Thiết kế và biểu hiện trần thị hạnh hiền của virus lở mồm long móng type o trong tế bào côn trùng sf9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
-----------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN CASSETTE VP0, VP1-2A-VP3
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG
TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9

TRẦN THỊ HẠNH HIỀN

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
-----------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ

THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN CASSETTE VP0, VP1-2A-VP3
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG
TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9

TRẦN THỊ HẠNH HIỀN

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60420201

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƢỜNG
NCS. NGUYỄN PHƢƠNG HOA

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các cá nhân và tập thể. Nhân dịp
này, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Trƣờng Đại học Mở
Hà Nội đã đào tạo, truyền tải kiến thức khoa học cho tôi trong suốt quá trình học tập
tại trƣờng.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Việt Cƣờng Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung , ngƣời đã hƣớng dẫn và hết sức tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Dƣơng và Th.s
Nguyễn Phƣơng Hoa, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi thực hiện
đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn chân thành tới các cô chú, anh chị Trung tâm Công nghệ sinh
học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân và toàn thể bạn bè, đã
luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và tiến hành
luận văn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2017
Học viên

Trần Thị Hạnh Hiền

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn
của thầy, cô hƣớng dẫn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai
công bố trong bất kỳ công trình nào.

Tác giả luận văn
( ký và ghi rõ họ tên)

Trần Thị Hạnh Hiền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1. BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG ..................................................................... 3
1.2. TÌNH HÌNH BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM ........................................................................................................................ 4
1.2.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới. ......................................................... 4
1.2.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM ở Việt Nam. ......................................... 6
1.3. TRIỆU CHỨNG BỆNH TÍCH ......................................................................... 8
1.3.1. Triệu chứng ................................................................................................ 8
1.3.2. Đƣờng xâm nhập của virus và phƣơng thức lây lan................................. 11
1.3.3 Thời kỳ ủ bệnh........................................................................................... 12
1.4 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG .................................................................. 12
1.4.1 Hình thái và cấu tạo .................................................................................. 12
1.4.2 Phân loại .................................................................................................... 13
1.5. CẤU TRÚC HỆ GEN CỦA VIRUS LMLM ................................................. 14

1.6. HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG ............................... 16
1.7. TẾ BÀO E.COLI DH10BAC ......................................................................... 18
1.8. VECTOR pFASTBACTMDUAL .................................................................... 20
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................21
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 21
2.2. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 22
2.3.1. Phƣơng pháp khuyếch đại gen bằng PCR ................................................ 22
2.3.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ...................................................... 23
2.3.3. Phƣơng pháp gắn DNA vào vector chuyển .............................................. 23


2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide ............................................... 26
2.3.7. Phƣơng pháp tạo Bacmid ........................................................................ 26
2.3.8. Phƣơng pháp nuôi tế bào Sf9 .................................................................. 27
2.3.9. Phƣơng pháp đếm tế bào sf9 ................................................................... 27
2.3.10. Phƣơng pháp tạo baculovirus tái tổ hợp ................................................. 28
2.3.11. Phƣơng pháp biểu hiện baculovirus tái tổ hợp trong tế bào côn trùng Sf928
2.3.12. Phƣơng pháp Western Blot .................................................................... 29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................32
3.1. TẠO PLASMID VẬN CHUYỂN PFASTBACTMDUAL TÁI TỔ HỢP
MANG GEN VP1-2A-VP3 ................................................................................... 32
3.2. TạO VECTOR PFAST-BAC DUAL TÁI Tổ HỢP MANG GEN VP1-2AVP3 VÀ VP0 ......................................................................................................... 35
3.3. TẠO BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO SF9 BIỂU HIỆN
VP1-2A-VP3+ VP0 ............................................................................................... 38
3.3.1. Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 + VP0 ............................ 38
3.3.2. Nhiễm bacmid- VP1-2A-VP3+ VP0 tái tổ hợp trong tế bào côn trùng
Sf9 tạo Baculovirus stock P1............................................................................. 41
3.4. NHIỄM BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP P1 BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG

TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9 ................................................................................. 43
3.5. THU HỒI PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC
HIỆU KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ .......................................................... 44
KẾT LUẬN ..............................................................................................................46
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................48


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp

: Ampicillin

BP( bp)

: Cặp Bazơ

DNA maker : Thang DNA chuẩn
DNA

: Axit Deoxyribonucleic

E.Coli

: Escherichia Coli

EDTA

: Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

EtBt

: Ethidium Bromide

EU

: Liên minh Châu Âu

FDMV

: Foot and Mouth Disease Virus

Genome

: Bộ gen

LB

: Môi trƣờng Lauria Betani

LMLM

: Bệnh lở mồm long móng

OD

: Optical Density (mật độ quang học)

