Nghiên cứu đặc tính zymocin của nấm men moniliella sp SS4 2

VIỆN
N ĐẠI
Đ HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG
NGH
NGHỆ ----SINH HỌC
-----------

------

KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆ
ỆP
Đề tài:

Nghiên cứ
ứu đặc tính zymocin của nấấm
men Moniliella sp. SS4.2

Người hướ
ớng dẫn
Sinh viên
Niên khóa

: PGS. Vũ Nguyên Thành
: Phạm Mai Hương
: K19 – Lớp 1203 - CNSH

Hà Nội - 2016

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này
là trung thực. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa
luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong Khóa luận này
đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 24tháng 5năm 2016
Sinh viên

Phạm Mai Hương

Phạm Mai Hương

i

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Vũ Nguyên Thành, người đã
tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành

đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh
vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn nhiệt tình giúp đỡ,
tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt công việc.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô khoa Công nghệ Sinh Học,
Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, dìu dắt em trong suốt thời
gian học tập.
Cuối cùng,em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân,
bạn bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm
quen với công tác nghiên cứu khoa học.

Hà Nội, ngày24tháng5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Mai Hương

Phạm Mai Hương

ii

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii

MỤC LỤC .................................................................................................... iii
DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. NẤM MEN MONILIELLA ...................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm men Moniliella ........................................... 3
1.1.2. Moniliella sp. SS4.2 .......................................................................... 5
1.2. ZYMOCIN .............................................................................................. 6
1.2.1. Khái quát về zymocin ........................................................................ 6
1.2.2. Đặc điểm của zymocin ...................................................................... 8
1.2.3. Bản chất và cấu trúc của zymocin .................................................... 10
1.2.4. Vai trò và ứng dụng của zymocin .................................................... 11
1.2.5. Tình hình nghiên cứu zymocin trên thế giới .................................... 12
1.2.6. Tình hình nghiên cứu zymocin ở Việt Nam ..................................... 14
1.3. THU HỔI VÀ TINH CHẾ PROTEIN ................................................... 15
1.3.1. Phương pháp kết tủa ........................................................................ 15
1.3.1.1. Kết tủa bằng muối ammonium sulfate ....................................... 16
1.3.1.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ............................................. 16
1.3.2. Phương pháp sắc ký ......................................................................... 17
1.3.2.1. Sắc ký lọc gel ............................................................................ 17
1.3.2.2. Sắc ký trao đổi ion ..................................................................... 18
1.3.2.3. Sắc ký tương tác kỵ nước .......................................................... 18

Phạm Mai Hương

iii

Niên khóa: K19 – Lớp 1203

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

1.3.2.4. Sắc ký ái lực .............................................................................. 18
1.3.2.5. Sắc ký lỏng cao áp ..................................................................... 19
1.3.3. Phân tách protein bằng điện di SDS-PAGE ..................................... 19
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU ..................................................................... 21
2.1.1. Đối tượng ........................................................................................ 21
2.1.2. Vật liệu ............................................................................................ 21
2.1.2.1. Hóa chất .................................................................................... 21
1.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ................................................. 22
1.2.3. Thành phần môi trường dùng trong nghiên cứu ............................... 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 24
2.2.1. Nghiên cứu tinh chế zymocin .......................................................... 24
2.2.1.1. Cô đặc mẫu ................................................................................ 24
2.2.1.2. Kết tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ............................... 24
2.2.1.3. Sắc ký tương tác kỵ nước .......................................................... 25
2.2.1.4. Sắc ký trao đổi ion ..................................................................... 25
2.3.2. Phương pháp phân tích .................................................................... 26
2.3.2.1. Thử hoạt tính zymocin bằng phương pháp đục lỗ thạch ............. 26
2.3.2.2. Phương pháp điện di SDS-PAGE .............................................. 26
2.3.3. Khả năng bền nhiệt của zymocin sau tinh chế.................................. 28
2.3.4. Khả năng bền pH của zymocin sau tinh chế..................................... 29
2.3.5. Khả năng chịu kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae SBY
2576 theo thời gian.................................................................................... 31
PHẦN 3: KẾT QUẢ .................................................................................... 32

3.1. TINH CHẾ ZYMOCIN TỪ MONILIELLA sp. SS4.2............................ 32
3.1.1. Cô đặc mẫu...................................................................................... 32
3.1.2. Kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 ................................................. 32
3.1.3. Sắc ký tương tác kỵ nước ................................................................ 34
3.1.4. Sắc ký trao đổi ion ........................................................................... 37
Phạm Mai Hương

iv

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ZYMOCIN DO CHỦNG
MONILIELLA sp. SS4.2 SINH RA .............................................................. 40
3.2.1. Khả năng bền nhiệt của zymocin sau tinh chế.................................. 40
3.2.2. Khả năng bền pH của zymocin sau tinh chế..................................... 45
3.2.3. Khả năng chịu kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae SBY
2576 theo thời gian.................................................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 53

Phạm Mai Hương

v

Niên khóa: K19 – Lớp 1203

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

ITS:

Internal transcribed spacer

DEAE

Diethylaminoethyl

FPLC

Fast Protein Liquid Chromatography

Rpm

Revolutions per minute (tốc độ quay trong một phút)

