XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN hóa học của các hợp CHẤT ít PHÂN cực từ rễ cây bần CHUA (sonneratia caseolaris (l ) engl )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
------------

TỪ MINH TỎ

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÁC HỢP CHẤT ÍT PHÂN CỰC
TỪ RỄ CÂY BẦN CHUA
(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUẬN VĂN ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: HÓA HỌC
Mã số: TN 338

CẦN THƠ − 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
------------

TỪ MINH TỎ

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÁC HỢP CHẤT ÍT PHÂN CỰC
TỪ RỄ CÂY BẦN CHUA
(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUẬN VĂN ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: HÓA HỌC
Mã số: TN 338

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. LÊ THANH PHƯỚC

CẦN THƠ − 2010


LỜI CẢM ƠN
------o0o-------

Để đạt được kết quả như ngày hôm nay. Em xin chân thành gửi đến quý thầy cô
thuộc bộ môn Hóa Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên lời cảm ơn sâu sắc, các thầy cô đã
truyền đạt cho em thật nhiều kiến thức, kinh nghiệm nghề nghiệp và cuộc sống vô
cùng quý báu trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện tại trường. Đó là hành trang
vững chắc không chỉ giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp mà còn là nền tảng cho sự
nghiệp của em ở tương lai.
Bên cạnh đó, đặc biệt em xin gửi lời biết ơn chân thành nhất đến thầy Lê Thanh
Phước, người thầy đã hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ và tạo động lực cho em trong suốt
thời gian làm đề tài.
Cô Tôn Nữ Liên Hương, cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã cung cấp nhiều kiến thức chuyên
ngành giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Thầy Võ Hồng Thái, cô Bùi Thị Bửu Huê, thầy Phạm Quốc Nhiên đã tạo cho em điều
kiện làm việc tốt nhất.
Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình luôn là chổ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần
giúp em vượt qua mọi khó khăn thử thách.
Cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!!!

i

TÓM TẮT LUẬN VĂN
----o0o---Cây Bần hay còn gọi là Thủy liễu (liễu nước), hải đồng, bần chua,…loài cây mà
đom đóm rất thích đậu trên lá vào ban đêm, tên khoa học là Sonneratia caseolaris (L.)
Engl., thuộc họ Lythraceae. Ở Việt Nam, bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt
khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi….Các bộ phận của cây bần được sử dụng
trong dân gian như: hoa bần chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy, giải nhiệt cảm
sốt,…Quả có thể dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm
máu,…Trong đề tài này, chúng tôi xác định thành phần hóa học của các hợp chất ít
phân cực từ rễ cây bần.
Bằng phương pháp sắc ký cột silica gel KG 60 F254 kết hợp với sắc ký lớp mỏng,
chúng tôi phân lập ra được bốn chất sạch từ cao PE. Sử dụng các dữ liệu phổ NMR đã
xác định được một chất đó là: betulinaldehyde, chất còn lại đang trong quá trình tìm
hiểu.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

TỔNG QUAN
I. ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT[2] ............................................................................2
1. Đặc Điểm Cây Bần Chua ....................................................................................2
2. Phân Bố Sinh Thái...............................................................................................4
3. Tác Dụng Dược Lý Của Cây Bần Chua .............................................................5

3.1 Y Học Dân Gian .................................................................................................5
3.2 Y Học Và Hóa Sinh Hiện Đại ............................................................................6
II. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẦN CHUA ..............................6
1. Các Công Trình Nghiên Cứu Ở Việt Nam .........................................................6
2. Các Công Trình Nghiên Cứu Trên Thế Giới[6][7] ...............................................6
2.1 Thành Phần Hóa Học Của Cây Bần Chua........................................................8
2.2 Một Số Hợp Chất Được Phân Lập Trong Cây Bần Chua..................................8
III. GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ...................................................10
1. Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng (TLC)...........................................................10
1.1 Giới Thiệu Chung Về Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng ..................................10
1.2 So Sánh Sắc Ký Lớp Mỏng Với Một Số Kỹ Thuật Sắc Ký Khác ......................11
1.3 Chất Hấp Thu Silica gel...................................................................................12
1.4 Dung Môi Giải Ly.............................................................................................13
1.5 Các Công Dụng Của Sắc Ký Lớp Mỏng...........................................................13
2. Phương Pháp Sắc Ký Cột..................................................................................14
2.1 Giới Thiệu Về Phương Pháp Sắc Ký Cột .........................................................14
2.2 Lựa Chọn Dung Môi Để Khởi Đầu Giải Ly .....................................................14
2.3 Tỷ Lệ Giữa Mẫu Chất Cần Tách Với Kích Thước Cột ....................................15
2.4 Nạp Chất Hấp Thu Dạng Sệt Vào Cột .............................................................16
2.5 Đặc Mẫu Chất Cần Tách Lên Đầu Cột Sắc Ký................................................16
2.6 Theo Dõi Quá Trình Giải Ly Cột .....................................................................18
iii