OIE

: Office International Epidemiology (Tổ chức dịch tễ thế giới)

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA

: Axit Ribonucleic

RT-PCR

:Reverse transcriptase-PCR (Kỹ thuật phối hợp khuyếch đại
trình tự các RNA)

SAT

: South Africa Territories

SDS

: Sodium dodecyl sulphate

TAE

: Tris – Acetate – EDTA

Taq polymerase: Polymerase Thermus aquaticus
v/ph

: vòng / phút

WHO

: Who Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

X-gal

: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl--D-Galactopyranoside

IRES

: International Ribosome Entry Site

UTR

: Untranslated Region


DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004 .....................8
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hơp mang genVP1-2A-VP3 bằng
enzyme Bam HI và Hind III .........................................................................26
Bảng 3.1: Hàm lƣợng bacmid dùng để xâm nhiễm tế bào Sf9 .................................41
Bảng 3.2: Trạng thái của tế bào sau khi lây nhiễm ...................................................43

Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh LMLM trên thế giới năm 2005 ................................6
Hình 1.2: Triệu chứng LMLM ở trâu, bò và lợn.......................................................10
Hình 1.3: Hình thái virus LMLM ..............................................................................13

Hình 1.4: Cấu trúc vỏ ngoài cuả virus LMLM .........................................................15
Hình 1.5: Sơ đồ mô tả hệ thống Bac-to-Bac baculovirus expression .......................18
Hình 1.6: Cấu trúc vector pFastBac Dual .................................................................20
Hình 3.1: Kết quả nhân dòng vector pFastBacTM Dual .............................................32
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm cắt vòng vector pFastBacTM Dual và gen VP1-2AVP3 bằng enzyme BamHI và HindIII ..........................................................33
Hình 3.3: Kết quả nhân dòng gen VP1-2A-VP3 .......................................................34
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pFastBacTM Dual ..................................35
mang gen VP1-2A-VP3 ............................................................................................35
Hình 3.5a: Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pUC19-VP0 và pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 ................................................................................................36
Hình 3.5b: Điện di đồ sản phẩm cắt gen VP0 và pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3...36
Hình 3.6a: Đĩa biến nạp vector pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 + VP0 ...................37
Hình 3.6b: Sản phẩm tách plasmid pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 + VP0 .............37
Hình 3.6c: Sản phẩm cắt plasmid pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3+ VP0 ................37
Hình 3.7a: Các khuẩn lạc E.coli DH10Bac sau khi biến nạp vector pFastBacTMDual
VP1-2A-VP3+ VP0 .....................................................................................38
Hình 3.7b: Sản phẩm tách bacmid VP1-2A-VP3+ VP0 1,2: bacmid mang gen VP12A-VP3+ VP0 ................................................................................................38


Hình 3.8:Sản phẩm PCR gen VP1-2A-VP3+ VP0 ...................................................39
Hình 3.9: Hình thái tế bào SF9 ở các giai đoạn khác nhau (250x) ...........................42
Hình 3.10: Ảnh kiểm tra biểu hiện protein sau 24h , 48h, 72h, 96h nuôi cấy .........43
Hình 3.11: Kết quả Western Blot sau khi thu hồi protein bằng ly tâm siêu tốc. ......44


1

LỜI MỞ ĐẦU
Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy
hiểm do virus LMLM (Foot and Mouth Disease Virus- FMDV) gây ra ở các loài
động vật móng guốc chẵn nhƣ trâu, bò, dê, cừu, lợn... Bệnh có các biểu hiện đặc

