Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (ness) radlk

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG
HÀN GẮN VẾT THƢƠNG CỦA PROTEASE TỪ CÂY THUỐC XUÂN
HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NESS) RADLK.

Ngƣời hƣớng dẫn : TS. VÕ HOÀI BẮC
Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ TRANG
Lớp
: 13-01

HÀ NỘI - 2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG
HÀN GẮN VẾT THƢƠNG CỦA PROTEASE TỪ CÂY THUỐC XUÂN
HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NESS) RADLK.

Ngƣời hƣớng dẫn : TS. VÕ HOÀI BẮC
Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ TRANG
Lớp

: 13-01

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.
Võ Hoài Bắc phòng Sinh hóa Thực Vật, Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp
hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mai Phương, Trưởng
phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện cho phép tôi được thực tập tại đây.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Sinh hóa
Thực vật, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm khóa luận, tôi xin
gửi lời cảm ơn sâu sắc.
Tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Viện
Đại học Mở Hà Nội, đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
luôn động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn!.
Hà nội, ngày 12 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Hoàng Thị Trang


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Mô tả thực vật cây Xuân Hoa P. palatiferum ................................... 3
1.2. Những nghiên cứu về cây Xuân Hoa P. palatiferum ........................ 4
1.2.1. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa ......................... 4
1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa ............ 5
1.2.3. Nghiên cứu về dược tính ............................................................... 6
1.3. Định nghĩa và phân loại protease……………………………..….9
1.3.1. Định nghĩa ..................................................................................... 9
1.3.2. Phân loại ........................................................................................ 9
1.4. Ứng dụng của protease ..................................................................... 10
1.5.Những nghiên cứu về protease từ thực vật và từ cây Xuân Hoa P.
palatiferum ............................................................................................... 13
PHẦN II : PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………...15
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................. 15
2.1.1. Mẫu thí nghiệm ........................................................................... 15
2.1.2. Hóa chất sử dụng......................................................................... 15
2.1.3. Máy móc, thiết bị ........................................................................ 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 15
2.2.1. Phương pháp chiết rút protease từ lá Xuân Hoa P. palatiferum . 15
2.2.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến . 16

2.2.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry ............. 18
2.2.4. Phương pháp tinh sạch enzyme .................................................. 19
2.2.5. Điện di protein...........................................................................21
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu tính chất của protease ........................ 23
2.2.7. Đánh giá tác dụng làm lành vết thương trên tế bào nguyên sợi
da người theo phương pháp của Laing............................................................25
2.2.8. Phương pháp thống kê................................................................26
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 27
3.1. Tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa P. palatiferum ........................ 27
3.2. Điện di biến tính và không biến tính protein ................................. 32
3.3. Ảnh hƣởng của một số chất ức chế đặc hiệu protease................... 34
3.3.1. Ảnh hưởng của PMSF lên hoạt tính protease ............................. 34
3.3.2. Ảnh hưởng của PCMB lên hoạt tính protease .......................... 34
3.3.3. Ảnh hưởng của HgCl₂ lên hoạt tính protease ............................. 35
3.3.4. Ảnh hưởng của O-phenanthroline lên hoạt tính protease……....35
3.4. Khả năng thủy phân của protease trên các cơ chất khác nhau .... 36
3.5. Độ bền của protease. ......................................................................... 37
3.5.1. Độ bền với nhiệt..........................................................................37
3.5.2. Độ bền với pH.............................................................................38
3.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính protease..............39
3.6. Đánh giá tác dụng làm lành vết thƣơng trên tế bào nguyên sợi da
ngƣời ............................................................................................................... 39
PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 49


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu: Tên đầy đủ

BSA: Bovine Seurum Albumin
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
OD: Optical Density
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
TCA: Tricloacetic Acid
UV: Ultra Violet
PCMB: P-chloro-mercuribenzoic acid
PMSF: Phenylmethane sulfonyl fluoride


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1. Xác định đường cong chuẩn của tyrosine ...................................... 17
Bảng 2.2. Xác định đường cong chuẩn protein ............................................... 19
Bảng 2.3: Công thức pha gel tách (12%) ........................................................ 22
Bảng 2.4: Công thức pha gel cô (5%) ............................................................. 22
Bảng 3.1: Kiểm tra hoạt tính protease của từng phân đoạn qua cột Sephadex
G-100 ............................................................................................................... 29
Bảng 3.2: Kiểm tra hoạt tính protease của từng phân đoạn qua cột DEAEcellulose ........................................................................................................... 31
Bảng 3.3: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa
P.palatiferum ................................................................................................... 32
Bảng 3.4: Hoạt tính của protease P. palatiferum trên các cơ chất khác
nhau………………………………………………………………………….36
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của P. palatiferum

protease………………………………………………………………………39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Hình

