Nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh hóa của collagense tái tổ hợp từ chủng lysinibacillus sphaericus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP
TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus
-------------------------------------------Người hướng dẫn

: TS. Bạch Thị Mai Hoa

Sinh viên

: Nguyễn Thị Hà

Lớp

: 1302

Hà Nội-2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------------------------------------------------------------------------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: : NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP
TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus

--------------------------------------------

Người hướng dẫn

:

TS. Bạch Thị Mai Hoa

Sinh viên thực hiện

:

Nguyễn Thị Hà

Lớp

:

1302

Hà Nội-2017


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện được tốt đề tài nghiên cứu này, tôi đã nhận được nhiều sự
quan tâm và giúp đỡ tận tình từ phía gia đình, thầy cô và bạn bè.

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Bạch Thị Mai Hoa là người
hướng dẫn chính, người thầy rất tận tâm đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp
hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu.
Tôi cũng mong muốn được gửi lời càm ơn chân thành nhất tới các cán
bộ, nhân viên, các sinh viên thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học,
Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, cảm ơn anh
chị em, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Hà

Nguyễn Thị Hà

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
TỔNG QUAN ................................................................................................... 3
1.1 Giới thiệu về Lysinibacillus và Lysinibacillus sphaericus ...................... 3
1.1.1. Lysinibacillus .................................................................................... 3
1.1.2. Lysinibacillus sphaericus ............................................................... 3
1.2. Giới thiệu về collagen........................................................................... 5
1.2.1. Collagen.......................................................................................... 5
1.2.2. Ứng dụng của collagen ..................................................................... 9
1.3 Collagenase ............................................................................................ 12
1.3.1. Đặc điểm của collagenase ............................................................... 12
1.3.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới về collagenase ............ 14
1.3.3. Ứng dụng collagenase..................................................................... 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 19
2.1. Vật liệu .................................................................................................. 19
2.1.1. Chủng vi sinh vật ............................................................................ 19
2.1.2. Hóa chất sử dụng ............................................................................ 19
2.1.3. Môi trường ...................................................................................... 20
2.1.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 21
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tái tổ hợp ...................... 21
2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian lên khả năng sinh tổng
hợp collagenase của chủng tái tổ hợp ....................................................... 22
2.2.3. Tách DNA plasmid ......................................................................... 22
2.2.4. Biến nạp E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................ 23
2.2.5. Phương pháp khuếch đại gen col .................................................... 23
2.2.6. Tinh sạch collagenase tái tổ hợp ..................................................... 24
2.2.7. Phương pháp định hoạt tính enzyme .............................................. 25

Nguyễn Thị Hà

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

2.2.8. Phương pháp zymogram gelatine ................................................. 27
2.2.9. Phương pháp sắc ký protein trên polyacrylamid ............................ 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 29
3.1. Đặc điểm sinh học của chủng tái tổ hợp ............................................... 29
3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ
chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col .......................................... 31
3.2.1. Ảnh hưởng của pH .......................................................................... 31
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của collagenase ................ 32
3.2.3. Động thái sinh tổng hợp collagenase của chủng vi khuẩn ............. 34
3.3. Tinh sạch collagenase ........................................................................... 36
3.4. Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của collagenase tái tổ hợp ................... 41
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố pH, nhiệt độ, ion kim loại và chất
ức chế lên hoạt động của enzyme đã tinh sạch ............................................ 42
3.5.1. Ảnh hưởng của pH .......................................................................... 42
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của collagenase ................ 43
3.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất ức chế lên hoạt động
của collagenase đã tinh sạch ..................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 46
Kết Luận......................................................................................................... 46
Kiến Nghị ....................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 52

Nguyễn Thị Hà

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Một số collagenase từ các nguồn khác nhau đã được nghiên cứu .... 13
Bảng 2: Danh mục và xuất xứ của các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ... 19
Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................. 21
Bảng 4: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
collagenase của chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col. .................. 32
Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và tổng hợp collagenase của
chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col ............................................. 33
Bảng 6: Giá trị Km và V max của collagenase đối với các cơ chất khác nhau. . 42