trƣng là sốt cao và hình thành mụn nƣớc ở niêm mạc miệng, kẽ chân và da vú của
gia súc cảm thụ.
Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế do khả năng lây lan nhanh trên nhiều loài
gia súc, giảm sức sản xuất, gây ảnh hƣởng xấu đến năng suất, chất lƣợng của sản
phẩm chăn nuôi. Bệnh không có thuốc ch a đặc hiệu, ch có vắc xin phòng bệnh.
Dịch lây lan nhanh làm nhiều gia súc nhiễm bệnh trong thời gian ngắn gây ra đại
dịch. Bệnh LMLM đƣợc Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationale des
Epizooties - OIE) xếp vào một trong các bệnh đứng đầu danh mục bảng A - Bảng
danh mục các bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật. Bệnh LMLM xảy
ra ở hầu hết các châu lục: Châu Âu (bệnh đƣợc ghi nhận vào nh ng năm cuối thế kỷ
17), châu Á (Pakistan, Ấn Độ, v.v. ), châu Phi (Nam Phi v.v.).
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang, năm 1898.Theo
số liệu tổng hợp của Cục thú y, tình hình dịch bệnh FMDV trong nh ng năm gần
đây diễn ra với số ổ dịch và số lƣợng gia súc mắc bệnh ngày càng tăng.
Tác nhân gây bệnh, virus lở mồm long móng là loại picornavirus nhỏ, không
vỏ với 7 serotypes. Virus này dễ truyền nhiễm khi di chuyển vật nuôi bị bệnh hoặc
các sản phẩm động vật, đồ vật, bình phun, ngƣời bị nhiễm.Virus LMLM là thành
viên duy nhất của chi Aphthovirus thuộc họ Picornaviridae Picornaviruses là các
virus nhỏ (đƣờng kính 27-30 nm). Virus lở mồm long móng có bảy loại (types) là
A, 0, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2, và SAT-3 với hơn 60 phân typ (subtypes). Các t p
virus LMLM gây nh ng triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhƣng không có miễn
dịch chéo cho nhau. Cho đến trƣớc năm 2004, virus gây bệnh LMLM ở Việt Nam
chủ yếu thuộc týp O. Từ năm 2004, virus LMLM t p A lần lƣợt đƣợc phát hiện ở
các t nh phía Nam đến Quảng Bình.


2

Xuất phát từ nh ng yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế và biểu hiện cassette VP0, VP1-2A-VP3 của

virus Lở mồm long móng Type O trong tế bào côn trùng Sf9 ”.
Đề tài này đƣợc thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa
Đô-Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung- Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.


3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG

Bệnh Lở mồm long móng (viết tắt là LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm của động vật móng guốc chẵn nhƣ : trâu, bò, lợn, dê, hƣơi, nai, cừu…. Sự
nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không ch
do tiếp xúc gi a động vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều con
đƣờng kể cả qua không khí. Vì vậy bệnh thƣờng phát thành đại dịch gây thiệt hại
về chăn nuôi, ảnh hƣởng đến kinh tế xã hội nhiều nƣớc thuộc nhiều châu lục trên
thế giới. Do bệnh không lây lan sang ngƣời nên đôi khi công tác phòng chống dịch
bệnh không nhận đƣợc sự hƣởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng.
Bệnh thƣờng gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản nhƣ
bò s a, thịt, lợn hƣớng nạc. Gia súc mắc bệnh thƣờng giảm tăng trọng, giảm sản
lƣợng s a và là động vật mang trùng, vì vậy các nƣớc có nền chăn nuôi, kinh tế
phát triển rất quan tâm. Đối với trâu, bò, bệnh làm mất khả năng cày kéo, ảnh
hƣởng đến sản xuất do vết thƣơng ở móng làm gia súc què. Gia súc non mắc bệnh
có tỷ lệ chết cao do suy tim. Cụ thể là qua theo dõi thực tế ở các ổ dịch thấy tỷ lệ
chết thƣờng chiếm 1% ở gia súc trƣởng thành và 50% ở gia súc non, đôi khi làm
chết tới 90% đối với lợn con. Theo Tổ chức Thú y thế giới (OIE) bệnh LMLM
làm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, làm giảm tới 25% sản lƣợng thịt, 50%
sản lƣợng s a, ở cừu năng suất lông giảm 25%. LMLM đƣợc Tổ chức Thú y thế

giới (OIE) xếp đầu tiên ở bảng A (gồm các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất cho
chăn nuôi và hạn chế thƣơng mại đối với động vật, sản phẩm động vật cũng nhƣ
nông sản nói chung) [Grubman 2006; Van Phan Le et al., 2010].


