Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường ruột mang gen KPC và NDM 1 tại bệnh viện hữu nghị việt đức từ tháng 12 2016 đến tháng 4 2017

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: “XÁC ĐỊNH TỈ LỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT
MANG GEN KPC VÀ NDM-1 TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ
VIỆT ĐỨC TỪ THÁNG 12/2016 ĐẾN THÁNG 4/2017”

Ngƣời hƣớng dẫn:

Th.s Nguyễn Thị Vân

Sinh viên thực hiện:

Phan Ngọc Hà

Lớp:

13-01
Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp tôi dã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin
được bày tỏ lòng biết ơn sau sắc tới những sự giúp đỡ này.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Th.s
Nguyễn Thị Vân – Trưởng khoa Vi sinh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức,
người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn KTV. Nguyễn Thành Đô và KTV. Đoàn

Anh Tuấn cùng các cán bộ khoa Vi sinh, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô của khoa
Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo
trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người
đã luôn bênh cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện tuận lợi giúp tôi học
tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Phan Ngọc Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 1
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... 2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ 3
MỞ ĐẦU: ......................................................................................................... 5
PHẦN I: TỔNG QUAN .................................................................................. 7
1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện:........................................................................... 7
1.2. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh .............................................. 10
1.2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh: .................................................... 10
1.2.2. Sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn:........................................... 11
1.2.2.1. Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn:..... 11
1.2.2.2. Phân loại đề kháng ................................................................ 11
1.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn ...................................... 12
1.2.3.1. Thay đổi đích tác động ........................................................... 12
1.2.3.2. Tạo ra các enzym .................................................................... 13
1.2.3.3. Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất ....................... 13

1.3. Carbapenem và cơ chế kháng Carbapenem: ...................................... 13
1.3.1. Carbapenem: ................................................................................. 13
1.3.2. Cơ chế kháng cabapenem: ........................................................... 14
1.4. Tổng quan về KPC và NDM-1:............................................................. 15
1.4.1. Tên loài và phân loại: ................................................................... 15
1.4.2. Lịch sử và phân bố: .................................................................... 17
1.4.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số vi khuẩn mang
gen KPC và NDM-1: ............................................................................... 18
1.4.4. Đặc điểm dịch tễ học:.................................................................... 23
1.4.5. Đặc điểm lâm sàng: ....................................................................... 26
1.4.6. Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn mang gen KPC và
NDM-1 ...................................................................................................... 28
1.5. Tình hình nghiên cứu tính đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang
gen KPC và NDM-1 ................................................................................ 30


1.5.1. Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC
và NDM-1 trên Thế giới. ........................................................................ 31
1.5.2. Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC
và NDM-1 ở Việt Nam: ........................................................................... 32
1.6. Ứng dụng CNSH vào xác định gen kháng kháng sinh Cabapenem: 33
1.6.1. Phƣơng pháp PCR: ....................................................................... 33
1.6.2. Phƣơng pháp Realtime PCR: ...................................................... 35
1.6.3. Cách xác định KPC và NDM-1: .................................................. 36
1.6.4. Quy trình sử dụng hệ thống realtime PCR ABI của Mỹ: ......... 36
PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:............................................. 40
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu: .............................................. 40
2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Hữu nghị Hà Nội Việt Đức làm
địa điểm nghiên cứu. ................................................................................. 40
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu: .................................................................. 40

2.1.3. Lấy mẫu thuận tiện ....................................................................... 40
2.2. Vật liệu nghiên cứu: ............................................................................... 40
2.3. Phƣơng pháp: ......................................................................................... 41
2.3.1: Nuôi cấy vi khuẩn ái khí: ............................................................. 41
2.3.2. Thử nghiệm kháng sinh đồ với vi khuẩn ái khí: ....................... 41
2.3.3. Xác định gen KPC và NDM-1bằng hệ thống Realtime ABI của
Mỹ:............................................................................................................ 41
2.3.3.1.Chuẩn bị cho phƣơng pháp realtime PCR xác định gen KPC
và NDM1 ............................................................................................... 41
2.3.3.3. Tiến hành:................................................................................ 42
2.4. Phân tích và xử lý số liệu: ...................................................................... 45
2.4.1. Phân tích và xử lý số liệu: ............................................................ 46
2.4.2. Kiểm soát sai số có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu: ..... 46
PHẦN III: KẾT QUẢ ................................................................................... 48
1.Tổng số bệnh nhân: 41 ............................................................................... 48
2. Phân loại bệnh phẩm theo khoa............................................................... 48
3.Tỉ lệ bệnh nhân theo chẩn đoán. ............................................................... 49