Nguyễn Thị Hà

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram của L. Sphaericus ........................................... 4
Hình 2: Cấu trúc collagen ................................................................................. 6
Hình 3: Cấu trúc tropocollagen ......................................................................... 7
Hình 4: Đường chuẩn protein.......................................................................... 25
Hình 5: Đường chuẩn Leucine ........................................................................ 26
Hình 6: Hình ảnh điện di vector pIN III ompA, col và pIN III ompA col trên
agarose 1%. Băng 1: pIN III ompA; Băng 2: col; Băng 3: col đã được cắt với
enzym giới hạn BamHI và NotI; Băng 4: pIN III ompA- col. ...................... 29
Hình 7: Đặc điểm nuôi cấy của của chủng tái tổ hợp và chủng vi khuẩn mang
vector pIN III ompA trên môi trường LB có bổ sung 1% casein, gelatin và
collage. ............................................................................................................ 30
Hình 8: Khả năng thủy phân cơ chất casein, gelatin và collagen của dịch phá
vỡ tế bào của BL21(DE3) pIN III ompA- col. ................................................ 31
Hình 9: Định tính collagenase của dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp trên điều
kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. ................................................................... 34
Hình 10: Động thái lên men của chủng BL21 PinIII ompiA-col .................... 35
Hình 11 : Định tính collagenase của dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp trên thời
gian nuôi cấy khác nhau. ................................................................................. 36
Hình 12. Kiểm tra khả năng biểu hiện COL trên SDS-PAGE. Giếng 1: 10 g
protein của BL21(DE3) PIN III ompA. Giếng 2: 20 g protein của pha không
tan BL21(DE3) PIN III ompA- col. Giếng 3: 10 g protein của pha tan
BL21(DE3) PIN III ompA- col. Giếng 4: Broad ranger protein marker ........ 37
Hình 13: Quy trình tinh sạch collagenase ....................................................... 38
Hình 14: Định tính các phân đoạn tinh sạch của collagenase tái tổ hợp. ....... 40
Hình 15: Kết quả zymogram gelatin của các phân đoạn tinh sạch collagenase
tái tổ hợp. ......................................................................................................... 41
Hình 16 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của collagenase ........................ 43
Hình 17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của collagenase ................. 44
Hình 18: Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế đến hoạt động của
collagenase ...................................................................................................... 45

Nguyễn Thị Hà

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

ĐẶT VẤN ĐỀ
Collagen chiếm 30% thành phần protein trong cấu trúc cơ thể động
vật và đến 70% cấu trúc da, nó là một cơ chất rất bền và khó phân giải nhất
trong số các protein. Chỉ có duy nhất collagenase là enzyme có khả năng
phân giải collagen khi cơ chất này ở trạng thái siêu xoắn. Bởi vì enzyme
này có hoạt tính protease, gelatinase được biểu hiện ở khả năng phân cắt
procollagen hoặc gelatin. Trong khi nhiều protease, gelatinase đã nghiên
cứu nhưng lại không có khả năng phân cắt bó sợi collagen ở dạng hòa tan
và không hòa tan.
Việc nghiên cứu và sản xuất collagenase trở nên vô cùng hấp dẫn và
đặc biệt trong những năm gần đây khi collagen ngày càng có nhiều ứng
dụng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, thẩm mỹ,
và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.
Collagenase có khả năng phân cắt đoạn collagen, thành các đoạn có
kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian phân cắt, hiệu suất thu hồi cao, sản phẩm
collagen có tính hòa tan cao, bảo toàn được đặc điểm sinh học và thân thiện
với môi trường. Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt hầu hết các
loại collagen và tại nhiều vị trí trên sợi collagen. Các collagenase này hầu
hết đều có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho con người nên cần có sự
thận trọng trong việc ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm dành cho

người.
Lysinibacillus sphaericus là nhóm có khả năng sinh collagenase cao
nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi mặc dù thông tin trình tự gene mã
hóa collagenase trong hệ gene đã được công bố, đặc biệt chúng không
mang trình tự mã hóa của protein gây bệnh. Đây là một ưu điểm khi sử
dụng enzyme từ vi khuẩn này tạo sản phẩm collagen không chứa tác nhân
gây miễn dịch hay dị ứng.
Nguyễn Thị Hà

1

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài : “ Nghiên cứu và so sánh đặc điểm
sinh hóa của cllagenase tái tổ hợp từ chủng Lysinibacillus sphaericus ”với
mục tiêu chính :
1 . Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch collagenase từ chủng vi
khuẩn.
2 . Xác định các đặc điểm sinh hóa của collagenase tái tổ hợp.
Đề tài này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
Lý do chúng tôi lựa chọn nghiên cứu collagenase từ vi khuẩn là do
collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt các loại collagen hòa tan và
không hòa tan với hiệu suất thu hồi cao. Bên cạnh đó collagenase từ vi
khuẩn là enzyme có khả năng phân cắt được collagen type I, collagen type

II mà collgen type I và collagen type II chiếm đến 70% tổng số loại
collagen đã được nghiên cứu. Trong khi prokaryote collagenase và
eukaryote collagen không có khả năng phân cắt hai loại collagen này.