4

1.2. TÌNH HÌNH BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
1.2.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới.
Bệnh LMLM đã xuất hiện ở nhiều nƣớc thuộc Châu Á, Châu Phi, Mỹ La
tinh và Châu Âu. Điển hình là trong nh ng năm 1981-1985, dịch xuất hiện ở 80
nƣớc, gây nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của nh ng nƣớc này. Năm 1997, dịch
xảy ra ở lợn trên toàn lãnh thổ Đài Loan, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và để
lại hậu quả xấu cho ngành chăn nuôi lợn trong nhiều năm. Các nƣớc Nhật Bản và
Hàn Quốc là nh ng nƣớc từ lâu không có bệnh LMLM nhƣng đến năm 2000 đã
xuất hiện bệnh này.
Tại Châu Âu năm 2001 dịch đầu tiên xảy ra ở Anh, sau đã lan ra Pháp, Hà
Lan, Ireland qua con đƣờng vận chuyển gia súc. Từ khi ngừng việc sử dụng vaccine
ở các nƣớc thuộc Liên minh Châu Âu (EU) 1991, đã có nh ng ổ dịch nhỏ xảy ra ở
Italia 1993; Hy Lạp 1994-1996; Nga 1995.
Tính đến tháng 4 năm 2000 ở Nga đã phát hiện một ổ dịch tại một làng ở Viễn
Đông, 625 trong số 965 con lợn của đàn bị mắc bệnh, 111 con bị chết do virus
LMLM type O gây ra. Nga tiếp tục dùng vaccine xung quanh Moscow và ở đây có
sân bay quốc tế và gần các nhà máy sản xuất vaccine. Việc tiêm phòng cũng đƣợc
tiến hành dọc theo biên giới phía Nam của Nga. Từ nh ng bằng chứng vừa nêu, có
thể khẳng định chƣa bao giờ Châu Âu hoàn toàn không có dịch bệnh LMLM. Các ổ
dịch nổ ra lặp đi lặp lại, một số đó đƣợc khẳng định và một số vẫn chƣa cs bằng
chứng xác đáng. Nguyên nhân chính của việc tái phát các vụ dịch đƣợc cho là do sự
di chuyển bất hợp pháp gia súc sống từ vùng Anatolia của Thổ Nhĩ Kỳ vào phần

lãnh thổ của Thổ Nhĩ Kỳ ở Châu Âu.
Tại Nam Mỹ, Chile, Guyana, Suriname không thấy bệnh LMLM trong thập kỷ
90 và trong khoảng 8 năm trở lại đây đẫ có nh ng tiến bộ đáng kể về hiệu quả của
các chƣơng trình khống chế bệnh LMLM. Mặc dù các bằng chứng đƣa ra kém
thuyết phục hơn nhƣng một số nƣớc khác nhƣ Argentina, Paraguay, Uruguay,


5

Bolivia, Colombia, Brazil… cũng rất cố gắng trong việc phòng chống bệnh LMLM
với kết quả làm giảm thiểu số lƣợng ổ dịch đƣợc công bố.
Tại Châu Á, virus LMLM thuộc type O và A có mặt ở hầu hết các nƣớc vùng
Trung Đông, cùng với sự thâm nhập của type Asia1 vào Saudi Arabia. Ở Ấn Độ
việc khống chế bệnh LMLM là rất khó bởi số lƣợng đầu gia súc là rất lớn, ƣớc tính
164 triệu cừu, dê; 200 triệu bò; 80 triệu trâu…Virus type O, A, C, Asia1 lƣu hành
khắp nơi và nh ng cố gắng của ngƣời chăn nuôi bò s a tìm cách khống chế bệnh
một cách riêng rẽ đều không đem lại kết quả. Hơn n a các nƣớc láng giềng nhƣ
Pakistan, Nepal, Bangladesh đó làm lây nhiễm nhiều chủng loại virus LMLM của
họ cho Ấn Độ.
Trung Quốc là nƣớc có đƣờng biên giới rất dài với Việt Nam, là nƣớc thƣờng
xuyên có bệnh LMLM, việc buôn bán trao đổi hàng hóa gi a Việt Nam và Trung
Quốc, nhất là việc buôn bán vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật là
nguyên nhân lây lan dịch bệnh gi a hai nƣớc.
Ở khu vực Đông Nam Á, một số nƣớc có dịch nhƣ Lào, Campuchia, Thái Lan,
Myanmar, Philippines, Malaysia và Việt Nam đó chịu nh ng thiệt hại rất lớn do
dịch gây ra. Ở Thái Lan, khi bị dịch này, chính phủ đó chi mỗi năm hàng triệu USD
để khống chế dịch. Ngoài ra, Liên Hợp Quốc cũng hỗ trợ thêm 36 triệu USD để
thành lập Trung tâm chuẩn đoán LMLM để định chủng virus, nghiên cứu dịch tễ và
sản xuất vaccine. Thái Lan đã có 7/9 vùng kinh tế đã sạch bệnh và ở 7 vùng này vẫn
xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và nông sản đi nhiều nƣớc với số lƣợng lớn.

Indonesia đã thanh toán đƣợc bệnh này từ năm 1983, Phillippines đã đƣợc Tổ chức
Thú y Thế giới OIE công nhận an toàn ở vùng Mindanao, Visay và Luzon.