4. Tỉ lệ các loại bệnh phẩm ........................................................................... 50
5. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn toàn kháng phân lập đƣợc ............................. 50
6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh .................................................................. 50
6.1. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 41 chủng. ................................ 50
6.2. K.pneumoniae (26 chủng) ................................................................ 51
6.3. E.coli (6 chủng) ................................................................................. 51
7. Tỷ lệ KPC/NDM1 ...................................................................................... 52
8. Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo từng loại vi khuẩn ........................ 52
9. Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo bệnh phẩm .................................... 53
10. Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo khoa .............................................. 54
BÀN LUẬN .................................................................................................... 55

KẾT LUẬN .................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 57
DANH MỤC BỆNH NHÂN


DANH MỤC BỆNH NHÂN
STT

TÊN BỆNH NHÂN

NGÀY NHẬN

NGÀY TRẢ

BỆNH PHẨM

KẾT QUẢ

1

BẾ XUÂN A

6/12/2016

8/12/2016

2

HOÀNG VĂN B

5/12/2016

8/12/2016

3

NGUYỄN BÁ C

4/12/2016

8/12/2016

4

ĐÀO VĂN D

15/12/2016

19/12/2016

5

TÔ VĂN E

13/12/2016

19/12/2016

6

TRẦN THỊ F

19/12/2016

23/12/2016

7

VŨ HỒNG G

21/12/2016

26/12/2016

8

LÊ THANH H

28/12/2016

31/12/2016

9

NGUYỄN KHẮC K

27/12/2016

31/12/2016

10

VŨ VĂN L

28/12/2016

31/12/2016

11

BÙI HỒNG Z

29/12/2016

3/1/2017

12

HOÀNG VIỆT T

29/12/2016

3/1/2017

13

NGUYỄN THANH V

30/12/2016

3/1/2017

14

ĐINH VĂN N

9/1/2017

12/1/2017

15

NGUYỄN HỮU M

9/1/2017

12/1/2017


16

NGUYỄN MẠNH S

9/1/2017

16/1/2017

17

BÙI NGỌC Q

12/1/2017

16/1/2017

18

ĐỖ THỊ K

13/2/2017

13/2/2017

19

VI VĂN P

13/2/2017

13/2/2017

20

PHẠM VĂN T

13/2/2017

13/2/2017

21

NGUYỄN ĐỨC R

16/2/2017

17/2/2017

22

NGUYỄN THỊ I

16/2/2017

17/2/2017

23

NGÔ THỊ Y

20/2/2017

20/2/2017

24

LÊ THỊ U

24/2/2017

27/2/2017

25

HỒ THỊ T

6/3/2017

6/3/2017

26

TRẦN THỊ P

6/3/2017

6/3/2017

27

TO VĂN R

31/3/2017

3/4/2017

28

HOÀNG THỊ B

7/4/2017

11/4/2017

29

NGUYỄN KIM D

5/4/2017

10/4/2017

30

LÊ THỊ H

12/4/2017

17/4/2017

31

NGUYỄN VĂN H

18/4/2017

21/4/2017

32

ĐÀO TIẾN A

12/4/2017

14/4/2017

33

TẠ VĂN M

12/4/2017

14/4/2017


34

NGUYỄN ĐĂNG N

12/4/2017

17/4/2017

35

CAO ĐẮC R

12/4/2017

14/4/2017

36

PHẠM VĂN K

17/4/2017

21/4/2017

37

NGUYỄN TIẾN A

18/4/2017

21/4/2017

38

CẤN XUÂN V

20/4/2017

24/4/2017

39

ĐÀO ĐỨC Q

20/4/2017

24/4/2017

40

NGUYỄN THỊ L

25/4/2017

28/4/2017

41

NGUYỄN THÁI Z

26/4/2017

28/4/2017


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Đặc điểm phân tử của KPC- sản xuấ phân lập ở Ontario
2008/2011