Trang

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa P. palatiferum........................................................... 3
Hình 3.1: Sơ đồ làm sạch protease từ lá cây Xuân Hoa P. palatiferum ......... 27
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn protein protease từ lá cây Xuân Hoa sau khi qua
cột lọc gel Sephadex G-100 ............................................................................ 29
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn protein protease từ lá cây Xuân Hoa sau khi qua
cột trao đổi ion DEAE- cellulose .................................................................... 30
Hình 3.4: Điện di protein các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion
DEAE- cellulose trên gel polyacrylamid 12% ................................................ 33
Hình 3.5: Phát hiện băng hoạt tính protease từ các phân đoạn sau khi qua cột sắc
ký trao đổi ion DEAE- cellulose trên gel polyacrylamid 12.5% .............................33
Hình 3.6: Ảnh hưởng của PMSF lên hoạt tính protease ................................. 34
Hình 3.7: Ảnh hưởng của PCMB lên hoạt tính protease ................................ 34
Hình 3.8: Ảnh hưởng của HgCl₂ lên hoạt tính protease ................................. 35
Hình 3.9: Ảnh hưởng của O-phenanthroline lên hoạt tính protease ............... 35
Hình 3.10: Độ bền nhiệt của protease ............................................................. 37
Hình 3.11: Độ bền với pH của protease .......................................................... 38
Hình 3.12: Hình ảnh trên kính hiển vi sự hàn gắn vết rạch trên nguyên bào sợi
của protease ..................................................................................................... 40
Hình 3.13: Mức độ hàn gắn vết rạch của protease trên nguyên bào sợi……..41


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, việc ứng dụng protease trong Y học đang
được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm. Các nghiên cứu cho thấy
protease có hiệu quả kháng viêm, tiêu các cục máu đông, làm mau lành vết
thương, chống tắc nghẽn mạch máu, chống ung thư, điều hòa miễn dịch…
Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy cây Xuân Hoa
Pseuderanthemum palatiferum ( Ness ) Radlk chứa hàm lượng lớn protease.
Cây Xuân Hoa P. palatiferum ( Ness ) Radlk thuộc họ Ôrô Acanthaceae được
dùng trong dân gian đễ chữa nhiều bệnh. Trong những năm gần đây, nhiều
nhà khoa học Việt Nam và thế giới đã xác minh được một số tác dụng sinh
học của cây thuốc này như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxy
hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết, ức chế acetylcholinesterase. Tuy nhiên,
việc nghiên cứu đặc tính và tác dụng dược lý chỉ tập trung vào nhóm chất thứ
cấp và vẫn còn nhiều công dụng khác được lưu truyền trong dân gian của cây
Xuân Hoa P. palatiferum chưa được chứng minh. Cho đến nay chưa có
nghiên cứu nào về tác dụng hàn gắn vết thương của protease mới từ cây thuốc
này.
Do vậy, chúng tôi đã đi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu
hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thƣơng của
protease từ cây thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness)
Radlk”.
Đề tài chúng tôi nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung những thông tin
khoa học mới về cây thuốc quý của Việt Nam.


Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Hoàn thiện quy trình tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa P.
palatiferum

Hoàng Thị Trang

1

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

- Xác định được protease mới từ cây thuốc này thuộc nhóm
protease nào.
- Xác định tác dụng hàn gắn vết thương của protease tinh sạch từ
cây thuốc này.


Nội dung chính của đề tài:
- Tinh sạch protease từ cây thuốc Xuân Hoa P. palatiferum (Ness)
Radlk đạt hiệu quả cao.
- Xác định ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu lên hoạt tính
protease tinh sạch.
- Đánh giá độ bền của protease với nhiệt độ, pH và các ion kim
loại
- Đánh giá khả năng thủy phân của protease trên một số cơ chất
khác nhau
- Đánh giá tác dụng hàn gắn vết thương của protease trên in vitro.