SDS- PAGE

Sodium docetyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

APS

Ammonium persulfate

TEMED

N,N,N’,N’-tetramethylene-ethylenediamine

YPD

Yeast peptone dextrose

kDa

Kilo Dalton

Phạm Mai Hương

vi

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Những loài nấm men mà hoạt tính zymocin đã được công bố.
Bảng 2. Lượng muối (NH4)2SO4 cần bổ sung để đạt được nồng độ
bão hòa từ 30-50 %.
Bảng 3. Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl 1 M/ KOH 1 M cần
bổ sung vào 500 µl dịch zymocin gốc.
Bảng 4. Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl 1M/ KOH 1 M cần
bổ sung vào 500 µl dịch zymocin sau tinh chế.
Bảng 5. Một số hình ảnh về khả năng chịu kháng sinh zymocin do
Moniliella sp. SS4.2 sinh ra của chủng mẫn cảmSaccharomyces
cerevisiae SBY 2576 tại các mốc thời gian khảo sát

Phạm Mai Hương

vii

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:Cây phả hệmô tả mối quan hệ giữa Moniliellasp. SS4.2 và các
nhóm phân loại trong cùng chi.
Hình 3.1: Hoạt tính zymocin sau khi lọc cross flow qua màng 5 kDa.
Hình 3.2: Hoạt tính dịch zymocin gốc và các phân đoạn sau khi kết tủa bằng
muối (NH4)2SO4.
Hình 3.3: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% các phân đoạn sau

khi kết tủa zymocin bằng muối (NH4)2SO4.
Hình 3.4: Sắc ký đồ tương tác kỵ nước trên cột HIC ở pH 7 mẫu zymocin các
phân đoạn kết tủa muối nồng độ 30%, 40%, 50% bão hòa.
Hình 3.5: Hoạt tính mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký
tương tác kỵ nước trên cột HIC.
Hình 3.6: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12 % mẫu E1 và E2 thu
được sau khi tinh chế bằng sắc ký tương tác kỵ nước trên cột HIC.
Hình 3.7: Sắc ký đồ trao đổi ion trên cột DEAE ở pH 8 mẫu zymocin sau khi
tinh chếtrên cột HIC.
Hình 3.8: Hoạt tính mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký trao
đổi ion trên cột DEAE.
Hình 3.9: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12 % mẫu E1 và E2 thu
được sau khi tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE.
Hình 3.10:Độ bền nhiệt của zymocin gốc tại các nhiệt độkhác nhau.
Hình 3.11: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% khả năng bền nhiệt
của zymocin gốc ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.12:Độ bền nhiệt của zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử tại các nhiệt
độ khác nhau.

Phạm Mai Hương

viii

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Hình 3.13: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% khả năng bền nhiệt
zymocin zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử.
Hình 3.14:Độ bền nhiệt của hai cấu tử sau khi gia nhiệt tại các nhiệt độ khác
nhau và được trộn theo tỷ lệ 1:1.
Hình 3.15: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% cấu tử một – 20,7
kDa được gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.16: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% cấu tử hai – 16,6
kDa được gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.17:Độ bền pH của zymocin gốc.
Hình 3.18:Độ bền pH của zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử.

Phạm Mai Hương

ix

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học
MỞ ĐẦU

Trong chế biến thực phẩm có nhiều phương pháp để tiêu diệt và hạn chế
hoạt động của vi sinh vật, trong đó việc bảo quản bằng các chất hóa học được
sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên việc lạm dụng như dùng quá liều lượng quy
định hoặc dùng những hóa chất không được phép sử dụng gây nguy hiểm cho
người tiêu dùng. Vì vậy, những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, đảm
bảo an toàn vệ sinhthực phẩm rất được quan tâm và đang được nghiên cứu sử
dụng rộng trong công nghệ thực phẩm và một trong số đó là “Zymocin”.

Zymocin là chất do các tế bào nấm men và nấm mốc tiết ra để chống lại
các loài nấm men và nấm mốc khác trong quá trình cạnh tranh, zymocin có
thể được ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp để bảo vệ các quá trình lên
men khỏi sự xâm nhiễm và phá hoại của các loài nấm men hoang dại. Ngoài
ra zymocin còn có thể ứng dụng trong bảo quản nước hoa quả và các sản
phẩm khác khỏi sự gây hư hỏng bởi nấm men và nấm mốc để thay thế cho các
chất bảo quản có bản chất hóa học có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người.
Trong y học, zymocin có thể được sử dụng nhằm chống nhiễm trùng đường
tiêu hóa, đường sinh dục và da bởi các nấm men gây bệnh, đặc biệt trong
trường hợp điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân AIDS.
Cho tới nay, đã có trên dưới 80 loài nấm men có hoạt tính zymocin đã
được công bố. Trong số đó chỉ có một vài loài là có tiềm năng ứng
dụng.Zymocin là một loại kháng sinh mới được các nhà nghiên cứu khoa học
trên Thế giới rất quan tâm. Vì vậy tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu zymocin do chủng
Moniliella sp. SS4.2 sinh ra.Qua nghiên cứucho thấy hoạt tính zymocin do
chủng Moniliellasp. SS4.2 sinh ra bao gồm hai cấu tử có khối lượng phân tử
lần lượt là 20,7 kDa và 16,6 kDa. Tuy nhiên, kháng sinh zymocin do chủng
này sinh ra lại chỉ biểu hiện hoạt tính khi có mặt đồng thời của cả hai cấu tử
còn khi tách riêng rẽ hai cấu tử thì không sinh hoạt tính. Chính điều này đã
Phạm Mai Hương