6

Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh LMLM trên thế giới năm 2005
Nhiều nƣớc trên thế giới đã thanh toán đƣợc bệnh dịch LMLM nhƣ Australia,
New Zealand, các nƣớc thuộc quần đảo Thái Bình Dƣơng, các nƣớc thuộc EU, các
nƣớc thuộc vùng Bắc Trung Mỹ. Các nƣớc trên đều phải thực hiện một chƣơng
trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy
định của Tổ chức Thú y thế giới.
1.2.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang (1898).Trƣớc đây,
bệnh thƣờng thấy ở các t nh miền Trung và miền Nam, giáp biên giới Campuchia và
Lào.Ở miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong thời gian dài từ nh ng năm 19211963.Bệnh không xảy ra ở khu vực các t nh phía Bắc từ 1963-1992.Năm 1993, dịch


7

bệnh xuất hiện ở các t nh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên- Huế.
Năm 1995, bệnh xảy ra ở 107 huyện thuộc 26 t nh làm nhiều trâu, bò, lợn bị chết.
Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nên phức tạp, hàng năm bệnh xảy ra ở diện
rộng với số lƣợng lớn gia súc mắc bệnh.
Theo số liệu của Cục thú y: Năm 1999, trong khi vẫn chƣa chấm dứt các đợt
dịch từ các t nh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc đợt dịch mới từ Trung
Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các t nh giáp biên. Cao Bằng là điểm đầu tiên, từ
đó dịch lan sang các t nh khác.
Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 t nh, thành với 3.976 trâu bò mắc bệnh.
Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 t nh, thành, gây bệnh cho 10.287 trâu, bò.

Năm 2003, 38 t nh, thành có dịch, trong đó, 28 t nhcó dịch ở trâu, bò và 28 t nh
có dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trâu, bò; 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ yếu
ở các t nh: Quảng Trị, Phú Yên, Đăklăk, Khánh Hòa, Gia Lai, Hà Giang.
Theo Tô Long Thành và cộng sự thì tình hình dịch bệnh LMLM trong mấy năm
gần đây diễn biến hết sức phức tạp vàcó chiều hƣớng gia tăng:
Năm 2004: Số t nh có dịch LMLM là 24 t nh, trong đó có 9 t nh do virus
LMLM serotype A (phát hiện lần đầu tiên tại Ninh Thuận và Bình Định vào tháng
8/2004), 12 t nh do virus LMLM serotype O và 3 t nh do cả 2 virus LMLM
serotype O và A. Nguyên nhân của việc xuất hiện virus LMLM týp A có thể là do
việc nhập lậu bò từ Campuchia.
Năm 2005: Số t nh có dịch LMLM là 37 t nh với 28.241 trâu bò, 3.976 lợn và
81 dê mắc bệnh, trong đó có 3 t nh do virus LMLM serotype A, 13 t nh do virus
LMLM serotype O, 3 t nh do cả 2 virus LMLM serotype O và A, 2 t nh do virus
LMLM serotype Asia1 (phát hiện tại Lào Cai và Khánh Hoà vào tháng 10/2005).
Đến nay, bệnh th nh thoảng vẫn gây ra nh ng đợt dịch trầm trọng, làm tổn thất
lớn cho ngƣời chăn nuôi và ngân sách nhà nƣớc. Kết quả phân tích số liệu dịch bệnh
LMLM từ năm 2006-2012 cho thấy khoảng 2-3 năm lại xuất hiện một đợt dịch
lớn. Từ đầu năm 2006 đến nay, số t nh có dịch LMLM là 27, trong đó 26 t nh là týp
O và Hà Giang là týp Asia1 (phát hiện tháng 5 năm 2006 bằng kit 3ABC và giám


8

định) với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh.
Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đó tồn tại và phát triển trên địa bàn 107
trong tổng số 229 huyện thuộc 26 t nh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm cho hàng
chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh.
Từ năm 1996-2011, bệnh LMLM đó xảy ra tại 2.873 (26% trong tổng số
11.020) xã, làm tổng số là 5.630 lƣợt xã có dịch thuộc 463 (66,7% trong tổng số
694) huyện thị, thành phố của tất cả 63 t nh, thành phố. Tổng số có 238.669 trâu, bò

và lợn bị bệnh trong giai đoạn này.
Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004

1.3. TRIỆU CHỨNG BỆNH TÍCH
1.3.1. Triệu chứng
Ở trâu bò và lợn hoặc các loài vật khác, bệnh có chung đặc điểm là sốt đột
ngột 2-3 ngày, viêm dạng mụn nƣớc rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân, nƣớc
bọt chảy nhiều nhƣ bọt bia. Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô,
nóng. Mụn nƣớc bắt đầu mọc ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt
lƣỡi. Kích thƣớc mụn bằng hạt gạo, hạt ngô hoặc to hơn.Mụn nƣớc phồng lên, có
màng bọc mỏng, bên trong chứa nƣớc trong, sau đục dần.Sau 1-2 ngày, mụn nƣớc
bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dƣới đỏ, chạm nhẹ vào dễ chảy máu.Mụn


