khô hòa tan (Bx): Bằng thiết bị Khúc xạ kế (hoặc
Chiết quang kế hoặc Bx kế), căn cứ vào mức vạch bao nhiêu thì độ Bx bấy

nhiêu. Hàm lượng chất khô hòa tan càng cao thì độ khúc xạ càng lớn nghĩa là Bx
càng lớn. Độ Bx của nước = 0. Riêng trường hợp dung dịch malt chiếm chủ yếu
là hàm lượng đường hòa tan vì vậy cần căn cứ vào Bx của dung dịch Malt để xác
định độ đường.
Nguyễn Xuân Phương - 1302

16


- Môi trường Malt 5°Bx:
Thanh trùng môi trường Malt 5°Bx ở 121°C trong 15 phút.
- Môi trường Malt 10°Bx:
Chuẩn bị nước Malt 10°Bxtương tự như các bước như khi chuẩn bị môi
trường Malt 5°Bx.Xác định lượng chất khô hòa tan bằng thiết bị Khúc xạ kế. Sau
khi pha được môi trường Malt 10°Bx thì thanh trùng môi trường Malt 10°Bx ở
121°C trong 15 phút.
- Môi trường Glucose dinh dưỡng(g/l): Glucose: 100; Ure: 21,7;
NH4H2PO4: 4;KH2PO4: 3. Thanh trùng môi trường ở 118°C trong 15
phút.
2.1.2. Hóa chất
- Cao Malt.

- NaOH 5M.

- Cao nấm men.

- Nước deion.

- Glucose.

- HNO325%.

- Na2SeO3.

- KCl 0.1N.

- Pepton.

- HCl 2 M và HCl 0.1 N.

- Ure.

- Đệm pH2 gồm HCl 0.1N KCl

- NH4H2PO4.

0.1N.

- KH2PO4.

- KI 2%.

- HNO3 đặc.

- Tinh bột 1%.

- H2O230%.

-

Dung dịch Na2SeO3

-

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Máy so màu (UV-1650PC, Shimadzu, Nhật).
- Máy đo pH (Toledo, Anh).
Nguyễn Xuân Phương - 1302

17