1

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

làm nên sự khác biệt và mới mẻ của zymocin do chủng Moniliellasp. SS4.2
sinh ra.Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính
zymocin của nấm men Moniliella sp. SS4.2”với mục đích tiếp tục tinh chế
riêng rẽ 2 cấu tử và bước đầu xác định một số đặc tính của zymocin sau tinh
chế như khả năng bền nhiệt, khả năng bền pH để phục vụ cho việc ứng dụng
loại kháng sinh mới này vào bảo quản các sản phẩm nước hoa quả, các loại đồ
uống được chế biến từ trái cây...

Phạm Mai Hương

2

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NẤM MEN MONILIELLA
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm men Moniliella
Nấm men Moniliellađược biết đếnvào khoảng đầu thế kỉ 20 là một nhóm
phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng phương
thức nảy chồi. Tuy nhiên, nấm men Moniliella là một loại nấm rất khó để
nhận dạng, vì vậy những hiểu biết về chúng vẫn chưa được hoàn chỉnh.
Nấm men Moniliellalần đầu tiên được miêu tả năm 1966 với hai loài là
M.acetoabutens vàM. tomentosa (Stolk & Dakin, 1966). Tiếp theo là hai loài
M.suaveolensvàM.mellis, được tìm ra bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog

(1975). Năm 1984, De Hoog & Gue'ho đề xuất tổ hợp loài mớiMoniliella pollinis
cho M. tomentosavar. pollinis dựa trên cơ sởsự khác biệt về sinh thái, hình thái và
sinh lý và sự khác biệt rõ rệt trong tỉ lệ (G + C) của DNA. Năm 2009, Rosa và
cộng sự cho rằng Moniliella và Trichosporonoides (Haskins & Spencer, 1967) có
thể xếp vào cùng một chi và do vậy bốn tổ hợp loài M.megachiliensis,
M.nigrescens, M.oedocephalis, M.spathulata và một loài mới M.fonsecae được đề
nghị. Tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã
công bố ba loài mới là M.carnis, M.dehoogii (Thanh et al, 2012) và M.byzovii
(Thanh et al, 2013). Năm 2014, Wang và cộng sự đã phân tích dựa trên trình tự
của sáu gen bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ (18S), đoạn D1/D2 của rDNA 26S, vùng
ITS bao gồm rDNA 5.8S, hai tiểu đơn vị của RNA polymerase II (RPB1 và
RPB2) và các nhân tố dịch mã 1-α (EF1-α). Các nhà phân tích đã chỉ ra rằng
Malassezia và Moniliella là hai lớp mới trong Ustilaginomycotina, chúng có
mối quan hệ họ hàng với Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes. Và được
sắp xếp theo trật tự: lớp Moniliellomycetes, bộ Moniliellales, họ
Moniliellaceae, chi Moniliella [9]. Như vậy cho tới nay chi Moniliella gồm
12 loài:

Phạm Mai Hương

3

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin

Moniliella byzovii Thanh, Hien & Thom
Moniliella carnis Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance
Moniliella dehoogii Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance
Moniliella fonsecae Rosa, Nakase, Jindamorakot, Limtong, Lachance,
Fidalgo-Jimenz, Daniel, Pagnocca, Inacio & Morais
Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance
Moniliella mellis Rao & dehoog
Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance
Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance
Moniliella pollinis De Hoog & Gueho
Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance
Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx
Phân bố: các loài thuộc chi Moniliella thường phân bố ở những nơi có
nồng độ đường cao (mật ong, phấn hoa...) hoặc nơi có nhiều dầu mỡ...
Đặc điểmhình thái: Khuẩn lạc lúc đầu màu kem, sau chuyển sang màu
xám đen hoặc đen oliu hoặc có thể màu xám hay xanh. Các chuỗi hướng ngọn
của các bào tử đính dạng chồi được tạo thành từ các gai nhỏ. Đôi khi xuất
hiện bào tử áo hình chùy, có vách dày. Có khi xuất hiện sợi giả. Tế bào hình
elip đến hơi trụ, có lỗ vách. Khuẩn ty phân nhánh, đường kính 2-6 µmmàu
xanh lục, đứt gãy nhiều tạo thành các đốt ngắn [5].
Đặc điểm sinh lý:sinh trưởng chậm. Có khả năng lên men đường, tổng
hợp các polyol đặc biệt là erythritol và glycerol. Ngoài ra chúng cũng đồng
hóa được các polyol như mannitol, erythritol, sorbitolsau 5 ngày nuôi cấy,
riêng inositol thì chúng không có khả năng đồng hóa hay lên men [5].