9

nƣớc thƣờng không có mủ. Do viêm vùng miệng, con vật có chịu, luôn lúc lắc đầu,
nhai tóp tép, nƣớc bọt sùi ra đầy mõm miệng, chảy lòng thòng thành sợi dài.
Do có viêm mụn nƣớc ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó
chịu, tỏ ra đau đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên. Dễ thấy nhất là hiện tƣợng què,
không đi cày kéo đƣợc trong khoảng 1-2 tuần.Có trƣờng hợp móng chân bị long hẳn
ra, phổ biến nhất là ở lợn.Triệu chứng què ở cả đàn trâu bò gây ảnh hƣởng xấu đối
với vùng dựa vào sức kéo của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi năng suất lúa
bị giảm 20%.
Ở con vật cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng
tƣơng tự nhƣ ở miệng và chân làm con vật giảm tiết s a, s a bị giảm phẩm chất.
Con mẹ thƣờng không cho con bú vì đau, làm con non thiếu s a. Hơn n a chính
con non cũng bị viêm lở mồm nhƣ mẹ nên không bú đƣợc. Hậu quả có tới 50-80%
gia súc non bị chết. Ở con vật trƣởng thành, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn có serotyp đều
gây bệnh giống nhau. Súc vật cái mang thai nhiễm virus lở mồm long móng sẽ sẩy

thai. Biến chứng: Viêm cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, lợn <2 tháng).


10

Hình 1.2: Triệu chứng LMLM ở trâu, bò và lợn


11

Từ miệng tới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng xuất
huyết hoặc tụ máu.Bộ máy hô hấp cũng bị viêm.
Ở trâu bò hay gặp hiện tƣợng mặt ngoài cơ tim có nh ng vệt hoại tử màu
trắng xen kẽ trông giống nhƣ da hổnên gọi là “tim vằn hổ”.
Bệnh lở mồm long móng ở ngƣời: Lây nhiễm bệnh lở mồm long móng ở
ngƣời khá hiếm và nhẹ. Đôi khi gặp ở ngƣời hay tiếp xúc với gia súc có bệnh hoặc
với virus trong phòng thí nghiệm nhƣ ngƣời chăn nuôi, chăm sóc gia súc, cán bộ thú
y, công nhân lò mổ, nhân viên phòng thí nghiệm. Đôi khi do uống s a nhiễm mầm
bệnh không tiệt trùng kỹ, hoặc qua vết trầy xƣớc trên da. Biểu hiện là có mụn nƣớc
nổi trên da ở tay, chân và lƣỡi, lợi, có cảm giác ngứa ngáy và hơi nóng rát. Mụn
nƣớc có thể tự vỡ ra hoặc xẹp đi sau.
1.3.2. Đƣờng xâm nhập của virus và phƣơng thức lây lan
Virus xâm nhập chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa và qua phần trên của đƣờng hô
hấp từ nh ng hạt không khí nhỏ đƣợc hít vào hoặc chạm trực tiếp, hay đƣợc vận
chuyển đến vùng hầu bởi các hoạt động niêm dịch. Lúc này lƣợng kháng thể trung
hoà có trong huyết thanh gia súc không ảnh hƣởng đến virus (đây chính là cơ chế để
tạo ra nh ng con vật mang trùng). Virus xâm nhập vào vùng hầu, cƣ trú trong các tế
bào biểu bì vùng nhầy ở họng, các tế bào này dẫn đến màng nhày tuyến nội tiết rồi
ở trong lớp biểu bì lƣỡi nối với hốc ở hạch lympho và lan sang các tế bào kế cận,
các hệ thống lƣu thông và hệ hạch lâm ba dẫn tới các tế bào, cơ quan khắp cơ thể,

gây sốt và các triệu chứng lâm sàng điển hình..
Da nguyên lành không cho virus đi qua. Nếu có vết xƣớc hay sây sát hoặc có
vết thƣơng ở da, nhất là ở vú thì đó chính là nơi virus xâm nhập vào cơ thể dễ dàng.
Virus có thể đi qua đƣờng sinh dục, qua các niêm mạc, qua da của vành móng. Khi
con vật mang bệnh, các mụn nƣớc, vẩy mụn có chứa rất nhiều virus, nhiều nhất ở
trong nƣớc của mụn tiên phát và mới mọc (khoảng 2 ngày trở lên).
Một đặc điểm quan trọng của bệnh LMLM là việc thải virus đƣợc diễn ra
trong suốt giai đoạn ủ bệnh và một thời gian sau khi phát bệnh. Do đó khả năng gây
ô nhiễm môi trƣờng là rất cao và khả năng lây nhiễm sang các con vật khác sẽ xảy