Nguyễn Thị Hà

2

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về Lysinibacillus và Lysinibacillus sphaericus
1.1.1. Lysinibacillus
Lysinibacillus thuộc họ Bacillaceae. Trước đây nó được coi là thành
viên của chi Bacillus. Nhưng đến năm 2007 dựa vào trình tự rARN nó đã
được đổi thành chi Lysinibacillus. So với Bacillus sp thì Lysinibacillus sp
chứa lysine và aspartate trong peptidoglycan, khác với Bacillus sp là
diaminopimelic acid.
Lysinibacillus thường được tìm thấy trong đất, nước bùn và một số mô
thực vật. Chủng này cũng có thể phân lập từ các sản phẩm giống cây trồng
lên men và thậm trí từ mẫu gan cá nóc [1].
Lysinibacillus thường sống yếm khí tùy tiện, tuy nhiên trong điều kiện
nhất định nó có thể sống kỵ khí.
1.1.2. Lysinibacillus sphaericus
Lysinibacillus sphaericus là một trực khuẩn Gram dương (hình 1),

hình que sinh nội bào tử hình elip hoặc hình cầu, thuộc chi Lysinibacillus,
còn có tên khác là Bacillus sphaericus ( NCBI genome project entez). Sự
thay đổi tên đã được đề xuất bởi Ahmet I trong năm 2007 dựa trên thành
phần đặc biệt peptidoglycan của thành tế bào, cũng như phân tích đặc điểm
sinh lý của L. sphaericus [2].

Nguyễn Thị Hà

3

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram của L. Sphaericus
Trong điều kiện khắc nhiệt L. sphaericus có thể hình thành nội bào tử
không hoạt động có khả năng chịu nhiệt, hóa chất và tia cực tím. Những
bào tử có thể sống sót trong một thời gian dài.
Bộ gen của chủng L. sphaericus C3-41 là dòng đầu tiên được giải
trình tự vào năm 2008.
Trình tự bộ gen vi khuẩn này rất có ích vì nó đã làm tăng kiến thức
của chúng ta về trực khuẩn cũng như cung cấp cái nhìn sâu sắc để cải thiện
tương lai của các tác nhân kiểm soát sinh học quan trọng [3].
L. sphaericus không có khả năng chuyển hóa polysaccharides, do
thiếu các enzyme và hệ thống vận chuyển cụ thể. Sự phong phú của các
enzyme phân giải protein và hệ thống vận chuyển cho phép L. sphaericus
sử dụng con đường chuyển hóa độc quyền sử dụng một loạt hợp chất hữu

cơ và axit amin. Một đặc tính được biết đến của L. sphaericus là không có
khả năng chuyển hóa cacbonhydrate nhưng các chi tiết về quá trình chuyển
hóa năng lượng của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ [3].
Chủng L. sphaericus có thể sinh trưởng ở pH từ 5.5 - 9.5 với sự phát
triển tối ưu ở pH 7.5 và ngừng phát triển ở pH 5.0. Dải nhiệt độ phát triển
Nguyễn Thị Hà

4

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

của chúng là từ 16°C - 45°C và phát triển tối ưu ở 37°C, không sinh trưởng
ở nhiệt độ ≥ 50°C, ở 16°C chúng sinh trưởng chậm và sau nhiều ngày mới
quan sát thấy sự tăng số lượng tế bào. Những phát hiện này giúp phân biệt
chủng từ các loài có liên quan chặt chẽ như Bacillus fusiformic (chỉ phát
triển ở nhiệt độ nhỏ hơn 40°C). Nghiên cứu ở nồng độ NaCl khác nhau ở
pH 7.0 và 30°C cho thấy chúng chịu được dải nồng độ muối từ 0-5% (w/v)
NaCl trong môi trường thạch, điều này khác với chủng Bacillus fusiformic
có thể chịu được dải nhiệt độ muối lên tới 7%(w/v) [4].
Một số công trình nghiên cứu về chủng L. sphaericus đã được công bố
đa số liên quan đến khả năng sản xuất độc tố có tác dụng diệt côn trùng,
đặc biệt là ấu trùng muỗi, do đó nó đã được sử dụng làm vector để kiểm
soát bệnh nhiệt đới. L. sphaericus được chia thành 5 nhóm chính trên cơ sở
sự tương đồng trình tự DNA của nó [5].
Năm 1960 việc phân lập vi khuẩn B. thuringiensis hoặc L. sphaericus