29

2.1

Trang thiết bị dùng trong thí nghiệm

40

2.2

Trình tự mồi để phát hiện gen KPC và NDM-1

42

3.1

Phân loại bệnh phẩm theo khoa

47

3.2

Tỉ lệ bệnh nhân theo chuẩn đoán

48

3.3

Tỉ lệ các loại bệnh phẩm

49

3.4

Tỉ lệ các chủng vi khuẩn toàn kháng phân lập được

49

3.5

Mức độ nhayn cảm kháng sinh

50

3.6

Các chủng K. pneumonia

50

3.7

Các chủng E. coli

51

3.8

Tỷ lệ KPC/ NDM-1

51

3.9

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo từng loại vi khuẩn

51

3.10

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo bệnh phẩm

52

3.11

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo khoa

53

1


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện

6

1.2

Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập
cao

7

1.3

Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập
thấp và trung bình

8

1.4

Cơ chế kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm

11

1.5

Cấu trúc phân tử của Carbapenem

13

1.6

Đặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của các
chủng K. pneumonia

16

1.7

So sánh trình tự các amino acid của NDM-1 với các trình tự
amino acid của IMP1, IMP2, IMP-8,…..

16

1.8

Hình ảnh chụp hiển vi hình thái siêu cấu trúc của K.
pneumonia

18

1.9

Hình ảnh vi khuẩn K. pneumonia được nuôi trên thạch máu

18

1.10 Hình ảnh k.pneumoniae thử trên canh thang

19

1.11 Một số phản ứng hóa học của K. pneumonia

19

1.12 Hình thái của vi khuẩn E. coli

20

1.13 E. coli nuôi cấy trên một số môi trường thạch

21

1.14 Hình ảnh 1 số phản ứng hóa học củ E. coli

21

1.15 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn mang gen NDM-1 trên thế giới

23

2


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký
hiệu

DNA
Bp
CDC
ESBL
GARP
MBLs
MLST

KPC

NDM1
PCR
PFGE
WHO
RNA
MIC
kDa
SIM
AMC
TCC

Viết giải nghĩa tiếng
việt
Deoxyribonucleic Acid
Phân tử axit nucleic
Đơn vị đo trọng lượng
Base pair
của phân tử DNA
Centers for Disease Control and
Trung tâm kiểm soát và

Prevention
phòng ngừa bệnh dịch
Enzym kháng kháng sinh
Extended-spectrum beta-lactamases
phổ rộng beta lactam
Hiệp hội kháng kháng
Global Antibiotic Resistance Partnership
sinh toàn cầu
Enzym kháng kháng sinh
Metallo-beta-lactamase
nhóm beta lactam
Phân loại dựa trên đa
Multilocus Sequence Typing
điểm của trình tự gen
Enzyme kháng
carbapennem phát hiện
Klebsiella pneumoniae carbapenemase
trên các chủng Klebsiella
pneumonia
New Delhi Metallo-betaNew Delhi Metallo-beta-lactamase-1
lactamase-1 kháng
carbapenem
Chuỗi phản ứng trùng
Polymerase chain reaction
hợp
Pulsed-field gel electrophoresis
Điện di xung trường
World Health Orgnization
Tổ chức Y tế Thế giới
Ribonucleotide acid

Phân tử axit nucleic
Minimum inhibitory concentration
Nồng đọ ức chế tối thiểu
Đơn vị đo lượng phân tử
Kilo daton
của DNA
Enzyme ly giải
Seoul imipenemase
imipenem đặt theo tên
thủ đô Seoul
Amoxicicllin/ acid clavulanic
Một loại kháng sinh
Ticarcillin + clavulanate
Một loại kháng sinh
Viết đầy đủ tiếng anh