Hoàng Thị Trang

2

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Mô tả thực vật cây Xuân Hoa P. palatiferum (Ness) Radlk.
Cây Xuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, còn có tên là cây Tu Linh, cây Nhật
Nguyệt hay cây Con Khỉ, cây Hoàn Ngọc, cây Thần dưỡng sinh, cây Trắc Mã,
cây Điền Tích, cây Lan Điều. Tên khoa học là Pseuderanthemum Palatiferum
(Nees) Radlk.
Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ thực vật hai lá mầm trong thực vật có
hoa, chứa khoảng 250 chi và khoảng 2.700 loài (Henrik, 1988). Theo Phạm
Hoàng Hộ, chi Pseuderanthemum có khoảng 196 loài. Ở Việt Nam, chi
Pseuderanthemum có 9 loài và 2 thứ (Phạm Hoàng Hộ, 2000).
Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk có thể mọc
cao từ 1-2m sống lâu năm, thân cây xanh màu tím lục, khi già chuyển thành
màu nâu, phân ra nhiều nhánh, lá mọc đối diện có hình mũi mác, dài từ 1215cm, rộng 3,5-5cm, nếp lá nguyên, cuống lá dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 1016cm. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc ở đầu cành. Hoa lưỡng tính, không đều, màu
trắng.
Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang ở nhiều nơi, được coi là cây thuốc
quí có uy tín trong dân gian ở các tỉnh thành miền Bắc, nhất là thủ đô Hà Nội.

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa P. palatiferum

Hoàng Thị Trang

3

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.2. Những nghiên cứu về cây Xuân Hoa P. palatiferum
1.2.1. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa
Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đã đưa ra một số bài thuốc từ kinh
nghiệm dân gian đã sử dụng lá cây Xuân Hoa (Xuân Lục, 2005):
 Chữa bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón,
đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày cho đến
khi khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn.
 Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu,
phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để
uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ. Ăn 1-5 lần, máu sẽ cầm, nên ăn ngày 2
lần.
 Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần,
người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh. Thử nghiệm qua một số
bệnh ung thư dạ dày, gan, phổi… đều thấy có diễn biến tốt. Lượng lá dùng
thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày 2 lần, mỗi lần 3-7 lá, tùy
theo hiệu quả giảm đau.
 Các bệnh u ở phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng như trên, sau 1 tuần các
triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt. Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào
cuối tháng, khoảng 3 tháng liên tục.

 Các bệnh về gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan…): ăn lá tươi như trên
ngày 2 lần khi đói. Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 là thuốc trị
xơ gan đặc hiệu.
 Bệnh về thận (viêm thận cấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng
nước đái đục, đái ra máu): điều trị như trên sau 1 tuần. Ăn 1 lần/ngày, nhưng
nếu nước giải chỉ trong được nửa ngày thì tăng lên 2 lần/ngày. Trong thời
gian nửa tháng, các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt.
 Chữa viêm loét (loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại,
trực tràng…): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buổi sáng). Với các vết

Hoàng Thị Trang

4

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

thương thuộc phạm vi dạ dày, chỉ cần ăn trong 1 tuần, tránh uống rượu mạnh.
Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiểu hơn tùy theo nặng,
nhẹ.
 Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổi huyết áp (cao
hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ trong thời gian ngắn,
huyết áp sẽ trở lại bình thường, khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật, tùy
theo mức độ để định liều lượng, có thể ăn vào buổi sáng giúp cơ thể ổn định
trong ngày và đề phòng khi thời tiết thay đổi đột ngột.
 Chữa về chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt là chấn thương

sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu,
khôi phục các mô cơ bị dập, kháng viêm nhiễm, lá làm cả thuốc đắp và thuốc
uống. Với vết thương kín, có thể nhai để đắp, vết thương hở thì nên giã để
đắp.
 Chữa cảm cúm: nếu kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi,
nhiệt độ cao, nên ăn lá cách 2 giờ, cơn sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn
tiêu hóa cũng khỏi. Sau cơn sốt, nên ăn cháo có lá thuốc trộn vào giúp cho
người bệnh mau chóng trở lại bình thường.
 Khôi phục sức khỏe: khi mệt mỏi toàn thân hoặc cần nâng cao sức
chịu đựng cường độ cao, nên ăn 5-7 lá trước nửa giờ. Trẻ con đi lỏng nên lấy
từ 1-2 lá giã lấy nước cho uống.
1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa
Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự đã cô lập được các hợp chất phytol,
β-sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol và poriferasterol, β-sitosterol
3-β-O-D-glucopyranoside từ lá cây Xuân Hoa (Nguyễn Thị Minh Thu, 2000).
Phan Minh Giang và cộng sự đã cô lập từ lá khô cây Xuân Hoa hợp
chất 1-pentacosanol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp βsitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside
và apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside (Phan Minh Giang, 2003).