đã diễn ra mạnh mẽ để áp dụng cho việc xử lý môi trường, nó được coi như
một thành phần trong thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát hoạt động của
một số chủng muỗi và gián, sâu bướm[35].
Một nghiên cứu L. sphaericus OT4b.31 công bố chủng vi khuẩn này
không có khả năng chống muỗi vằn Quinquefasciatus nhưng có khả năng
xử lý các kim loại nặng trong môi trường ô nhiễm [5].
1.2. Giới thiệu về collagen
1.2.1. Collagen
Collagen là protein chính trong mô nối động vật và là protein dồi dào
nhất ở động vật có vú, chiếm khoảng 25% - 30% trọng lượng protein trong
cơ thể. Collagen chiếm 1-2% các mô cơ, chiếm 6% thể trọng của gân,
xương, dây chằng, sụn và răng trong cơ thể. Đối với da, collagen chiếm
khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da [5].
Nguyễn Thị Hà

5

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị
tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm
collagen có nhiều mức cấu trúc. Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương
tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kị nước và
vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở
collagen.

Hình 2: Cấu trúc collagen
Về cấu trúc, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen có dạng sợi
hình ống, chiều dài khoảng 300 nm, đường kính 1,5 nm. Mỗi sợi collagen
này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (α peptide) nối với nhau bằng các
liên kết hydro và xoắn lại với nhau như sợ thừng. Mỗi một vòng xoắn có độ
dài 3,3 gốc amino acid, chiều cao là 2,9Å . Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn
ống từ trái sang phải, gọi là chuỗi xoắn bậc 3 (triplehelix) [5].

Nguyễn Thị Hà

6

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Hình 3: Cấu trúc tropocollagen
Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng
sợi, bao gồm những sợi mảnh nhỏ. Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn
lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hình thành nên bộ ba
tropocollagen. Sau đó trong tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu
nối đuôi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau
hình thành sợi collagen siêu cấp collagen fiber. Các chuỗi collagen sắp xếp
song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng liên kết ngang tạo thành
các sợi theo chu kỳ nhất định.
Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có một khoảng

trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau.
Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được
chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và
những đặc tính cơ học riêng. Vì thế collagen rất chắc, dai và bền.
Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Đã có 29 loại collagen
được tìm thấy và công bố trong các tài liệu khoa học. Trên 90℅ collagen
trong cơ thể là loại I,II, III và IV.[5]
Nguyễn Thị Hà

7

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Collagen loại I : có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (
thành phần chính của xương ).
Collagen loại II: có trong sụn xương ( thành phần chính của sụn).
Collagen loại III: có trong bắp ( thành phần chính của bắp), tìm thấy
bên cạnh collagen loại I.
Collagen loại IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào.
Collagen loại V: có trong dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô.
Collagen loại VI: có trong gan, thận, màng sụn.
Collagen loại VII: có trong sự nối liền của da và biểu bì.
Collagen loại VIII: có trong tế bào màng trong.
Collagen loại IX: có trong sụn.
Collagen loại X: có trong sụn bị khoáng hóa và phình to.

Collagen loại XI: có trong sụn.
Collagen loại XII: có trong dây chằng, sợi liên kết collagen.
Collagen loại XIII: có trong biểu bì, nang tóc, tế bào gốc của móng.
Collagen loại XIV: có trong sợi liên kết collagen.
Collagen loại XV: có trong nhiều mô khác nhau, tương đồng với
collagen loại XVII.
Collagen loại XVI: còn đang được nghiên cứu.
Collagen loại XVII: có trong da.
Collagen loại XVIII: có trong gan.
Collagen loại XIX: có trong mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu
phát triển.
Nguyễn Thị Hà

8

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

Collagen loại XX-XXIX: còn đang được nghiên cứu.
Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như
da, xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen
loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật, da heo còn trẻ chứa
tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 -10%. những đoạn Collagen khác
chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt.
1.2.2. Ứng dụng của collagen
a. Ứng dụng trong công nghiệp