2.7 Khi Nào Thay Đổi Hệ Dung Môi Giải Ly Cột ..................................................18
I. CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH .............................................................................................................20
1. Các Phương Pháp Ngiên Cứu...........................................................................20
2. Phương Pháp Nghiên Cứu ................................................................................20
2.1 Quá Trình Thu Hái Và Xử Lý Nguyên Liệu ....................................................20

2.1.1 Thu Hái Nguyên Liệu ................................................................................20
2.1.2 Xử Lý Nguyên Liệu...................................................................................21
2.2 Quá Trình Điều Chế Thu Cao..........................................................................21
2.2.1 Quá Trình Điều Chế Thu Cao Etanol (Cao Tổng) ......................................21
2.2.2 Quá Trình Điều Chế Cao ete dầu hỏa (PE).................................................22
2.3 Cách Phân lập Các Chất Trong Rễ Bần ..........................................................23
3. Các Bước Tiến Hành.........................................................................................24
II.QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TRÊN CAO CHIẾT .24
1.Quá Trình Phân Lập Và Tinh Chế Các Chất Trên Cao PE ............................24
2. Xác Định Các Tính Chất Vật Lý Đặc Trưng Và Xác Định Cấu Trúc của Hợp
Chất Vừa Phân Lập Được ....................................................................................30
2.1. Các Đặc Tính Của Chất PHUOC-TO-01 ........................................................30
2.2 Xác Định Cấu Trúc Của Chất PHUOC-TO-01................................................30
I. KẾT LUẬN............................................................................................................34
II. ĐỀ NGHỊ..............................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN SÁCH:............................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN WEB:..............................................................35

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cây bần ven sông
Hình 2: Hoa bần
Hình 3: Thân cây và quả bần
Hình 4: Cành và quả bần
Hình 5: Các rễ bần
Hình 6: Quả bần dùng làm món ăn

Hình 7: Sắc ký cột thường cao PE
Hình 8: TLC chất sạch thứ I
Hình 9: TLC chất sạch thứ II
Hình 10: TLC chất sạch thứ III
Hình 11: TLC chất sạch thứ IV
Hình 12: TLC của PHUOC-TO-01
Hình 13: Cấu trúc của PHUOC-TO-01 (betulinaldehyde).

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác
Bảng 2: Các hóa chất sử dụng thực hiện đề tài
Bảng 3: Quá trình sắc ký cột trên cao PE đường kính 7 mm
Bảng 4: Quá trình sắc ký cột trên cao PE đường kính cột 20 mm
Bảng 5: Số liệu thực nghiệm của PHUOC-TO-01 với số liệu mô phỏng của
betulinaldehyde.

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance



Chemical shift

d

Doublet (NMR)

t

Triplet (NMR)

s

Singlet (NMR)

TLC

Thin Layer Chromatography

PE

Petroleum ether (60-90)

EtOAc, EA

Ethyl acetate

ppm

Parts per milion

Rf

Retention factor

vii


PHẦN I: TỔNG QUAN

1


I. ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT[2]
1. Đặc Điểm Cây Bần Chua
Tên Khoa Học: Sonneratia caseolaris (L.) Engl.
Tên đồng nghĩa : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris
Tên Việt Nam: Bần Chua
Tên khác: Hải đồng, Thủy Liễu
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Myrtales
Họ: Lythraceae
Chi: Sonneratia
Loài : Sonneratia caseolaris (L.)