Hoàng Thị Trang

5

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa các hợp
chất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid và palmitic acid
(Nguyễn Văn Hùng, 2004).
Mai Đình Trị và các cộng sự đã cô lập các hợp chất từ lá cây Xuân Hoa
bao gồm: β-amyrin, oleanolic, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp hợp βsitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside
(Mai Đình Trị, 2005).
Trần Kim Thu Liễu đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa các hợp chất
squalene, dotriacontane, phytol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn
hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside, 24-methylenecycloartanol và
loliolide (Trần Kim Thu Liễu, 2007).
Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi chỉ ra rằng lá Xuân Hoa chứa
đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao, đặc biệt hàm
lượng isoleucin, leucin và valin rất cao, không phát hiện các nguyên tố kim
loại nặng như Cd, Pd, As, Cr (Võ Hoài Bắc, 2003). Chúng tôi cũng đã phát
hiện hàm lượng cao protease, polysaccharide từ lá cây này (Lê Lan Oanh và
Võ Hoài Bắc, 1998, 1999).
1.2.3. Nghiên cứu về dược tính
1.2.3.1. Nghiên cứu in vitro
a) Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Trần Công Khánh và cộng sự đã thử tác dụng kháng vi sinh vật kiểm
định (trong ống nghiệm) của cao đặc chiết từ lá cây Xuân Hoa, kết quả cho
thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa), kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm mốc (Aspergillus
niger, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solanii), nấm
men (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans) (Trần Công Khánh, 1998)
Năm 2005, Phan Minh Giang và cộng sự đã khảo sát sơ bộ hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n-butanol (ở nồng độ 10
Hoàng Thị Trang

6

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

mg/ml) từ lá cây Xuân Hoa, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể
hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida
albicans, Candida stellatoides), trong đó cao trích ethyl acetate có hoạt tính
tốt hơn cao trích n-butanol. Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate
kháng tốt các chủng Salmonella typhi 158, Shigella flexneri và Escherichia
coli, đây là những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu chảy, viêm ruột, lị
(Phan Minh Giang, 2005).
b) Hoạt tính kháng oxy hóa
Phan Minh Giang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa
của các loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây Xuân Hoa bằng phương
pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt động của
enzyme peroxydase trong máu. Kết quả cho thấy cả hai loại cao ethyl acetate
và n-butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa (Phan Minh Giang,
2005).
1.2.3.2. Nghiên cứu in vivo về dược tính
a) Thử độc trên động vật thử nghiệm
Lê Thị Lan Oanh và cộng sự đã khảo sát độ độc của dịch chiết lá cây
Xuân Hoa trên cá chọi. Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá chọi
vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày. Kết quả thử nghiệm độc
tính của lá khô cây Xuân Hoa cũng đã được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm,

Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí nghiệm, cho thấy không có độc tính (Lê
Lan Oanh, 1999).
Nguyễn Thị Minh Thu và các cộng sự đã thử độc tính cấp diễn của cây
Xuân Hoa theo phương pháp của Behrens trên chuột nhắt trắng. Phương pháp
được tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau, liên tục theo dõi diễn tiến
hành vi của chuột từ khi đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày. Kết quả cao đặc toàn
phần lá cây không gây độc tính cấp tính trên chuột, chuột sống hoàn toàn
khỏe mạnh qua 48 giờ (Nguyễn Thị Minh Thu, 1999).
Hoàng Thị Trang