Nếu collagen bị thủy phân thì các chuỗi polypeptide sẽ tách nhau
một phần hoặc hoàn toàn, hình thành nên gelatin. Gelatin được ứng dụng
trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và nền công nghiệp phim ảnh. Các
nhà sản xuất bổ sung collagen thủy phân này cho các sản phẩm và khẳng
định rằng sản phẩm của họ có thể cải thiện làn da, móng tay và sức khỏe
xương khớp.
Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là "người sản xuất keo hồ", nói
đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng những loại động vật khác để
thu được hồ. Keo dán collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây
4.000 năm và người Mỹ sử dụng nó cách đây khoảng 1.500 năm.
Nó không những được dùng để giữ các dụng cụ trong gia đình mà
còn rất hữu dụng trong việc sản xuất các loại nhạc cụ như violin hay guitar,
những loại này thường được tháo ra để sửa chữa nên không thích hợp dùng
các chất dính lâu bền, trong khi đó collagen khi đun nóng thì có thể được
làm mềm một cách dễ dàng.
b. Ứng dụng trong y học
Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính
tương thích sinh học, có khả năng cầm máu cho nên nó là một loại vật liệu
Nguyễn Thị Hà

9

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học. Màng collagen

được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như làm chất biệt chiến sinh
học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy collagen được
sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao
gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng,... Collagen
được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho
các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác trong lĩnh
vực nha khoa, phẫu thuật và chỉnh hình. Collagen còn được dùng trong việc
xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng.
Đôi khi chúng được sử dụng kết hợp với silicon, glycosaminoglycan,
nguyên bào sợi, các tác nhân tăng trưởng và các hợp chất khác. Collagen
cũng được bán trên thị trường như một chất bổ sung cải thiện tính linh hoạt
của khớp. Ngoài ra, collagen còn là phần nền giúp tích tụ calcium trong
xương. Nếu hàm lượng collagen giảm đáng kể calcium không thể tích tụ
làm cho xương giòn và dễ gãy sự dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau ở
khớp gối và hông. Như vậy để xương cứng cáp hơn, ngoài calcium cần bổ
sung một lượng lớn collagen.
Collagen là một polymer tự nhiên nó được dùng trong phẫu thuật tạo
hình như bơm môi, căng da mặt,... Mặc dù không thể hấp thụ qua da nhưng
hiện nay collagen đang được dùng làm thành phần chính trong các sản
phẩm mỹ phẩm.


Collagen dạng sợi.

Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết
bỏng và vết rạch trong phẫu thuật. Sợi collagen có thể được xử lý để tạo
cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làm những sản phẩm y học cho gân và dây
chằng. Những ống collagen (collagen tube) được sử dụng thay thế cho các
cấu trúc như thực quản, dây thần kinh ngoại biên, niệu quản. Nó cũng được
sử dụng trong việc nuôi cấy tế bào.

Nguyễn Thị Hà

10

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

 Màng mỏng collagen.
Collagen dạng màng và lớp mỏng biết sử dụng để giữ cố định các vật
chất sinh học chẳng hạn như nhân tố XY 11 trong máu, dùng trong sự tái
tạo các mô, nổi kết lại võng mạc, làm mặt thẩm tích máu, làm vật thay thế
lớp màng cứng của não. Nó còn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh,
khôi phục màng nhĩ, sụn và xương, kiểm soát sự chảy máu cục bộ, khôi
phục tổn thương của gan, là lớp màng chắn bảo vệ não, có tác dụng phục
hồi các vết thương.
c. Ứng dụng trong nghiên cứu
Sự phát triển của tế bào với sự hỗ trợ của collagen trong sự nuôi cấy
tế bào vừa được xem xét gần đây. Việc sử dụng chất này collagen cho sự
phát triển của tế bào da được công bố một cách rộng rãi. Những tế bào nuôi
cấy trên collagen kích thích làm vết thương mau lành. Những nghiên cứu
rộng rãi về sự phát triển của các tế bào da tự sinh và khác loại trên nền
collagen chứng minh tính khả thi để tạo ra nhiều chủng loại mô và các cơ
quan trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng nguồn nguyên liệu tế bào nuôi cấy
thuộc nhiều chủng loại khác nhau có tác dụng to lớn đến việc điều trị cho
bệnh nhân có những tổn thương về mô hoặc các cơ quan.
d. Ứng dụng trong mỹ phẩm

Khoảng 70% cấu trúc của da là collagen, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì
của da [5]. Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ hỗ trợ các đặc tính cơ
học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn
màng, tươi tắn và trẻ trung. Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào.
Sự suy giảm về chất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô,
mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể. Chính vì vậy
mà collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích
quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương.
Nguyễn Thị Hà