Hình 1: Cây bần ven sông
Cây gỗ, thân cao 4-5 m hoặc hơn, luôn xanh. Rễ thở tập trung thành khóm ở quanh gốc
thân, mọc ngập sâu vào bùn. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá mọc đối, lá non hình mũi
mác dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu tù, phiến

2


lá dài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá rõ, thường rụng vào mùa đông; cuống lá
và phần gân chính ở gốc có màu đỏ.

Hình 2: Hoa bần
Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá; cuốn hoa ngắn và mập; đài có có
6 răng hình tam giác, dày hàn liền ở gốc tạo thành một ống dài 1.5 cm, mặt ngoài màu
lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn; nhị nhiều, chỉ nhị
dài, mảnh; bầu hình cầu dẹt.
Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 3 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều dẹt.
Toàn cây nhẵn.

Hình 3: Thân cây và quả bần

3


Hình 4: Cành và quả bần
Mùa hoa: tháng 3-5; mùa quả: tháng 8-10
Bộ phận dùng:
Quả, vỏ, thân và cành.

Hình 5: Các rễ bần
2. Phân Bố Sinh Thái
Chi sonneratia L.f. gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng đất
ngập mặn ven biển, ở Đông Phi, nhiệt đới châu Á, Bắc Australia và các đảo ở Thái
Bình Dương. Ở Việt Nam, chi này có 4-5 loài, trong đó bần là cây gặp khá phổ biến ở
các vùng ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến rạch Giá (Hà Tiên). Loài này
cũng được phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Philipin, New
Guinea, phần biển Đông Bắc Australia và đảo Salomon.
Bần là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các
vùng đất bùn nhảo ở các cửa sông. Nó thường mọc lẫn với các loài Kandelia candel,
Aegiceras corniculata, Excoecaria agallocha, và các loài đước – Avicenna spp… là
những đại diện không thể thiếu, tạo nên quần thể rừng ngập mặn ven biển Việt Nam.
Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ
thống rễ thở mọc trồi lên khổi mặt đất. Bần ra hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn
4


trùng và dơi. Hoa bần là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật. Cây còn được trồng
thêm nhằm chắn sóng và bảo vệ vùng đất ngập nước ở ven biển.
3. Tác Dụng Dược Lý Của Cây Bần Chua
3.1 Y Học Dân Gian
Lá bần: ở các nước Đông dương (cũ), lá bần giã nát với ít muối, đắp tại chổ chữa vết
thương bầm tím do đập đụng.
Quả bần: ở Ấn Độ quả bần được dùng làm thuốc đắp ngoài chữa bong gân sưng tấy,
dịch ép lên men từ quả có tác dụng cầm máu. Ở Malaisia, quả già là thuốc diệt giun,
còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột cari, còn lúc chín có
mùi vị giống bơ, có thể ăn tươi hoặc nấu chín.

Hình 6: Quả bần dùng làm món ăn
Hoa bần: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phần trong bài thuốc chữa đái ra máu.

Giải nhiệt chữa cảm sốt: Quả bần rửa sạch, nhai với muối, rồi nuốt nước.
Cầm máu nhất là chảy máu cam: Quả bần rửa sạch, giã nát, đắp vào vết thương, máu
sẽ cầm ngay. Tác dụng này chính là do chất pectin chứa trong dịch quả.
Tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy: Quả bần giã nhỏ, ép lấy dịch, cô thành cao mềm.
Lúc cao còn nóng phết lên giấy, khi dùng, hơ thuốc cho mềm rồi đắp lên chổ đau ngày
làm một lần.
Sử dụng làm thuốc đắp vào chỗ viêm tấy vì bong gân. Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch
quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết. Ta dùng lá giã ra, thêm tí

5


muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ. Ở Malaixia,
người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa bí tiểu tiện.
3.2 Y Học Và Hóa Sinh Hiện Đại
Hiện nay cây bần chỉ mới được sử dụng làm thuốc theo dân gian, chưa có nghiên cứu
khoa học cụ thể nào phục vụ trong y học hiện đại.

II. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẦN CHUA
1. Các Công Trình Nghiên Cứu Ở Việt Nam
Hiện nay tại Việt Nam có rất ít công trình hay đề tài khoa học nghiên cứu về cây
bần chua Sonneratia caseolaris (L.).
- Theo thông tin gần đây ngày 12 tháng 04 năm 2010 có bài báo nghiên cứu về loại
cây này, do hai tác giả là La Vũ Thùy Linh và Trương Ngọc Đức (Trường Đại Học
Tôn Đức Thắng) từ loại nguyên liệu có sẵn ở Đồng bằng Nam Bộ là rễ bần họ đã
nghiên cứu sản xuất thành công than hoạt tính.
Các tác giả cho biết, công trình đã xác định được đặc trưng của rễ bần và sản xuất
thành công than hoạt tính với điều kiện than hóa ở 450C trong 3 giờ và hoạt hóa bằng
cách tẩm muối cacbonat và nung trong môi trường CO2 ở nhiệt độ 800C trong khoảng
1 giờ…Kết quả cho thấy than hoạt tính từ rễ bần có thể thay thế các loại than hoạt tính

trên thị trường trong xử lý nước, xử lý môi trường…
- Các thông tin về cây này được giới thiệu trong sách “Những cây thuốc và vị thuốc
việt nam, Đỗ Tất Lợi, NXB Y Học, 2004”.
2. Các Công Trình Nghiên Cứu Trên Thế Giới[6][7]
Các công trình nghiên cứu về cây bần chua (Sonneratia caseolaris (L.)) ở nước ta còn
là một đề tài mới. Tuy nhiên, ở các nước khác cũng đã có nghiên cứu về loài cây này
sau đây tôi xin dẫn một vài công trình nghiên cứu của các quốc gia khác:
Nghiên cứu Flavonoids:
- Năm 2006, nhóm nghiên cứu gồm: SADHU SAMIR KUMAR(Khulna Univ.,
Khulna, Bgd)

SADHU SAMIR KUMAR(Chiba Univ., Chiba, Jpn)

AHMED

FIROJ(Khulna Univ., Khulna, Bgd) OHTSUKI TAKASHI(Chiba Univ., Chiba, Jpn)
ISHIBASHI MASAMI(Chiba Univ., Chiba, Jpn) tại Nhật Bản họ nghiên cứu về
Flavonoids từ cây Sonneratia caseolaris (L.) và đăng bài viết trên tạp chí quốc gia
bằng tiếng anh trang (264-265). Bài viết dựa trên công dụng theo dân gian của
Sonneratia caseolaris (L.) họ đã thử nghiệm trên các phần trích ra được từ cây này thử
6


khả năng kháng oxi hóa sử dụng gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) loại bỏ
ảnh hưởng của tạp chất trên sắc ký lớp mỏng. Kế theo nó định hướng có khả năng tách
rời ra và hai chất flavonoids là luteolin (1) và luteolin 7-O-β-glucoside (2) đã được
phân lập và cả hai chất trên đều có hoạt tính kháng oxi hóa.
Trên Quả:
- Năm 2008, nhóm nghiên cứu Shi-Bao Wu, Xu-Wen Li, Yun Zhao và Jin-Feng Hu
thuộc bộ môn của Các Sản Phẩm Tự Nhiên Nghiên Cứu Về hóa Chất Di Truyền và