3


TZP
CAZ
CMX
CTX
ETP
CIP
GM
IPM
MEM
SXT
TGC

AK

Piperacillin + Tazobactam
Ceftazidime
Cefuroxime
Cefotaxime
Ertapenem
Ciprofloxacin
Gentamicin
Imipenem
Meropenem
Co-trimoxazole
Tygecycline
Amikacin

Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh
Một loại kháng sinh

4

MỞ ĐẦU:
Cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở K. pneumoniae là tiết enzym
Klebsiella pneumoniae carabapenemase (KPC). Gen mã hóa KPC hiện diện
trên transposon Tn4401, một cấu trúc có khả năng giúp lan truyền tính kháng
làm cho gen này không chỉ hiện diện ở K. pneumoniae, mà đã chuyển sang
cho các vi khuẩn khác và gây nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao
trên thế giới. Thu thập được 26/41 chủng K. pneumoniae từ các chủng đề
kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ tháng7 đến
tháng 9 năm 2016. Khảo sát đặc tính kháng thuốc ở các chủng này cho thấy
các chủng đã đề kháng từ 9 đến 15 loại kháng sinh thường được sử dụng
trong điều trị nhiễm khuẩn; 88.4 đến 100% số chủng kháng với ampicillin và
cephalosporin các thế hệ; 96.2 đến 100% kháng carbapenem, 84.6 đến 100
0% kháng quinolone; 16% kháng amikacin. Sử dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử để xác nhận được sự hiện diện của gen mã hóa KPC trong 46.2% và
gen mã hóa NDM-1 trong 34.6% số chủng. Nghiên cứu đặc điểm phân tử của
các chủng mang gen mã hóa KPC cho thấy kiểu gen đề kháng carbapenem là
gen mã hóa KPC. Gen này được tạo dòng và biểu hiện thành công với cả
promoter tự nhiên và promoter T7 thành KPC tái tổ hợp ở dạng vạch protein
có kích thước 29 kDa và có khối lượng phân tử 29,542 Da, tương ứng với
kích thước và khối lượng theo tính toán của KPC. Protein KPC tái tổ hợp có
hoạt tính carabapenemase, và cho thấy có vai trò quan trọng trong hình thành
tính kháng carbapenem ở các chủng này.
Trong 2 năm gần đây bệnh viện Hữu nghị Việt Đức đã xuất hiện 1
chủng K. peumoniae kháng hầu hết các kháng sinh thử nghiệm: AMC, CFs,
Quinolon, AG, Carbapenem. Các chủng này được xác định gen KPC và
NDM-1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử Realtime PCR với độ nhậy và độ đặc
hiệu cao.

5

KPC là gen kháng thuốc được gen mã hóa nằm trên plasmid. Trình tự gen
KPC nằm giữa trình tự transposon Tn 44001. Việc kết hợp KPC với họ gen
khác làm tăng kháng thuốc và di truyền ngang nên nguy cơ kháng thuốc càng
cao. KPC và NDM-1 là các gen mã hóa quy định tính trạng kháng thuốc
kháng sinh nhóm Carbapenem: Ertapenem, Imipenem, Meropemnem,
Doripenem.
Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenem (KPC) K.pneumoniae đã gây
ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm trọng.
Do khả năng lan truyền gen KPC có tích chất thành dịch nên mức độ nghiêm
trọng và cũng là thách thức cho điều trị. Việc xác định gen kháng thuốc như
KPC và NDM1 cần thiết để phòng dịch tránh lây lan từ người bệnh này sang
người bệnh khác từ người bệnh lan ra ngoài cộng đồng. Chính vì vậy, cần
thiết lập hệ thống giám sát vi khuẩn toàn kháng và siêu kháng, đặc biệt cần
xác định rõ ở các chủng vi khuẩn này mang những loại gen kháng thuốc nào
để xây dựng các quy định, hưỡng dẫn dựa trên bằng chứng góp phần làm
giảm nhiễm khuẩn bệnh viện, giảm tỉ lệ tử vong và giảm chi phí cho người
bệnh.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường
ruột mang gen KPC và NDM-1 tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ tháng
12/2016 đến tháng 4/2017” với mục tiêu là:
- Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường ruột mang gen KPC và NDM-1 tại bệnh viện
Hữu nghị Việt Đức.