11

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

1.3 Collagenase
1.3.1. Đặc điểm của collagenase
Collagenase nhân sơ và nhân chuẩn đã được nghiên cứu cấu trúc và
trình tự được phân loại thuộc nhóm metalloproteinase (MMP). Những
nghiên cứu về cấu trúc và ái lực của MMP nhân chuẩn cho thấy đây là các
enzyme hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của ion

, gồm enzyme có

hoạt tính như collagenase, stromelysin, gelatinase và loại enzyme màng
metalloproteinase. Tuy nhiên những đặc tính của MMP nhân sơ không

giống với MMP nhân chuẩn - collagenase nhân chuẩn khác biệt với
collagenase nhân sơ về đặc tính hóa sinh và trình tự amino acid, nhưng cả
hai đều có đặc điểm chung là có khả năng tách sợi collagen và vẫn bảo toàn
đặc điểm sinh học chuối xoắn của ba polypeptide. Tuy nhiên collagenase
nhân chuẩn chỉ có khả năng cắt sợi collagen thành 2 đoạn có chiều dài ¾ và
¼ sợi collagen ban đầu. Còn collagen

nhân sơ có khả năng các sợi

collagen hòa tan và không hòa tan ở nhiều vị trí chỉ có collagenase mới có
khả năng phân cắt bó sợi collagen tập hợp từ nhiều đoạn gồm 3 chuỗi xoắn
procollagen. Enzyme này có hoạt tính protease, gelatinase được biểu hiện ở
khả năng phân cắt procollagen hoặc gelatin. Tuy nhiên, nhiều protease,
gelatinase đã nghiên cứu lại không có khả năng phân cấp bỏ sợi collagen ở
dạng hòa tan và không hòa tan. MMP nhân sơ được nghiên cứu nhiều nhất
là collagenase G và collagenase H từ C. historiticum, collagenase A từ C.
perfingens và collagenase từ V. alginolyticus. Một số nghiên cứu cấu trúc
sơ bộ đã chỉ ra collagenase từ loài Clostridium sp có chứa 3 vùng gồm
vùng hoạt động, vùng gây bệnh u nang thận ( polycystic kidney disease PKD) và vùng bám vào sợi collagenase ( collagen - binding domainCBD). Tất cả các enzyme này đều tồn tại một vùng để ion kim loại bám
và làm tăng khả năng hoạt động . Tuy nhiên collagenase của chủng vi

Nguyễn Thị Hà

12

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

khuẩn không gây bệnh Streptococcus lactis được phân loại như là serine
protease thì không chứa vùng để ion kim loại bám.
Các collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit
dạng poly-L như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng
thái tự nhiên của cơ chất không biến tính. Collagenase là các protein có
khối lượng phân tử lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau. Phân tử
collagenase có thể được tạo nên bởi các tiểu phần. Collagenase A với khối
lượng phân tử 100 kDa được phát hiện ở vùng 4 tiểu phần không có hoạt
tính enzyme với trọng lượng của phân tử là 25 kDa, collagenase của Vibrio
B bao gồm 2 tiểu phần có khối lượng phân tử không giống nhau 24kDa và
28kDa.
Đa số các enzyme đã được công bố có pH hoạt động trong khoảng
trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7-8). Tuy thế khả năng hoạt động của chúng
cũng không vượt quá mức pH trung tính. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme
hoạt động thường là 37°C các enzyme này bất hoạt khi tăng nhiệt độ lên
45°C. Đặc biệt trong trường hợp của collagenase từ Vibrio B-30, enzyme
này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới 45°C.

Bảng 1: Một số collagenase từ các nguồn khác nhau đã được nghiên
cứu
Enzyme
Nguồn gốc
Cơ chất và phân tích
Đặc tính
Collagenase B. subtilis

Collagen

[29]

gelatin

không

tan MW: 125,000
Chất
ETDA,

ức

chế
tripsin,

acid idoacetic, 2β-mecaptoethanol
và DFP
Collagenase Vibiro

Nguyễn Thị Hà

Collagen

13

tự

nhiên, MW: 81,875

13-02 Khoa Công nghệ sinh học

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

alginolyticus

[33]

peptide tổng hợp cần có
mặt của Zn

Collagenase Clostridium
histolyticum

[34]

Collagen tự nhiên, 4- MW: 116,000
phenylazobenzyloxycarb
only-pro-Leu-Gly-proD-Arg. Cần có mặt cuả
Zn, Ca.