Ying Wen, Zheng Zhao thuộc bộ bộ môn Dược Lý và Độc Chất trường Đại Học
Chuẩn Phương Đông, Trung Quốc. Họ đăng bài viết vào ngày 25 tháng 09 năm 2008
được chấp nhận ngày 18 tháng 01 năm 2009 và có tài khoản online ngày 20 tháng 02
năm 2009. Đề tài của họ là nghiên cứu thành phần hóa học trên quả của cây
Sonneratia caseolaris (L.) và Sonneratia ovata (Sonneratiaceae) và họ đã có được kết
quả như sau:
Chín chất (1-9) và bảy chất (1-6,10) lần lượt được phân lập từ quả Sonneratia
caseolaris và Sonneratia ovata. Các cấu trúc của chúng được xác định bởi sự so sánh
dữ liệu MS và NMR của chúng tốt như các đặc tính vật lý có trong lý thuyết. Tất cả
các hợp chất được phân lập được sàn lọc thử nghiệm trên chuột dãy các tế bào C-6 sử
dụng phương pháp thử nghiệm MTT; chỉ có hợp chất (-)-(R)-nyasol (1), (-)-(R)-4′-Omethylnyasol (2) và maslinic acid (6) được phát hiện có biểu hiện khả năng giết chết tế
bào.
Trên Thân và cành:
- Năm 2009, Nhóm nghiên cứu Tian, Minqing; Dai, Haofu; Li, Xiaoming; Wang,
Bingui có bài viết đăng tháng 05 năm 2009 trên tạp chí quốc gia Trung Quốc trang
(288-296). Đề tài nghiên cứu Thành Phần Hóa Học của Cây Ngập Mặn Có Dược Tính
Sonneratia caseolaris (L.). Kết quả họ có được như sau:
24 chất bao gồm 8 steroids (1-8), 9 triterpenoids (9-16,24), 3 flavonoids (20-22) và 4
dẫn xuất của benzenecarboxylic (17-19,23) đã được phân lập và xác định từ thân và
các cành non của cây Sonneratia caseolaris (L.). Cấu trúc của các chất đã phân lập
được xác định bằng phân tích nhiều dữ liệu quang phổ. Trong việc chóng lại tế bào
mang bệnh thử nghiệm SMMC-7721 các tế bào hepatoma người, chất 21
(3',4',5,7-tetrahydroxyflavone) đã biểu hiện khả năng đáng kể với IC50 2.8 μg/mL,
trong khi oleanolic acid (14), 3,3'-di-O-methyl ether ellagic acid ( 18) và 3,3',4-O-tri7


O-methyl ether ellagic acid ( 19) biểu hiện hoạt tính yếu. Không có chất nào trong số
đó biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn.
Trên hoa:
Năm 1995 nghiên cứu về thành phần hóa học trên hoa của cây Sonneratia caseolaris

(L.). Tóm tắt bài nghiên cứu như sau:
Hoa của cây Sonneratia caseolaris (L.) được làm khô. Được chiết với hexane,
dichlorometane, ethyl acetate và methanol. Chiết phân đoạn bằng cột sắc ký đã phân
lập được mười chất. Tám chất đã biết đặt tính và tính chất vật lý, TLC với các mẫu đã
chắc chắn, các phản ứng hóa học và dữ liệu phổ. Tám chất này là một hỗn hợp của một
chuỗi dài sắp xếp theo thứ tự các hydrocarbon (C23-C33), một hỗn hợp các chuỗi dài
các ester, một hỗn hợp các chuỗi dài của alcohol (C26,C30,C33), một hỗn hợp các
steroids (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và
-sitosterol-3-O--D-glucopyranoside. Hai chất còn lại đang quá trình nghiên cứu.
2.1 Thành Phần Hóa Học Của Cây Bần Chua
Trên hoa: (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và
-sitosterol-3-O--D-glucopyranoside…
Trên Quả: (-)-(R)-nyasol, (-)-(R)-4′-O-methylnyasol, maslinic acid, 4-((R,Z)-3-(4hydrophenyl)pent-1-enyl)phenol, 5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)-4H-chromen4-one (luteolin), luteolin 7-O-β-glucoside, tetrahydro-2-(hydroxymethyl)-6-phenethyl2H-pyran-3,4,5-triol,(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14btetradecahydropicene-4a-carboxylic acid (Oleanic acid)…
Trên thân và cành:
oleanolic acid, 3,3'-di-O-methyl ether ellagic acid, 3',4-O-tri-O-methyl ether ellagic acid,…

2.2 Một Số Hợp Chất Được Phân Lập Trong Cây Bần Chua
-

Luteolin

+ Tên khác: Digitoflavone, Flacitran, Luteolol…
+ Tên IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)-4H-chromen-4-one
+ Công thức phân tử: C15H10O6
+ Công thức cấu tao:

8


OH

OH
HO

O

OH

O

+ Khối lượng phân tử: 286.24 g/mol
- Luteolin 7-O-β-glucoside
+ Tên IUPAC:
7-((2S,3R,4S,5S,6R)-tetrahydro-3,4,5-trihydroxy-6-(hdroxymethyl)-2H-pyran-2yloxy)-5-hydroxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one
+ Công thức cấu tạo:
OH
OH
O