6


PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện:

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospital-acquired
infection hay nosocomial infection) là “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc
phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện không thấy
có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào. Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất
hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện”.

NKBV
48 giờ

Thời điểm nhập viện

Thời điểm nằm viện

Thời điểm ra viện

Hình 1.1. Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện
Để chẩn đoán nhiễm khuẩn bệnh viện, người ta thường dựa vào định
nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí nhiễm khuẩn bệnh viện. Hiện
nay, theo hướng dẫn từ Trung tâm Giám sát và Phòng bệnh Hoa Kỳ (CDC) và
các hội nghị quốc tế đã mở rộng định nghĩa ca bệnh cho các vị trí nhiễm
khuẩn khác nhau và đang được áp dụng để giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện
trên toàn cầu. Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học, các nhà khoa học
đã xác địnhcó khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra
tại bệnh viện.
Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động
đến sức khoẻ toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm
7


khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh

viện tính chung cho các quốc gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5%
đến 12% (Hình 1.2) và tỷ lệ chung cho tất cả các quốc gia này vào khoảng
7,6% [40]. Theo ước tính của trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh châu
Âu, hàng năm có khoảng 4.100.000 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện và
khoảng 37.000 trường hợp tử vong. Phần lớn các trường hợp là nhiễm khuẩn
tiết niệu tiếp theo là nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn sau khi phẫu
thuật, nhiễm khuẩn huyết và một số nhiễm khuẩn khác (bao gồm tiêu chảy do
Clostridium difficile). Tại Mỹ năm 2002, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện vào
khoảng 4,5% tương đương với khoảng 1,7 triệu bệnh nhân bị mắc nhiễm
khuẩn. Nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm tỷ lệ cao nhất (36%) tiếp theo là
nhiễm khuẩn vết mổ (20%), nhiễm trùng huyết và viêm phổi (11%) [20].

Hình 1.2. Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nƣớc có thu nhập
cao *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health CareAssociated Infection Worldwide) [40]
Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện ở các quốc gia có thu nhập trung bình và
thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% và tỷ lệ tính chung là khoảng 10,1/100
bệnh nhân (Hình 1.3) [40]. Trong đó nhiễm khuẩn vết mổ chiếm tỷ lệ cao
nhất (29,1%), nhiễm khuẩn tiết niệu (23,9%), nhiễm khuẩn huyết (19,1%),
đường hô hấp (14,8%) và các nhiễm khuẩn khác là 13,1% [40].
8


Hình 1.3. Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nƣớc có thu nhập
thấp và trung bình *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic
Health Care-Associated Infection Worldwide) [40]
Có rất nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và sự tác động của
các tác nhân này cũng rất khác nhau giữa các nhóm bệnh nhân, các bệnh viện,
khoa điều trị và giữa các quốc gia. Đặc biệt trong 10 năm vừa qua các vi
khuẩn Gram âm như Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K.
pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) và Acinetobacter

baumanii (A. baumannii) là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn nặng
trong các bệnh viện như nhiễm khuẩn vết mổ, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết,
đặc biệt khi các vi khuẩn này đã kháng lại các nhóm kháng sinh thế thệ mới
đắt tiền được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện như cephalosporin
và carbapenem là kháng sinh mạnh nhất hiện nay gia tăng một cách nhanh
chóng trên toàn thế giới. Điều này đe doạ thực sự đến hiệu quả điều trị cho
bệnh nhân tại các bệnh viện trên toàn thế giới [21, 28, 30, 41].
1.2. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
Kháng sinh được phát hiện ở thế kỷ 20 và lập tức đóng vai trò quan
trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng. Cùng với việc cải thiện
điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã
9


góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhiễm trùng và tuổi
thọ của con người đã được nâng cao. Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh
khác nhau đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho
công tác điều trị. Tuy nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng
kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu
trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra các giải pháp phòng chống một
cách hiệu quả.
1.2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh:
Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát
minh ra loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin, trong nghiên cứu
tác giả quan sát thấy ở trên các đĩa thạch bị nhiễm nấm penicillin (mold
Penicillium notatum) có khả năng ức chế sự phát triển của tụ cầu, ở trên các
đĩa thạch này xuất hiện một vòng vô khuẩn xung quanh khóm nấm do tụ cầu
không có khả năng mọc xung quanh khóm nấm. Tuy nhiên phải đến năm
1939, Ernst Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất
penicillin và được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh

thế giới lần thứ II. Năm 1946, penicillin bắt đầu được sử dụng trong lâm sàng
và có đóng góp to lớn cho y học. Những phát minh này đã tạo ra một cuộc
cách mạng khoa học trong nền y học hiện đại và làm tiền đề nghiên cứu và
phát triển nhiều hợp chất kháng sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên [32].
Thập kỷ 50 đến 70 của thế kỷ 20 được coi là thời kỳ hoàng kim
của kháng sinh, nhiều loại kháng sinh mới đã được giới thiệu bao gồm:
streptomycin, chloramphenicol và tetracycline được sử dụng điều trị các bệnh
nhiễm trùng do vi khuẩn. Cho đến nay với sự phát triển của khoa học kỹ
thuật, nhiều nhóm và các thế hệ kháng sinh khác nhau như cephalosporin,
fluoroquinolone, macrolide và carbapenem đã được nghiên cứu và sản xuất
thành công, góp phần to lớn cho công tác phòng và điều trị các bệnh nhiễm
trùng.
10


1.2.2. Sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn:
1.2.2.1. Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn:
Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng
kháng sinh. Điều này được quan sát thấy trên một số chủng Staphylococcus
đã đề kháng với penicillin ngay sau khi được đưa vào sử dụng năm 1946.
Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi
khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng
kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh
được đưa vào sử dụng. Hiện nay hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại
một hoặc nhiều loại kháng sinh [35].
Trong thời gian gần đây, khoảng 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh
trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh thường dùng trong điều
trị, đặc biệt một số vi khuẩn như E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa và A.
baumannii đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh
mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem. Đây là một mối lo

ngại và thách thức lớn đối với nền y học hiện đại [5, 21, 25, 41].
1.2.2.2. Phân loại đề kháng
Về nguyên lý của kháng sinh là ức chế sự phát triển của vi khuẩn,
nhưng nếu trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn
vẫn phát triển được gọi là đề kháng [1]. Đề kháng được chia làm hai loại đề
kháng giả và đề kháng thật.
Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất
không phải do di truyền.
Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được
+ Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi
khuẩn không có vách thì không chịu tác động của các thuốc kháng sinh tác
động vào vách. [1]
11


+ Đề kháng thu được: là hiện tượng do một biến cố di truyền đột biến
hoặc nhận được gen đề kháng mà vi khuẩn đang từ trở nên có gen đề kháng
sinh. [1]
1.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tình trạng kháng kháng sinh của vi
khuẩn. Những cơ chế này có thể thay đổi đích tác động, tạo ra các enzym,
ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa
(tạo ra các isoenzym).
Bơm th o át d ò n g

Hình 1.4. Cơ chế

En zym p h á h ủy
kh án g sinh

kháng kháng sinh

Kh án g sinh

Kh án g sinh
Gen đ ề kh án g
kh án g sinh

của các vi khuẩn
Gram âm [11]