Collagenase Clostridium
perfingiens

[31]

Azocoll,

collagen

tự MW: 120,000

nhiên, cơ chất tổng hợp
và collagen type I. Cần
có mặt của Zn

Collagenase Vi

khuẩn Collagen

[30]

Vibrio peptide tổng hợp. Cần các tiểu phần có

biển
B-30

tự

nhiên, MW: 105,000 (từ

có mặt của ion kim loại

trọng

lượng

là

24,000 và 28,000
Da)
Collagenase Cytophaga

Collagen tự nhiên

MW: 120,000

sp. L43-I

[33]

Collagenase C.
A [31]

histolycum

Collagen,

gelatin, MW: 105,000

peptide tổng hợp : Z- Phụ thuộc Ca, cần
Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-

Zn.

Ala.OH

1.3.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam và Thế giới

a. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên
cứu chủ yếu để trích ly collagen từ da và phụ phế phẩm một số loại cá như:

Nguyễn Thị Hà

14

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

- Năm 1997 Tô Thị Kim Oanh đại học Bách khoa Hà Nội và Cộng Sự
đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính collagenase từ thực phẩm
truyền thống tác giả tập trung vào nghiên cứu collagenase từ Bacillus
subtillis FS-2.

Tuy nhiên thông tin về trình tự amino acid chưa được

nghiên cứu ( To et al. 1997; Nagano and To 1999, To and Nagano 2000,
2003).
- Năm 2004, GS. Trương Nam Hải và đồng sự ( đề tài nhánh KC 0407, viện CNSH) đã sàng lọc từ ngân hàng genome dòng gen mã hóa cho
enzyme thủy phân collagen của Bacillus subtillis. Tuy nhiên enzyme tái tổ
hợp này chưa được nghiên cứu cấu trúc protein của collagenase và so sánh
sự khác biệt giữa collagenase của B. Subtillis với các col H và col G từ C.
Histolyticum hoặc collagenase từ C. Pergringens.
- Năm 2008 tác giả Lê Thị Hông Nhan có những nghiên cứu về trích

ly collagen trên loài cá Ba Sa nuôi tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.
Do những ứng dụng to lớn của collagenase và sản phẩm tạo thành nên
nó đang ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn tại Việt Nam.
b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Collagenase từ Clostridium histolyticum ( gây hoại tử ở các vết
thương hở) được nghiên cứu và sản xuất từ năm 1958 [6,7,8,9].
Năm 1966 Schoellman và Fisher phát hiện collagenase từ
Pseudomonas aeruginosa ( gây viêm loét phổi, dạ dày, đại tràng và các vết
thương hở) [10].
Năm 1975, collagenase từ vi sinh vật biển ở Vibrio B-30 ATCC
21250, vibrio vulnificus CYK279H ( gây viêm loét ở các vết thương và ngộ
độc thực phẩm) và Achromobacter iophagus ( liên quan đến bệnh nhiễm
trùng cơ hội ) [11,12]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra collagenase tồn tại ở các
vi sinh vât gây bệnh khác như Streptomyces lavendulae ( liên quan đến
Nguyễn Thị Hà

15

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

bệnh ở người) [13]; Bacillus subtillis [14] , Vibrio alginolyticus gây bệnh
viêm tai giữa và nhiễm trùng vết thương [15], Streptococcus gordonii gây
bệnh viêm loét miệng, sâu răng hoặc viêm cơ tim [16] và
Thermoactinomycetes sp ( gây nhiễm trùng máu và phổi) [17], Borelia
burgadoform ( lây truyền từ các vết cắn của ve tạo thành bệnh Lyme) [18],