Phạm Mai Hương

4

Niên khóa: K19 – Lớp 1203

Viện Đại học Mở Hà Nội
N

Khoa Công ngh
nghệ Sinh học

Đặc tính sinh sản:
n: sinh ssản vô tính bằng nảy chồi,i, không hình thành nang bào
tử, xuất hiện bào tử đốt,
t, cho đến nay chưa phát hiện được hình thứ
ức sinh sản hữu
tính [5].
Một số nghiên cứu
u về
v Moniliella phân lập tại Việt Nam đượ
ợc tiến hành tại
Viện Công nghiệp Thự
ực phẩm đã cho thấy tiềm năng ứng dụng
ng trong công
nghệ như khả năng
ng chuy
chuyển hóa dầu thầu dầu thành tinh dầuu đđào, khả năng
sinh một loạii kháng sinh mới
m (zymocin), khả năng
ng sinh lipase, phosphatase và
khả năng chuyểnn hóa glucose tạo
t erythritol.
1.1.2.Moniliella sp. SS4.2

Moniliellasp. SS4.2 là m
một loài mới thuộc chiMoniliella,có
có kh
khả năng sinh
zymocin, được phân lậập từ tương, thuộc bộ sưu tập giống củaa Trung tâm Vi
sinh vật Công nghiệp,
p, Viện
Vi Công nghiệp Thực phẩm. Hình 1.1 mô tả mối
quan hệ giữa Moniliella sp. SS4.2 và các loài khác thuộcchi Moniliella
Moniliella, nhìn
vào hình cho thấy
y SS4.2 có m
mức độ sai khác trình tự gen khá llớn so với các
loài khác.

Hình 1.1: Cây phả hệmô
mô tả
t mối quan hệ giữa Moniliellasp. SS4.2 và các nhóm phân
loại trong cùng chi.Cây phân loại
lo được xây dựng dựa trên sự sai khác trình tự
t trong
đoạn
n D1/D2 LSU rRNA ssử dụng chương trình
ình MEGA 6. Phylloporia pectinata được
sử dụngnhư nhóm ngoài.
ngoài Mã số GenBank của trình tự rDNA sau tên loài. Thanh
chèn tương ứng 5% khác biệt
bi trình tự.

Phạm Mai Hương

ng

5

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Đặc điểm hình thái của chủng SS4.2: Tế bào hình trứng. Khuẩn lạc khi
còn "non" có màu trắng nhưng khi về "già" lại chuyển sang màu vàng, lục và
sau đó là nâu đen. Khuẩn lạc khô, ghồ ghề phát triển chậm trong thời gian
đầu. Hình thức sinh sản sinh dưỡng bằng cách nảy chồi và phân cắt. Pha sinh
sản hữu tính chưa phát hiện được [2].
A

B

Hình 1.2.Hình ảnh khẩn lạc và tế bào chủng SS4.2. A - Hình ảnh khuẩn lạc chủng
Moniliella sp. SS4.2 nuôi cấy trên đĩa thạch mal glucose 4°Bx; B - Hình thái tế bào
chủng SS4.2 soi ở vật kính x40.

Theo kết quả nghiên cứu của nhóm bảo tồn gen thuộc Trung tâm Vi sinh
vật Công nghiệp,Viện Công nghiệp Thực phẩm, chủng Moniliella sp. SS4.2
có khả năng sinh zymocin cao nhất khi nuôi cấy lắc trong môi trường YPD ở
28°C,180 rpm trong 72 h, pH tối ưu 3,5. Dịch nuôi cấy sau đó được ly tâm
3500 rpm trong 15 phút để thu lấy phần dịch nổi có chứa zymocin và loại bỏ
cặn tế bào.

1.2. ZYMOCIN
1.2.1. Khái quát về zymocin
Năm 1963,Makower Bevan đã phát hiện ra một số chủng của
Saccharomyces cerevisiae có khả năng sinh tổng hợp nên các protein diệt các
chủng khác cùng loài, những chủng này có khả năng tự miễn với các protein

Phạm Mai Hương

6

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

do chúng sinh ra. Các protein đặc biệt này được gọi là các killer toxin (killer
factor, zymocin, mycocin…) và các chủng nấm men tương ứng được gọi là
các chủng sinh killer (killer strains) [3].
Quá trình tổng hợp các protein có hoạt tính sinh học (killer toxin) ở S.
cerevisiae bị ảnh hưởng bởi các yếu tố của môi trường nuôi cấy như pH của
môi trường, nhiệt độ, thành phần môi trường, mức độ lắc trong quá trình nuôi
cấy và sự có mặt của các tác nhân làm ổn định môi trường.Tiếp sau đó là sự
phát hiện ra hàng loạt các chủng nấm men killer toxin khác, các chủng này
thường gặp ở cả các loài nấm men sử dụng trong công nghiệp, và nấm men
phân lập ngoài tự nhiên [2].
Killer toxin có thể có phổ hoạt động rộng chống lại nhiều loài nấm men
khác nhau, một số có tác dụng đến cả các loài nấm men của chi khác.
Hansenula saturnus CCY 38-4-2 có tác dụng diệt Zygosaccharomyces bailli

(một tác nhân làm hỏngrượu vang), Saccharomyces cerevisiae, một vài chủng
Candida albicans, C. krusei, Kluyveromyces phaffii, K. marxianus,K. fragilis,
K. lactis và một số loài Hansenula spp. Trong các trường hợp khác, hoạt lực
của các killler toxin thường có phổ hẹp và đặc hiệu hơn.
Các chủng nấm men sinh killer toxin khác nhau ở phổ hoạt động chống lại
các chủng mẫn cảm, đặc điểm của killer toxin và các yếu tố di truyền quyết
định tính trạng killer cũng như khả năng tự miễn của chúng đối với các killer
toxin. Những chủng nấm men thiếu các gen mã cho killer toxin thì thường
mẫn cảm với một hoặc nhiều killer toxin, các chủng này được gọi là các
chủng mẫn cảm (sensitive strains).
Đã có trên dưới 80 loài nấm men có hoạt tính zymocin được công bố.
Việc tìm ra các zymocin mới với nhiều đặc tính quý và khả năng ứng dụng
cao là vô cùng quan trọng.