12

ra trƣớc khi con vật biểu hiện triệu chứng lâm sàng ban đầu. Virus đƣợc thải ra
ngoài qua nƣớc bọt, phân, nƣớc mụn và mảnh ngoại bì của mụn bị vì ra trên niêm
mạc lƣỡi và miệng, qua các mụn ở chân, vú và các nơi khác. Trong s a, nƣớc tiểu,
phân có ít virus hơn.
1.3.3 Thời kỳ ủ bệnh
Từ 1-7 ngày, trung bình 3 -4 ngày.Trong suốt thời gian từ khi có các triệu
chứng đầu tiên đến khi khỏi bệnh.Nhiều trâu bò sau khi khỏi bệnh vẫn còn mang
trùng và thải trùng hàng tháng, có trƣờng hợp tới 3 năm. Lợn có vai trò thải trùng
rất lớn, gấp nhiều lần trâu bò khi đang có triệu chứng, nhƣng sau khi khỏi lâm sàng,
lợn vẫn thải virut sau 1-2 tháng, trâu bò sau khỏi lâm sàng vẫn thải virut 6-24 tháng.
Đây là đặc điểm quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh ở gia súc. Sức đề
kháng của mầm bệnh với điều kiện tự nhiên và thuốc sát trùng.
1.4 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG
1.4.1 Hình thái và cấu tạo
Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae nhóm
Aphthovirus,có kích thƣớc 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt virus chứa
30% acid nucleic, là một đoạn RNA.Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome, mỗi

capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus protein) ký hiệu VP1(1D), VP2 (1C),
VP3 (1B), VP4 (1A). 4 loại VP này đều có nguồn gốc từVP0, VP1 ở lớp ngoài
cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố định virus trên màng tế bào, có tính
sinh miễn dịch chủ yếu, là loại kháng nguyên chính tạo kháng thể chống lại virus
gây bệnh LMLM.


13

Hình 1.3: Hình thái virus LMLM
Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của chúng đƣợc
cấu tạo bởi một màng lipid. Do vậy chúng có sức đề kháng cao đối với các loại
dung môi h u cơ (nhƣ cồn, ete…). Tuy nhiên, virus LMLM lại rất mẫn cảm với
ánh sáng mặt trời, acid, formol…
1.4.2 Phân loại
Virus LMLM đƣợc hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu
đầu tiên vào năm 1987. Cho đến năm 1902, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Carée
lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò đƣợc
gọi là type O (phân lập đƣợc tại vùng Oisée- Pháp) và type A (phân lập đƣợc tại
vùng Ardène- Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức. Năm 1926 hai nhà khoa học Đức
là Waldmann và Trautwein đã phân lập đƣợc 3 type virus LMLM và đặt tên là A, B,
C. Nhƣng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B có đặc tính giống với
2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập đƣợc trƣớc đó. Cho đến năm
1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọi các type là O, A, C.
Type Asia 1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, đaya là type
hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á (cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan,
Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…).


14

Type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern African Teritoties) tìm thấy ở Nam Phi
và đƣợc giám định tại viện Pirbright (Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và
Bắc Rhodesia. Các type này chủ yếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông
Phi, Saudan, Ai cập…) phổ biến nhất là các type SAT1, mới đây cũng thấy type
SAT1 tại vùng Trung Cận Đông.
Nhƣ vậy virus LMLM có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia
1các type khác nhau có độc lực khác nhau. Nh ng virus này thƣờng biến hóa không
ngừng thành nh ng chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên, tồn tại bền
v ng, đã có hơn 70 phân type đƣợc xác định vì vậy phải thƣờng xuyên chẩn đoán
định chủng virus chính xác qua xét nghiệm tại phòng thí nghiệm thì mới chọn đƣợc
loại vácxin thích hợp để phòng cho từng vùng và từng thời kỳ.
Các type virus LMLM gây nh ng triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhƣng
không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau. Đây chính là một khó khăn về kỹ thuật
và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh thích hợp cho
từng khu vực dịch.
Phƣơng pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên. Cho đến nay
chƣa phát hiện thêm type nào mới nhƣng các chủng virus LMLM do có genome là
RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới. Trƣớc đây các subtype
thƣờng đƣợc ký hiệu bằng số mũ nhƣ O1, A32…thì nay ngƣời ta thống nhất ký hiệu
là O1, A32…
1.5. CẤU TRÚC HỆ GEN CỦA VIRUS LMLM
Cấu trúc của virus LMLM là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA
mạch đơn chứa 8500 nucleotide đƣợc đóng gói trong một vỏ protein đƣợc tạo thành
từ 60 capsome, không vỏ bọc. Mỗi capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus
protein) ký hiệu VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B), VP4 (1A). 4 loại VP này đều có
nguồn gốc từ VP0, VP1 ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố
định virus trên màng tế bào, có tính sinh miễn dịch chủ yếu.Ngƣời ta đã ứng dụng
phát hiện này để điều chế vacxin cho hiệu quả cao với VP1 (dẫn liệu của Lê Anh