Peptostreptococcus magrisus ( nhiễm trùng huyết, hoại tử mô) [19], và
Streptococcus sobrinus ( bệnh sâu răng) [20], Seratia marcescens ( nhiễm
trùng đường tiết niệu, vết thương) [21] và nhiều vi sinh vật khác như
Bacterroides melaninogenicus; Streptomyces sp; Bacillus cereus MBL31
và Aeromonas veronii [22,23]. Tuy nhiên các nghiên cứu chưa đề cập tới
đặc điểm sinh hóa và trình tự amino acid của collagenase từ các vi sinh vật
gây bệnh này.
Enzyme thô của collagenase từ C. histolycium được thương mại hóa từ
năm 1958. Nhưng đến năm 1994, Yoshihara và cộng sự mới công bố sản
xuất collagenase type I và II tái tổ hợp với hoạt tính từ 75-125 U/mg. Gen
ColG mã hóa cho collagenase type I có trọng lượng phân tử 113,9 kDa.
Gen ColH mã hóa cho collagen type II có trọng lượng phân tử 112 kDa.
Cho đến nay, collagenase đã được tách chiết từ rất nhiều loại vi khuẩn, gen
mã hóa collagenase đã được tách dòng và giải trình tự [24]. Collagenase có
trọng lượng phân tử 93 kDa đã được công bố ở Streptomyces parvulus (
gây bệnh nhiễm trùng mạch máu) [25]. Collagen tái tổ hợp gồm 680 amino
acid có trọng lượng phân tử là 74 kDa đã được tách chiết từ Vibrio hollisae
1760 ( gây ngộ độc thực phẩm, và viêm loét dạ dày), protein tái tổ hợp này
đã được biểu hiện ở vi khuẩn Brevibacillus [26]. Trình tự amino acid của
V.hollisae thể hiện độ tương đồng cao với collagenase 80 kDa của V.
alginolyticus ( gây viêm loét dạ dày) [15] và collagenase 64 kDa của Vibrio
parahaemolyticus (gây viêm loét dạ dày) [27]. Hoạt tính collagenase của V.
Hollisae và V. Alginolyticus được công bố là cao hơn 2-3 lần hoạt tính của
Nguyễn Thị Hà

16

13-02 Khoa Công nghệ sinh học

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

các loại collagenase khác. Collagenase từ loài Vibrio được phân loại thuộc
nhóm III.
1.3.3. Ứng dụng collagenase
Collagenase là một enzyme đặc biệt, xúc tác quá trình thủy phân, phân
cắt collagen nguyên bản và collagen biến tính. Collagenase được sử dụng
với nhiều mục đích khác nhau, trong nghiên cứu cơ bản cũng như trong
nghiên cứu ứng dụng thực tế về hóa sinh, y tế , công nghiệp dược, công
nghiệp thực phẩm và công nghiệp thuộc da [14].
- Phân cắt vật liệu collagen nhờ khả năng phá vỡ các liên kết peptide
trong cấu trúc collgen.
- Phân tách mô tế bào:
Collagenase có tầm quan trọng đặc biệt khi phân tách các mô quá
nhiều sợi hoặc quá nhạy cảm cho phép sử dụng trypsin, chất mà không ảnh
hưởng lên các vật liệu sợi và phá hủy các vật liệu không bền. Sự phân tách
thường được thực hiện bằng cách ngâm toàn bộ cơ quan hoặc bằng cách ủ
một mẫu nhỏ mô cùng với enzyme hòa tan. Collagenase đã được ứng dụng
thành công cho việc phân lập rộng rãi và đa dạng các loại tế bào.
- Phân tách các loại tế bào Langerhan của tuyến tụy:
Collagenase ứng dụng quan trọng trong sự phân lập các tế bào đảo
Langerhan của tuyến tụy khi trong đảo có nhiều tế bào khác nhau đặc biệt.
Trong quá trình này một số nhân tố hạn chế sự thành công của phương
pháp bao gồm sự khác nhau đáng kể trong việc chuẩn bị cho collagenase
hoạt động, các nhân tố gây độc cho tế bào β- Cell, và tác dụng của
collagenase lên tính di truyền miễn dịch và các đặc tính động học của tế
bào đảo.

Nguyễn Thị Hà

17

13-02 Khoa Công nghệ sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở

- Phân lập các tế bào cơ tim:
Collagenase cũng được sự dụng trong việc phân lập các tế bào cơ tim.
Sự phân tách các mô được tiến hành bằng cách ngâm nguyên vẹn cơ quan
trong dung dịch enzyme, trong đó có collgenase được chọn lựa một mình
hoặc được kết hợp với một enzyme khác.
- Phân lập tế bào gan:
Các tế bào gan đã phân lập được sử dung trong nghiên cứu các tế bào
thúc đẩy sự phát triển của khối u, trong nghiên cứu các cơ chế điều khiển tế
bào, trong thực phẩm và hệ thống phân tích chất gây ung thư.
- Chuẩn đoán các tế bào ung thư phổi:
Sự tăng collagenase hoạt động trong đại thực bào phân lập từ cuống
phổi là một dấu chuẩn để chuẩn đoán các tế bào ung thư phổi [28].
- Phân lập tế bào từ mô khác:
Collagenase được ứng dụng thành công trong việc phân lập các tế bào
từ mô xương, mô sụn, tuyến giáp trạng, mô buồng trứng , mô dạ con, mô
biểu bì, màng trong của tế bào, các tế bào thần kinh và các tế bào khác.

Nguyễn Thị Hà

18

13-02 Khoa Công nghệ sinh học