Phạm Mai Hương

7

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Bảng 1. Những loài nấm men mà hoạt tính zymocin đã được công bố

Chi

Loài

Candida

C. dattila, C. glabrata, C. guilliermondii, C. holmii, C.
crusei, C. maltosa, C. neodendra, C. parapsilosis, C.
pseudotropicalis, C. sonorensis, Candida sp., C. sphaerica,
C. valida, C. versatilis

Cryptococcus

Cr. albidus, Cr. laurentii, Cr. podzolicus

Cystofilobasidium

Cys. bisporidii

Debaryomyces

D. hansenii, D. polymorphus, D. vanrijiae

Filobasidium

F. capsuligenum

Hanseniaspora

H. uvarum

Kloeckera

K. apiculata, K. japonica

Kluyveromyces

Kv. aestuarii, Kv. dobzhanskii, Kv. lactis, Kv. lodderae,
Kv. marxianus, Kv. phaffii, Kv. wickerhamii, Kv. wikenii

Metschnikowia

M. pulcherima

Pichia

P. acaciae, P. amethionina, P. anomala, P. antillensis, P.
bimundalis, P. cactophila, P. canadensis, P. ciferrii, P.
fabianii, P. farinosa, P. guilliermondii, P. holstii, P.
inositovora, P. jadinii, P. kluyverii, P. membranifaciens, P.
mexicana, P. minuta var. nonfermentans, P. ohmeri, P.
opuntiae, P. petersonii, P. pini, P. quercuum, P. spartinae,
P. subpelliculosa, P. thermotolerans

Rhodotorula

R. fujisanensis, R. glutinis, R. mucilaginosa, R. pallida

Saccharomyces

S. cerevisiae, S. paradoxus, S. unisporus

Sporidiobolus

Sp. johnsonii, Sp. pararoseus

Trichosporon

T. capitatum

Williopsis

W. californica, W. pratensis, W. saturnus, W. saturnus (W.
beijerinckii), W. saturnus var. mrakii, W. saturnus var.
sargentensis, W. saturnus var. subsufficiens

1.2.2. Đặc điểm của zymocin
Hiện tượng killer toxin không đặc thù cho nấm men. Quá trình tổng hợp
các protein có độc tính đặc hiệu đối với các cá thể gần gũi và khả năng miễn
Phạm Mai Hương

8

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

dịch đặc hiệu tương ứng được biết ở nấm than (Smut fungi), trùng đế giầy
(Paramecia), nấm nhầy (Slime molds) và vi khuẩn. Ở vi khuẩn các protein
này được gọi là bacteriocin, do vậy để nhấn mạnh bản chất chung của những

tương tác đối kháng này thì có thể gọi killer toxin của nấm men là zymocin và
các chủng killer là các chủng sinh zymocin.
Cho đến nay hầu hết các kháng sinh được biết đều thuộc về ba nhóm vi
sinh vật là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn (ví dụ như nhóm kháng sinh vi khuẩn
có Bacitracin của Bacillus licheniformis, polimicin của Bacillus polymixa...
nhóm kháng sinh do nấm sinh ra có cephalosporin từ Cephalosporium
acremonium. Penicillin từ Penicillium chrysogenum...nhóm kháng sinh do xạ
khuẩn có Kanamycin từ Streptomyces kanamycefius, Streptomycin từ
S.griseus...). Các kháng sinh này có thể có bản chất protein, peptide, các hợp
chất vòng... Nhìn chung phổ hoạt động của các kháng sinh này thường ít đặc
hiệu cho loài, tác dụng của chúng thường vươn ra cả các loài khác và các chi
khác.
Ngược lại với các kháng sinh kể trên, các zymocin của nấm men đã được
biết cho đến nay đều có bản chất protein và thường có tác dụng đặc hiệu,
chúng thường chỉ có tác dụng trong các chủng cùng loài với chủng sinh
zymocin tương ứng, đôi khi phổ hoạt động của chúng vươn ra cả một số
chủng có họ hàng gần gũi. Phần lớn các zymocin được biết chỉ có tác dụng
chống nấm mà không có hoạt động kháng khuẩn và kháng các nguyên sinh
động vật (ngoại trừ một vài zymocin nhất định có khả năng ức chế các vi
khuẩn Gram dương trong đó có Staphylococcus aureus). Trong nhiều trường
hợp khác khả năng sinh kháng sinh của nấm men có được là do sự thay đổi
pH môi trường, là kết quả của quá trình tổng hợp và bài tiết các acid hữu cơ
hoặc do sự hấp thụ chọn lọc và trao đổi ion với môi trường [8]. Các đặc tính
này đã tạo nên sự khác biệt đáng kể của zymocin so với các chất kháng sinh
khác.