Kh án g sinh

En zym biến đ ổ i
kh án g sinh

1.2.3.1. Thay đổi đích tác động
Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh
không còn vị trí để tác động. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm
quinolone là ức chế hoạt động của đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym
GyrA(DNA gyrase subunit A) và ParC (topoisomerase IV) của tế bào vi
khuẩn.
1.2.3.2. Tạo ra các enzym
Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của
kháng sinh.Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế
hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được
phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh
của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và
12

phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền
dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [9, 28].
1.2.3.3. Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất
Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong
trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng
trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid [28]. Việc thâm
nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận
chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn
chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [28]. Cơ chế bơm đẩy (efflux
pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. coli và P.
aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào
[28].
1.3. Carbapenem và cơ chế kháng Carbapenem:
1.3.1. Carbapenem:
Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh β- lactam, có phổ kháng
khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của β- lactam như penicillin, các
thế hệ cephalosporin. Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của
Thienamycin, một hợp chất tự nhiên do Streptomyces cattleya ( S. cattleya)
sống trong đất tiết ra. Hoạt chất này có khả năng ức chế quá trình tổng hợp
peptidoglycan của tế bào vi khuẩn. Năm 1979 Kahan và cộng sự đã tách chiết
thành công thienamycin có độ tinh khiết cao >90%. Năm 2003, gen mã hóa
quá trình tổng hợp thienamycin của vi khuẩn S. cattleya được phát hiện và
giải trình tự, tổng hợp và phát triển thành các kháng sinh thuộc nhóm
carbapenem.
Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vòng β- lactam
hình vuông nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ
nguyên tố lưu huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi. Cấu
13

trúc đặc biệt của carbapenem tạo ra ba đặc tính giúp cabapenem có phổ tác
dụng rộng: (1) những phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử dụng những lỗ
hổng rất nhỏ của màng ngoài vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP (
penicillin- binding protein); (2) cấu trúc của carbapenem làm cho kháng sinh
này khó bị β- lactam của nhiều loại vi khuẩn cắt đứt vòng β- lactam; (3)
carbapenem có ái lực với nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn.

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của carbapenem
1.3.2. Cơ chế kháng cabapenem:
Tình hình kháng carbapenem chủ yếu do 3 cơ chế:
- Sản xuất vượt mức một loại β- lactamase không phải carbapenem như
AmpC cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài
do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh. Cơ chế
này được nhận thấy ở Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogens, Proteus
rettgeri, Citrobacter freundii, Escherichia coli, K. pneumonia [35, 36]. Ở K.
pneumoiae, kênh porin màng OmpK35 và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, sự
thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng gớp vào tính kháng
carbapenem [19].
- Sản xuất carbapenem có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt tính
thủy phân cầu amide của vòng β- lactam. Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở
K. pneumoniae [35,36]. Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase
(KPC), K. pneumoniae đã gây ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu
quả nhiêm trọng.
14


- Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối với
carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi
peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn [35, 36]. Cơ chế kháng

carbapenem này trên K. pneumoniae ít được nghiên cứu. [35, 36]
Ở K. pneumonia, vấn đề hệ thống bơm đẩy kháng sinh ra ngoài AcrAB
vó liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [19],
tuy nhiên đã có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống
này có làm cho vật chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng
kháng chéo với chloramphenicol, quinolone [7].
1.4. Tổng quan về KPC và NDM-1:
1.4.1. Tên loài và phân loại:
- Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC): là một lớp enzyme lần đầu
tiên được tìm thấy trong K. pneumonia phân lập, thuộc lớp A, nhóm 2f, bị ức
chế bởi clavulanic. Tuy nhiên nó có thể được sản xuất bởi các sinh vật khác
bao gồm Serratie spp, Enterbacter spp, E. coli,...
+ KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung
hợp hay không dung hợp. Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon
Tn44001. Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen khác nằm trên plasmid
như Fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi
khuẩn. Hơn nữa, plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng truyền
ngang giữa các loài lân cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao.
- EnzymeNewDelhimetallo-beta-lactamase1(NDM-1) kháng
carbapenem nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay, đang là vấn đề lớn đe
dọa nghiêm trọng đến sức khóe cộng đồng. Vi khuẩn mang gen NDM-1
được phát hiện ở bệnh viện và cả ở cộng đồng. Phần lớn gen mã hóa
NDM-1nằm trên plasmid, điều kiện thuận lợi để lây lan gen NDM-1 trong
quần thể vi khuẩn gram âm.
15