7

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Peerawit và cộng sự đã thử nghiệm độc tính của cao trích ethanol 80%
từ lá cây Xuân Hoa cả in vitro lẫn in vivo. Kết quả thử nghiệm in vitro trên tế
bào thận khỉ xanh châu Phi bằng phương pháp GFP (green fluorescent
protein) cho thấy mẫu thử không độc ở nồng độ 50 µg/ml, liều cao nhất có thể
pha được. Với thử nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích ethanol 80%
được thực hiện trên chuột trưởng thành qua đường uống, với một liều duy
nhất ở các nồng độ khác nhau, 500, 1000, 1500 và 2000 mg mẫu cao trích/kg
trọng lượng chuột. Kết quả cho thấy chuột không có dấu hiệu ngộ độc trong
24 giờ đầu và không chết qua 14 ngày thử nghiệm, không có sự khác biệt về
thể trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng. Với thử
nghiệm in vivo trên chuột qua đường uống, mỗi ngày, trong 14 ngày, ở các

nồng độ khác nhau, 250, 500, 1000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột,
không có liều nào gây độc cho chuột. Các trị số hóa lý như creatinine,
triglyceride, cholesterol tổng, protein tổng và albumin không có sự khác biệt
giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng (Peerawit Padee,
2009).
b) Tác dụng bảo về tế bào gan
Nguyễn Thị Minh Thu đã thử tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao đặc
toàn phần lá cây Xuân Hoa trên chuột nhắt trắng. Mô hình gây ngộ độc gan
bằng tetrachloromethane. Kết quả như sau: ở liều gây độc gan 1 ml CCl 4/kg
thể trọng, hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể, có dấu hiệu bình
phục tế bào gan. Ở liều gây độc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng, hàm lượng men gan
có giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục tế bào gan (Nguyễn Thị
Minh Thu, 1999).
c) Tác dụng trị tiêu chảy
Huỳnh Kim Diệu và cộng sự đã xác định hiệu quả của bột lá Xuân Hoa
trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai chế phẩm Colinorgent và Cotrimxazol. Kết quả 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô có tỉ lệ

Hoàng Thị Trang

8

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái phát thấp hơn so với kháng sinh Coli-norgent
(90,48%/9,52%) và Cotrimxazol (83,33% /14,29% (Huỳnh Kim Diệu, 2006).

d) Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase
Wararut Buncharoen và cộng sự đã xác định hiệu quả ức chế enzyme
acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây ở các liều 0,3; 0,7 và 1g/kg thể
trọng trong 30 ngày. Hiệu quả ức chế được đánh giá dựa trên tế bào máu đỏ,
huyết thanh và não chuột. Kết quả cho thấy dịch trích có thể làm giảm sự tổng
hợp enzyme acetylcholinesterase trong não chuột. Hiệu quả ức chế enzyme
acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây Xuân Hoa đã cho thấy tiềm
năng chữa bệnh Alzheimer của cây thuốc này (Wararut Buncharoen, 2010).
1.3. Định nghĩa và phân loại protease
1.3.1. Định nghĩa
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid
amin tự do, một ít protein ngắn, pepton.
1.3.2. Phân loại
Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase
 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được
phân chia thành 2 loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia
thành 4 nhóm sau (Lê Ngọc Tú, 2010):
- Serin protease: là những protease chưa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrypsin và
Hoàng Thị Trang

9

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như subtilisin Carlsberg. Các serine thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
- Cysteine protease: Các protein chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein protease bao gồm các protease thực vật như: papain, bromelin,
một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein protease
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, rennin. Aspartic
protease có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính.
- Metallo protease: Là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các protease thường hoạt động ở
pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease còn được phân loại theo cách đơn giản dựa vào
tính chất xúc tác phản ứng ở pH: chia thành 3 nhóm:
- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít
thấy ở vi khuẩn.
- Protease trung tính: có pH 7-8 như papain, bromelin, ficin. Những
protease này là enzyme ổn định với nhiệt độ nhất.
- Protease kiềm có pH 9-11.

1.4. Ứng dụng của protease (Đặng Thị Thu, 2012)
 Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt
nhờ sự thủy phân 1 phần protein trong thịt, làm cho thịt có độ mềm thích hợp
và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị
thịt, (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định, phương
pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme,
muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào
Hoàng Thị Trang

10

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

con vật trước khi giết mổ). Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ
Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất
có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất
đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị
raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để
thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm
y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy
người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc,
thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm
của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên
liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
 Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm)

thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại
phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên
hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó
sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút
ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn
một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
 Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong
việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae
được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt
hơn.
 Trong công nghiệp sữa: Trong công nghiệp sữa, protease được dùng
trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ
một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus… được dùng
trong sản xuất pho mát. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy...
protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp
và nở tốt hơn.