Phạm Mai Hương

9

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Phần lớn các zymocin được mô tả cho đến nay đều có một số đặc tính
chung. Chúng thường bị bất hoạt hoàn toàn bởi nhiệt độ cao, sự xáo động quá
mức hay ở pH cao (giá trị nhiệt độ và pH này khác nhau ở các zymocin khác
nhau). Tuy nhiên bên cạnh đó vẫn có các ngoại lệ đó là trường hợp zymocin
của Hansenula mrakii IFO 0895 (về sau chủng này được phân loại lại là
Williopsis mrakii), zymocin được tiết ra bởi chủng này có khả năng chịu được
nhiệt độ cao (100ºC trong 10 phút) và pH từ 3-11. Zymocin của Hansenula
saturnus cũng có đặc tính tương tự. Hầu hết zymocin mẫn cảm với các
enzyme thuỷ phân protein [7]. Những đặc tính này chỉ ra bản chất protein của
các zymocin.
1.2.3. Bản chất và cấu trúc của zymocin
Tất cả các zymocin đã được biết đều có bản chất protein, có thể là các
protein đơn giản hoặc glycoprotein chứa từ hai tới ba cấu tử. Ở hầu hết các
nấm men, trọng lượng phân tử của zymocin nằm trong khoảng 10.000 20.000 Dalton. Ngoài ra có thể có một vài zymocin lớn hơn, chẳng hạn như
đối với zymocin ở Kluyveromyces lactis và Pichia anomala có thể có kích
thước tới hơn 100.000 Dalton (các zymocin này có bản chất glycoprotein) [8]
[14] [6].
Zymocin K1 do S. cerevisiae tiết ra là một dimer toxin được cấu tạo từ hai
chuỗi α và β polypeptid, các chuỗi polypeptide này được liên kết với nhau bởi
cầu disulfua và có chứa nhiều acid amin kị nước cũng như các acid amin
mang điện tích. Tiền chất của K1 được tổng hợp trong tế bào là một phân tử
polypeptide mạch đơn có kích thước lớn với hai cấu tử α và β được tách biệt
bởi vùng γ có độ glycosid hoá cao. Phân tử zymocin K1 hoàn chỉnh được tổ

chức từ tiền chất này gồm 4 vùng: 1 - vùng dẫn đầu N - amino; 2 - vùng α có
chức năng liên kết với các thụ quan nằm trên thành tế bào mẫn cảm và hoạt
động phá huỷ tế bào; 3 - α N - glucoside (chưa biết rõ chức năng); 4 - chuỗi β
giữ vai trò liên kết với thụ quan thành tế bào.
Phạm Mai Hương

10

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

1.2.4. Vai trò và ứng dụng của zymocin
Các quá trình lên men công nghiệp và nuôi cấy nấm men ở quy mô công
nghiệp có thể bị xâm nhiễm bởi các chủng nấm men hoang dại, đặc biệt
nghiêm trọng là trong số đó có cả các chủng nấm men sinh zymocin. Chúng
tiêu tốn cơ chất và giết chết các chủng nấm men sử dụng trong lên men. Kết
quả là các quá trình lên men bị ảnh hưởng và cho sản phẩm không đạt chỉ tiêu
chất lượng. Vấn đề này có thể được giải quyết phần nào bởi việc sử dụng
zymocin và sử dụng các chủng lên men công nghiệp có khả năng miễn dịch
với các zymocin sinh ra bởi các chủng nấm men nhiễm tạp. Các chủng nấm
men sinh zymocin và các chủng nấm men không mẫn cảm với các zymocin
đã được tạo ra bằng các kỹ thuật lai thông thường như tiếp hợp, dung hợp tế
bào chất… và đã được sử dụng trong công nghiệp rượu, bia, siro, ethanol…
Tập tính lên men của các chủng này vẫn được duy trì như các chủng bố mẹ
[13] [10].
Ở một số loại sản phẩm, nấm men làtác nhân chủ yếu gây ra hư hỏng mà

điển hình là ở các đồ uống được chế biến từ trái cây. Vốn là nơi sống tự nhiên
của nấm men, trái cây trở thành nguồn lây nhiễm nấm men chính trong quá
trình chế biến các đồ uống này. Do đó các sản phẩm có nguồn gốc trái cây bị
làm hỏng bởi nấm men là điều dễ xảy ra, ví dụ nhưđối với nước ép trái cây,
các đồ uống nhẹ có nguồn gốc từ trái cây và các đồ uống cacbonate khác. Các
đồ uống nhẹ và các đồ uống cacbonate với các đặc điểm như pH thấp, nồng
độ oxy thấp, nồng độ đường cao… đã cung cấp điều kiện sống lý tưởng và
một môi trường chọn lọc cho sự phát triển của nấm men. Nấm men có khả
năng lên men các loại đường có trong các sản phẩm này dẫn đến gây hư hỏng
sản phẩm. Đôi khi còn nguy hiểm hơn khi lượng khí chúng sinh ra trong quá
trình lên men có thể gây nổ các dụng cụ chứa đựng gây nguy hiểm cho con
người. Mặc dù đã áp dụng các quy trình sản xuất tiên tiến với các khâu kiểm
tra vệ sinh nghiêm ngặt cùng với việc sử dụng các chất bảo quản thực phẩm