HO
HO

O

O

OH
OH

OH

O

- Oleanolic acid
+ Tên IUPAC: (4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12aheptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic
acid.
+ Công thức phân tử: C30H48O3
+ Công thức cấu tạo:

H
OH

H
HO

O

H

+ khối lượng phân tử: 456.7 g mol−1
- Kaempferol
+ Tên IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one
9


+ Phân tử khối 286,23 g/mol
+ Công thức phân tử C15H10O6
+ Công thức cấu tạo:

OH
HO

O

OH
OH

-

O

Quercetin

+ Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H- chromen-4-one
+ Phân tử khối 302,236 g/mol
+ Công thức phân tử: C15H10O7
+ Công thức cấu tạo:
OH
OH
HO

O

OH
OH

O

III. GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
1. Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng (TLC)
1.1 Giới Thiệu Chung Về Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel
KG 60 F254, hoặc oxyt nhôm. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ
lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được
tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
+ Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ…bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy.
+ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica
gel KG 60 F254, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền
10


phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ
canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polyme hữu cơ.
+ Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp
chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 microlit dung dịch mẫu với nồng
độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí
phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
+ Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm
dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao
nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc
khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các
lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện
tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silica gel KG 60 F254 hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ
di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.
1.2 So Sánh Sắc Ký Lớp Mỏng Với Một Số Kỹ Thuật Sắc Ký Khác
Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác
Sắc ký lớp Sắc ký cột Sắc ký cột Sắc ký khí

Sắc

mỏng

HPLC

cổ điển

chớp

ký

nhoáng
Cơ chế sắc Hấp
ký

Hấp thu

Hấp thu

Phân chia

Phân chia

thu/phân
chia

Tính

chất Dung

dịch Dung

dịch Dung

hợp

chất mẫu có tính mẫu có tính mẫu có tính hơi của các bay

đem

phân kém bay hơi kém bay hơi kém bay hơi hợp chất có nhiều hay ít

tích
Khả

năng Đạt

Trung bình

Tốt

dịch Khí

hoặc Mẫu có tính
hơi

tính bay hơi

đều phù hợp

Rất tốt

Rất tốt

tách chất
Thời

gian Vài

tách chất

phút Nhiều giờ

đến vài giờ

Vài

mươi Vài phút

Vài phút

phút

11


Hiệu

quả Rất tốt

Cần sắc ký Cần sắc ký Rất tốt

tách

chất

vài lần

Rất tốt

vài lần

định tính
Hiệu

quả Có thể

Cần sắc ký Cần sắc ký Rất tốt

tách

chất

vài lần

vài lần

Rất tốt

Rất tốt

Rất tốt

định lượng
Khả
tách

năng Có thể

Có

lượng

thể Rất tốt

nhưng khó

lớn mẫu

Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:
- Chỉ cần một lượng ít mẫu để phân tích.
- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân
tích.
- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp
mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ
ở dạng một mũi hấp thu rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó là mũi
(để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn.
1.3 Chất Hấp Thu Silica gel
Silica gel là chất hấp thu được sử dụng thông dụng nhất. Silica gel được sử dụng

làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác dụng
với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để
đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề
mặt…như yêu cầu. Ngoài ra người ta còn thêm các hợp chất khác để tăng khả năng
tách theo mong muốn.

H
O
Si
O
O O

H
O
Si
O

H
O
Si
O
O
O

H
O
Si
O
O

Cấu trúc mạng silica gel
12


Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol-OH; đây là những
tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất được sắc ký. Vì thế, khi
sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức
–OH, NH2, -COOH..) có khả năng tạo mối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại
trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như
alcan, terpen (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối
hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm.
1.4 Dung Môi Giải Ly
Nguyên tắc chọn dung môi: Nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng
lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không được quá dễ bay
hơi, ví dụ như etyl ete, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35C, gần bằng nhiệt độ của phòng thí
nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam). Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng bay đi
khỏi tấm lớp mỏng sau khi giải ly.
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các
hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này
giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người tat hay đổi
thành phần các dung môi sử dụng để giải ly. Thường thì người ta sử dụng với hệ hai
dung môi.
Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều
hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có
sự thay đổi nhiệt độ.
Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau vẫn tùy thuộc vào kinh nghiệm
cá nhân, nhưng những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho
người nghiên cứu.
1.5 Các Công Dụng Của Sắc Ký Lớp Mỏng
+ Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập.