Hoàng Thị Trang

11

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

 Trong công nghệ thuộc da: Quá trình chế biến da bao gồm 1 số công
đoạn như: ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da hoặc thuộc da. Thông thường, các

phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide,
làm ảnh hưởng đến môi trường khi nước thải nhà máy thải ra sông. Việc sử
dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao
chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Protein là một thành phần cơ
bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân 1 số thành
phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả.
 Trong công nghệ tơ tằm: Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
 Trong hương mỹ phẩm: Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt... để làm mềm da, tẩy tế bào
chết.
 Trong sản xuất chất tẩy rửa: Protease là một trong những thành phần
không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa (chất tẩy rửa dùng trong gia
đình, chất làm sạch kính, kem đánh răng...). Việc ứng dụng enzyme vào các
chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung
vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các
vết bẩn do thức ăn, vết máu, sữa và các chất do cơ thể người tiết ra. Protease
dùng trong chất tẩy rửa phải hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao
cũng như phải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có
trong thành phần của chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu
cầu khắt khe trên. Hiện nay, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên
thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus và chủ
yếu là B.subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme
này cho ngành công nghiệp tẩy rửa.
 Trong Y học:
- Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh
vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch.
Hoàng Thị Trang

12

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

- Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch...
- Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
- Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người
bị tiêu hóa kém...
- Sử dụng làm thuốc kháng viêm, chữa lành vết thương
 Trong nông nghiệp: Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân
giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
 Trong kỹ nghệ phim ảnh: Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh
các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen... Protease phân giải và
hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và
sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
1.5. Nghiên cứu về protease từ thực vật và từ cây Xuân Hoa
P. palatiferum.
Thực vật rất giàu protease. Năm 1900, Loew và cộng sự đã tách
protease từ cây thuốc lá (Loew, 1900). Greenberg và Winnick đã xác định
được một số thực vật chứa protease như: bromelain thu được từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) (Greenberg, 1945).
Nhiều protease được tìm thấy trong vách tế bào thực vật (Lamport, 1982).
Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu và
phát hiện được các protease mới từ thực vật như protease tách từ cây Jatropha

curcas (Indranil, 2011).
Gần đây, các protease từ thực vật cũng được nghiên cứu ứng dụng
trong Y học để điều trị viêm, làm tan các cục máu đông, giảm đau, chống oxy
hóa, ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư. Protease có thể giảm viêm
bởi giảm tiết các cytokine tiền viêm, quét các gốc oxy hóa tự do, điều hòa các
phân tử bám dính (Veremeenko, 2000; Huang, 2008). Bromelain có khả năng
kháng viêm giảm các edema trong tổn thương (Netti, 1972) và kháng các tế
Hoàng Thị Trang

13

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

bào ung thư (Garbin, 1994; Grabowska, 1997; Rabelo, 2004). Protease tách từ
cây Jatropha curcas và cây Plumeria rubra Linn có hiệu quả kháng viêm và
làm lành vết thương (Indranilc, 2011; Nath, 1992).
Lê Lan Oanh và Võ Hoài Bắc (1999) đã phát hiện hàm lượng cao
protease từ lá cây Xuân Hoa và đã tiến hành tách chiết chúng. Cho đến nay
trên thế giới và ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu có hệ thống về đặc tính
sinh hóa và tác dụng làm lành vết thương của protease từ cây Xuân Hoa P.
palatiferum. Việc nghiên cứu tính chất sinh hoá cũng như những ứng dụng
của protease từ cây thuốc này là rất cần thiết, góp phần bổ sung những thông
tin khoa học mới về cây thuốc quý của Việt Nam.