Phạm Mai Hương

11

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

như acid sorbic, benzoate... sự phá hỏng sản phẩm có nguồn gốc trái cây bởi
nấm men vẫn thường xảy ra. Hơn nữa việc sử dụng các chất này trong bảo
quản nảy sinh các vấn đề mới đó là nồng độ cần thiết của các chất này đủ để
ngăn ngừa sự phát triển của các nấm men là rất cao trong khi nồng độ cho
phép của chúng trong các sản phẩm này lại chưa đủ đáp ứng được yêu cầu đó

[12].
Phần lớn các zymocin không ổn định trước sự thay đổi của nhiệt độ và
pH, tuy nhiên bên cạnh đó vẫn có các ngoại lệ chẳng hạn như zymocin của
các loại Hansenula sp. và của Williopsis mrakii. Các loài này tạo ra các
zymocin có khả năng chịu được nhiệt độ cao, khoảng pH hoạt động rộng và
có phổ hoạt động rộng chống lại nhiều loài nấm men khác nhau. Những ưu
điểm đó đã đem lại các khả năng ứng dụng hiệu quả các zymocin này trong
bảo quản thực phẩm, đặc biệt là bảo quản các đồ uống có nguồn gốc trái cây
và các đồ uống có độ đường cao khỏi sự xâm nhiễm và làm hỏng của các loài
nấm men [12].
Zymocin đa phần không phù hợp cho mục đích sử dụng như là một kháng
sinh chống nấm trong y học bởi vì chúng có bản chất là protein và thường
hoạt động ở nhiệt độ và pH thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng một số zymocin với
mục đích chống nhiễm trùng đường tiêu hoá, đường sinh dục và da bởi các
nấm men gây bệnh là khả thi. Một số nấm men tiết ra các zymocin có khả
năng tiêu diệt được các chủng nấm men gây bệnh. Các nghiên cứu sâu hơn
với mục đích ứng dụng zymocin vào y học là cần thiết. Một số zymocin là
chất cảm ứng sinh interferon. Ngoài ra các zymocin còn có hiệu lực trong việc
điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân AIDS [13].
1.2.5. Tình hình nghiên cứu zymocin trên thế giới
Trên thế giới, các nghiên cứu về zymocin chủ yếu ở các chi:
Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis,Pichia, Candida…

Phạm Mai Hương

12

Niên khóa: K19 – Lớp 1203

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính zymocin không đồng nhất giữa các loài
hay chủng, các yếu tố di truyền, các tính chất vật lý và hóa học hoặc cơ chế
tác động tới chủng nhạy cảm (Magliani et al, 1997; Schmitt và Breinig, 2002;
Schmitt và Breinig, 2006).
Zymocin được biết đến như một tác nhân kiểm soát sinh học trong ngành
công nghệ thực phẩm đặc biệt là quá trình lên men (Palpacelli et al, 1991;
Lowes et al, 2000; Ciani và Fatichenti, 2001), trong y khoa (Morace et al,
1984; Morace et al, 1989; Buzzini và Martini, 2001), và là tác nhân chống
nấm mới (Polonelli et al, 1994; Magliani et al, 2004) cũng như trong việc
thiết kế và phát triển các công cụ cho công nghệ DNA tái tổ hợp (Meinhardt
et al, 1990; Becerra et al, 2001).
Sónia da Silva và cộng sự (2007) đã tiến hành thu hồi và nghiên cứu
zymocin từ chủng Candida nodaensischo thấy zymocin do chủng này sinh ra
có khả năng đối phó với các điều kiện môi trường rất đa dạng. Zymocin do
chủng Candida nodaensis sinh ra hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 1830ºC, bị bất hoạt ở nhiệt độ 40ºC-50ºC và pH cao. Vòng vô khuẩn được thể
hiện rõ khi có mặt NaCl [11].
Langeveld và cộng sự (1998) đã nghiên cứu nhân bản gen mã hóa
zymocin và sử dụng zymocin trong đồ uống từ các chủng Williopsis mrakii
IFO 895, Hansenula saturnus IFO 117và Hansenula saturnus IFO 1466. Sử
dụng chủng Hansenula anomala IFO 569 là chủng mẫn cảm. Các chủng sinh
zymocin này được nuôi trong môi trường YNB (Yeast Nitrogen Base) 2,5%,
đường 2,5% ở 25°C, pH 5, tốc độ 300 rpm. Ly tâm để loại bỏ tế bào, phần
dịch nổi được lọc qua màng lọc vô trùng sau đó kết tủa bằng methanol. Hòa
tan kết tủa trong đệm 10 mM phosphate pH 3,4 rồi nạp vào cột S Sepharose
Fast Flow trên thiết bị FPLC. Zymocin được rửa giải bằng NaCl 1M trong
đệm phosphate10 mM pH 3,4. Các phân đoạn mang hoạt tính zymocin được

bảo quản trong đệm phosphate10 mM pH 4,4 và ở -20ºC. Zymocin do các
Phạm Mai Hương