15

Phụng, 1996; Trần Thanh Phong, 1996). Do có đặc điểm của các virus sợi đơn (+)
RNA, virus có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh.
Bộ gene gồm vùng không giải mã (UTR: untranslated region) dài 1200 base ở
đầu 5’ (5’UTR) (có vai trò quan trọng trong việc giải mã, độc lực, hình thành
capsid), vùng này chứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary
structure), và đƣợc biết nhƣ là vị trí để tiến vào bên trong ribosome (IRES:
international ribosome entry site) và đầu 3’ (3’UTR). Phần giải mã protein cấu trúc
(1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD).Ch thị phần
tử sử dụng nhiều nhất trong định type và nghiên cứu phả hệ virus lở mồm long
móng là 5’UTR và VP1.Cả hai đầu của bộ gene có thể đƣợc thay đổi, đầu 5’ tận
cùng bởi VPg (genome-linked protein) (khoảng 23 acid amin), đầu 3’ bởi chuổi dài
adenyl (King, 2000).

Hình 1.4: Cấu trúc vỏ ngoài cuả virus LMLM


16

Vỏ protein ngoài của virus đƣợc tạo thành từ 60 bản copy của mỗi loại
protein 1A (VP4), 1B (VP2), 1C (VP3), và 1D (VP1). 4 loại protein này lắp ráp
thành một đơn vị thay thế protein (protein sub-unit) hay một protomer. 5 protomer
kết hợp thành 1pentamer.12 pentamer đóng gói vào sợi RNA và tạo thành hạt virus.
Cấu trúc antigenic của virutsLMLM: từ lâu đã đƣợc biết rằng điểm chính gắn
tế bào và vùng miễn dịch trội (immunodominant) của LMLM đều nằm trên vùng
phơi nhiễm dung môi ở bề mặt của virion, gọi là vùng mẫn cảm trypsin của VP1.
Nh ng nghiên cứu trƣớc đây cho thấy các serotypes virus LMLM khác nhau có
vùng biến đổi cao trong VP1, gồm các gốc từ 135-155, nhƣ một trong nh ng điểm

kháng nguyên chính của virus. Một vài epitopes tế bào B gối lên nhau nằm trong
vùng này và có khả năng cảm ứng cả đáp ứng kháng thể không trung hòa và trung
hòa. Sự thay đổi trình tự cao trong vùng này là nguyên nhân phản ứng chéo thấp
gi a các serotypes khác nhau.
Sự thay đổi kháng nguyên và di truyền của virus LMLM: RNA viruses có
đặc điểm sao chép RNA lỗi (error-prone RNA replication), làm chúng có tiềm năng
thay đổi mạnh. Trong genome của virus LMLM, sự tƣơng đồng trình tự gi a các
serotypes khác nhau có thể ch 25-40% trong khi sự tƣơng đồng gi a các subtypes
của một serotype thƣờng trên 60-70%. Vận tốc đột biến cao trong quá trình sao
chép cho phép FMDV luôn có mặt và thích ứng với môi trƣờng.Một trong nh ng hệ
quả rắc rối nhất của sự biến đổi di truyền là sự đa dạng kháng nguyên (antigenic).
Sự đa dạng này kéo theo nh ng rắc rối trong việc thiết kế vắc xin, vì vắc xins tổng
hợp nên có nhiều epitopes độc lập để giảm khả năng chọn lọc của tính đề kháng
virus LMLM đến đáp ứng miễn dịch.
1.6. HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG
Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng là công cụ dùng để biểu hiện protein có
cấu trúc phức tạp. Một trong nh ng ƣu thế của hệ thống này là cung cấp nhanh
chóng protein có hoạt tính sinh học.Ngoài ra, nó còn đƣợc dùng để sản xuất kháng
nguyên của virus.
Baculovirus là tác nhân gây bệnh ở côn trùng và không có khả năng sao chép