Hoàng Thị Trang

14

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN II - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Mẫu thí nghiệm
Lá cây Xuân Hoa thu hái ở Hà Nội, được loại bỏ những lá sâu, lá héo
úa, lá nát. Sau đó được mang về phòng thí nghiệm rửa sạch, cắt bỏ cuống
và lau khô nhẹ nhàng. Lá được cân và bọc trong các túi nilon và bảo quản
trong -20 ºC cho thí nghiệm tách chiết.
2.1.2. Hóa chất sử dụng
Các hóa chất phân tích đều đạt độ tinh khiết, chủ yếu là các hóa chất
nhập ngoại của các hãng Sigma, Invitrogen, Merk, Prolabo, Bio-Canada:
casein, Folin, BSA (albumin huyết thanh bò), TCA (tricloacetic), tyrosine,
đệm phosphate Sorensen, cồn tuyệt đối của Việt Nam (99,5%), gel
canxiphosphat, dung dịch gốc acrylamit 30%, đệm tris-HCl, sodium dodecyl
sulphat 10%, comasie Brilliant blue, temed… Cột lọc gel Sephadex G-100,
cột trao đổi ion DEAE-cellulose được mua từ hãng GE healthcare.
2.1.3. Máy móc, thiết bị
Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu này có độ chính xác cao
của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học-Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam như: máy quang phổ UV 1601 (Visible Spectrophotometer 1601),
máy quang phổ UV 1601 secom, máy đo pH Corning 215 (Anh), cân điện

Shimazu (Nhật Bản), cân kỹ thuật Caltex (Tây Đức), box Laminar (Pháp), tủ
sấy (Anh), nồi khử trùng (Đài Loan, Nhật Bản), máy ly tâm eppendorf (Đức),
bể điều nhiệt Memmer (Mỹ), máy sắc ký lỏng cao áp HPLC (Đức), máy điện
di.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết rút protease từ lá Xuân Hoa
Lá Xuân Hoa tươi bảo quản ở -20 ºC trong 24 giờ được nghiền mịn
bằng cối có bổ sung thêm cát thủy tinh, sau đó chiết bằng đệm 0,05M
Hoàng Thị Trang

15

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

phosphast Sorensen, pH = 7,6; EDTA 0,001M; MgCl2. 6H2O 0,01M; NaCl
2M theo tỷ lệ 1:7 (trọng lượng/ thể tích), khuấy nhẹ bằng máy khuấy từ trong
vòng 30 phút, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4 ºC thu lấy dịch trong.
2.2.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
* Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Cho enzym protease tác dụng với cơ chất casein, sau đó kết tủa
protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng
màu với thuốc thử Folin. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong điều
kiện chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan
trong TCA tương ứng với 1µmol tyrosine (Pietrowa, 1966; Phạm Thị Trân
Châu, 2006).

* Hoá chất
Thuốc thử folin pha loãng 5 lần, Na2CO3 6%; TCA 5%; Casein 1%
trong đệm phosphate 0,01M, pH 7.0
* Tiến hành
+ Phản ứng enzyme:
Lấy 0,5ml enzyme, giữ 10–15 phút ở 30 oC, thêm 1ml dung dịch
casein 1% (đã đạt 30 oC), lắc đều, giữ ở 30 oC đúng 10 phút. Sau đó cho
ngay 2,5ml TCA vào, lắc đều và để lắng 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm
12000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch trong suốt có chứa sản phẩm
hoà tan của phản ứng enzyme. Hàm lượng của sản phẩm trong dung dịch
lọc được xác định bằng phản ứng màu.
+ Phản ứng màu:
Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzyme cho vào ống nghiệm, thêm 2ml
Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0.5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều.
Sau 30 phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phổ ở bước
sóng 750nm.
+ Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosine:

Hoàng Thị Trang

16

Lớp 13 - 01 K20


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ khác nhau 0,1-1 µmol/ml

trong HCl 0.2N. Lấy 0,5ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên. Đo
mật độ quang học của các ống. Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan
giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosine. Tính hiệu số giá trị mật độ
quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính
lượng µmol tyrosine tương ứng. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym ở
điều kiện tiêu chuẩn 30 oC, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản
phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1 micromol tyrosine.
Bảng 2.1. Xác định đƣờng cong chuẩn của tyrosine
Nồng độ

0,1mM 0,2mM 0,3mM 0,4mM 0,5mM 0,6mM

0,7mM

Dung dịch
Tyrosine
(ml)
HCl 0,2N
(ml)

0,05

0,1

0,15

0,20

0,25

0,3

0,35

0,45

0,4

0,35

0,30

0,25

0,2

0,15

Hoạt độ phân giải protein của 1 ml dung dịch enzym được xác định như
sau:
a.4.k
X=
t
X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzyme
4: Thể tích của hỗn hợp phản ứng và TCA
a: Số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học
của ống thí nghiệm và ống kiểm tra
Hoàng Thị Trang

17

Lớp 13 - 01 K20