+ Để kiểm tra lại hai hợp chất có giống nhau (là một chất?).
+ Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát:
* Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu.
* Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất.
* Biết được sơ bộ về thành phần phần trăm của các hợp chất có trong mẫu ban đầu.
13


* Biết sơ qua về tính phân cực của những thành phần hợp chất có trong mẫu.
+ Để chuẩn bị cho sắc ký cột:
* Tìm hệ dung môi để bắt đầu cho việc sắc ký cột.
* Để theo dõi cho quá trình sắc ký cột.
+ Để theo dõi tiến trình của một phản ứng hữu cơ.
+ Để kiểm tra một hợp chất kém bền.
+ Để cô lập hợp chất.
2. Phương Pháp Sắc Ký Cột
2.1 Giới Thiệu Về Phương Pháp Sắc Ký Cột
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là
những hạt silica gel có kích thướt tương đối lớn (50-150 μm) được nạp trong một cột
thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có
một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi
giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được
hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Hệ thống như thế thường làm cho sự
tách chậm, hiệu quả tách thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy, sắc
ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thể
triển khai với một lượng lớn mẫu chất.
2.2 Lựa Chọn Dung Môi Để Khởi Đầu Giải Ly
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ
dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước lần lượt như sau:
+ Bước 1: Mẫu cần sắc ký được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với nồng

độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A).
+ Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2.5×10 cm. Chấm lên những tấm bản này, mỗi
tấm chấm khoảng 2-5 μL dung dịch (A).
+ Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế
đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử. Với đơn dung
môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một
hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực,
thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.
+ Bước 4: Đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ (cao có nhiều hợp chất từ không phân
cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít
14


phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf = 0.5 và chọn dung môi chấm dứt
sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với
Rf = 0.2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký
cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho
dung môi giải ly.
Lưu ý:
* Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau.
* Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm trên, nhưng
phải chỉnh tỷ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với dung môi đã
chọn. Bởi vì chất hấp thu, thí dụ silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng, với kích cỡ hạt
nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bản bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn.
Trong khi đó chất hấp thu do nghiên cứu viên tự nạp cột trong phòng thí nghiệm là
loại silica gel dùng cho sắc ký cột, với cỡ hạt lớn hơn, lại được nạp vào cột ở áp suất
thường, nên có tính lỏng lẽo hơn.
2.3 Tỷ Lệ Giữa Mẫu Chất Cần Tách Với Kích Thước Cột
+ Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng:

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn
hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng). Tuy nhiên, với
hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng lớn chất hấp thu nhiều
hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng chất hấp thu ít
hơn.
Vì thế trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượng mẫu chất
muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm
một chiều cao phù hợp tromg cột mà cột vẫn còn chỗ chứa dung môi. Với lượng chất
hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thướt phù hợp.
+ Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc ký:
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp
thu nạp trong cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất háp thu: đường kính của cột vào khoảng
(10:1).
Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với cột thì cho chất hấp thu khô vào cột để
quan sát.
15


2.4 Nạp Chất Hấp Thu Dạng Sệt Vào Cột
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột không có
miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng một bông thủy tinh để chặn, tiếp theo phủ
cát lên để có được một mặt bằng phẳng.
Chất hấp thu được nạp vào cột dạng sệt được chuẩn bị như sau:
+ Trong một becher đã có sẵn dung môi (dung môi là loại dung môi ít phân cực nhất
được dùng để bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn,
mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Lưu ý không được thực hiện
ngược lại nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ
phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất.
Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt
khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.

+ Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở
khóa nhẹ ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên
dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại đầu cột.
+ Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng thanh cao
su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
+ Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột
được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, hứng
lượng dung môi này sử dụng để rót trả lại trên đầu cột. Không được để cho đầu cột bị
khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
+ Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt
thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa
thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất
hấp thu ở trên phần đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt
thoáng bằng phẳng.
2.5 Đặc Mẫu Chất Cần Tách Lên Đầu Cột Sắc Ký
Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạng dung dịch và nạp
mẫu chất dạng bột khô
+ Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: Nếu mẫu ở dạng chất lỏng, có thể cho trực tiếp
mẫu lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung
16