13

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

chủng này sinh ra bền trong khoảng pH 3-9, gia nhiệt ở 80ºC, 100ºC và 120ºC
trong 10 phút thì ở 120ºC hoạt tính giảm đi nhiều nhưng chưa bị mất hoàn
toàn trong đó hoạt tính của chủng Williopsis mrakii IFO 895cao hơn so với
hai loài kia. Phổ hoạt động chống lại các loài nấm men khác: Chủng
Williopsis mrakii IFO 895 tiêu diệt được 19/26 chủng, Hansenula saturnus
IFO117 và Hansenula saturnus IFO 1466 đều tiêu diệt được 13/26 chủng
[12].
1.2.6. Tình hình nghiên cứu zymocin ở Việt Nam
Các nghiên cứu về zymocin ở Việt Nam chưa được triển khai rộng rãi và
còn nhiều hạn chế. Viện Công nghiệp thực phẩm đã thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu sinh tổng hợp chế phẩm sinh học zymocin nhằm mục đích bảo quản sơ
chế nông sản thực phẩm (nước hoa quả, đồ uống lên men)” (2003) từ các các
chủng nấm men IFO 0895 (Williopsis sartunus var mrakii), Moniliellasp.
SS4.2 và N14.1 và đã thu được các kết quả như sau:
Quá trình sinh tổng hợp zymocin của hai chủng IFO 0895 vàSS4.2 tăng
lên theo độ giàu của môi trường và đạt cao nhất ở môi trường có chứa nhiều
acid amin và vitamin (YPD).Riêng chủng N14.1 thì ngược lại, quá trình sinh
tổng hợp zymocin của chủng này đạt cao nhất ở môi trường malt 4°Bx và

maltglucose 2°Bx. Phổ hoạt động của các zymocin trên 41 chủng nấm men
khác nhau được xác định. Trong số 41 chủng thử thì chủng IFO 0895 chống
được 20 chủng chiếm gần 50%. Hai chủng còn lại có phổ hoạt động hẹp hơn,
chống 6 trong số 41 chủng được thử. Giá trị pH thích hợp cho sinh tổng hợp
zymocin của IFO 0895 là 3,4, của N14.1 là 6,5 và của SS4.2 nằm trong
khoảng 2,6 đến 4,6. Các zymocin chỉ hoạt động trong vùng pH acid [2].
Các zymocin sinh ra từ các chủng nấm men này được thử tính bền nhiệt ở
các nhiệt độ khác nhau. Đại đa số zymocin khảo sát đều tỏ ra rất mẫn cảm
dưới tác dụng của nhiệt. Tuy nhiên zymocin của SS4.2 và N14.1 tỏ ra có tính
chịu nhiệt cao. Zymocin của N14.1 hoàn toàn không ảnh hưởng bởi tác động
Phạm Mai Hương

14

Niên khóa: K19 – Lớp 1203


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ Sinh học

của các enzyme thuỷ phân protein như protease K hay tripsin trong khi đó
zymocin của SS4.2 có giảm hoạt tính. Đáng lưu ý là zymocin của N14.1 có
thể tách chiết hoàn toàn bằng dung môi ethylacetate ở pH thấp. Những đặc
điểm trên cho thấy zymocin của N14.1 không có bản chất protein trong khi đó
zymocin của SS4.2 lại có bản chất này [2].
Zymocin do chủng Moniliella sp. SS4.2 sinh ra có khả năng chịu nhiệt và
chịu pH thấp là một trong những đặc điểm hứa hẹn về khả năng ứng dụng
trong công nghệ bảo quản thực phẩm như các sản phẩm lên men, nước
quả...Vì vậyTrung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực

Phẩm đã bước đầu tiến hành nghiên cứu tinh chế zymocin do chủng
Moniliella sp. SS4.2 sinh ra.Nghiên cứu cho thấy zymocin gốc do chủng
Moniliella sp. SS4.2sinh ra có khả năng ức chế nấm men khi có mặtNaCl, khá
bền nhiệt (gia nhiệt ở 100°C trong 15 phút vẫn chưa bị mất hoạt tính hoàn
toàn), có dải pH hoạt động rộng (từ 2-9) và hoạt tính cao trong vùng pH acid,
có khả năng kết tủa bằng các dung môi hữu cơ như acetone, ethanol. Vàdịch
zymocindo chủng Moniliella sp. SS4.2 sinh ra bao gồm hai cấu tử có khối
lượng phân tử lần lượt là 16,6 kDa và 20,7 kDa. Hoạt tính kháng nấm men
của zymocin được chứng minh gây ra bởi sự có mặt đồng thời của hai cấu tử
này. Để nghiên cứu về hoạt tính zymocin do chủng Moniliellasp. SS4.2 sinh
ra đầy đủ và chi tiết hơn chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh chế và bước đầu
nghiên cứu đặc tính của zymocin sau tinh chế.
1.3. THU HỔI VÀ TINH CHẾ PROTEIN
1.3.1. Phương pháp kết tủa
Để tách chiết các proteincó thể dùng muối ammonium sulfatehoặc các
dung môi hữu cơ. Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan
của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử
protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ

Phạm Mai Hương

15

Niên khóa: K19 – Lớp 1203