+New Delhimetallo-betalactamase (NDM-1) là enzyme mới thuộc nhóm B
(metallo-beta-lactamase), có trọng lượng phân tử 28kDa, được Yong và cộng sự
phát hiện lần đầu tiên năm 2008 trên chủng K.pneumoniae và E.coli phân lập từ

bệnh nhân người Thụy Ðiển bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu có tiền sử chữa bệnh
tại Ấn Ðộ[54]. Enzyme NDM-1 được phát hiện có khả năng ly giải tất cả kháng
sinh thuộc nhóm beta-lactam trừ aztreonam và sinh enzyme metallo-betalactamase
(MBL) nhưng có kết quả âm tính với các gen mã hóa MBL được phát hiện trước
đó như IMP, VIM.SIP, SPM, KHM và SIM(Hình1.6)

Hình 1.6: Ðặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của các chủng
K.pneumoniae.
Ghi chú: (A) đọan 4,3kb mang gen blaNDM-1 được nối với 4,8kb của
classIintergron (int1) mang các gen kháng kháng sinh arr-2(kháng
rifampicin),ereC(erythromycin),aadA1(gentamicin),
cmlA7(chloramphenicol)và qacEA(sulphomamide). (B)blaCMY-4 gen mã
hóa tính kháng sinh cephalothin, ampicillin và amoxicillin-clavulanic
acid[54].
+ Gen mangNDM-1tương đồng rất thấp với trình tự của các enzyme MBL
được tìm thấy trước đó và chỉ có 32,4% giống với VIM1 và VIM2(Hình1.7).

16


Hình 1.7. So sánh trình tự các amino acid của NDM-1 với các trình tự
amino acid của IMP1, IMP2, IMP-8, VIM1, VIM2, GIM1, SPM1,
SIM1 và KHM1[9].
1.4.2. Lịch sử và phân bố:
- Những thập kỷ qua đã chứng kiến sự gia tăng nhanh chóng của vi khuẩn
gram âm kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem, “ nhóm lựa chọn cuối
cùng” [55]. Chủng K. pneumonia kháng carbapenem mang gen KPC được
phát hiện đầu tiên tại Mỹ năm 1996 [46], sau đó lây lan ra toàn thế giới và
chủng K. pneumonia này là nguyên nhân gây ra dịch trong bệnh viện tại
Mỹ, các quốc gia Châu Âu, Nam Mỹ và Hy Lạp [25][37][38].

- NDM-1 được phát hiện lần đầu tiên năm 2003 vào hiện đã lây lan ra
toàn thế giới [35][32][39]. Sự xuất hiện của vi khuẩn mang gen siêu
kháng thuốc này là dấu hiệu mở đầu cho một giai đoạn mới về tình trạng
vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới. Sự lây lan của vi khuẩn kháng
carbapenem mang gen NDM-1 không chỉ giới hạn trọng phạm vi loài mà
còn có thể lan truyền sang các loại vi khuẩn gam âm khác sống bình
thường trong đường tiêu hóa người [34][43].
- Sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh như NDM-1 và KPC được tạo
điều kiện bằng chuyển ngang gen (HGT) giữa các vi khuẩn [38]. Trong số các
tác nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, HGT tạo điều kiện kết hợp của các
gen kháng kháng sinh hiệu quả nhất từ khu vực địa lý khác nhau vào plasmid
kháng đa thuốc lây lan giữa các chủng. Tái tổ hợp và chuyển vị đã tạo ra quần
thể các plasmid đã liên quan đến kiến trúc nhưng khác nhau trong thành phần
của các băng cassette kháng thuốc kháng sinh [39].. Gen kháng kháng sinh
17