Đặc tính và ứng dụng của enzyme lipase,các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
~~~~~~*~~~~~~

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ ENZYME
ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE,CÁC
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME
GVHD:Th.S Trương Phước
NHÓM SVTH

:

Nguyễn Thái
Trần Thị Kim
Nguyễn Thị Yến
Bùi Phương
Đặng Ngọc

TP. Hồ Chí Minh – 2017


LỜI NÓI ĐẦU
Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm
đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các
phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học
thông thường. Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn
hòa. Đây là đặc điểm quan trọng, bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng
trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm
giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém
năng lượng.

Do đó nhóm chúng tôi xin giới thiệu đến các bạn về loại enzyme vẫn được xem
là “chất xúc tác linh động nhất” này thông qua các phần sau đây:
1.
2.
3.
4.
5.

Tổng quan về lipase
Sản xuất lipase
Phương pháp cố định lipase
Phương pháp xác định hoạt tính
Ứng dụng lipase trong đời sống và sản xuất


1.Tên enzyme...............................................................................................................................................1
2.Cấu trúc enzyme Lipase...........................................................................................................................2
3.Cơ chế sinh tổng hợp lipase.....................................................................................................................3
4.Phân loại enzyme.....................................................................................................................................4
5.Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme..........................................................................................5
5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột:......................................................................................................11
1.Các phương pháp hoá lý :......................................................................................................................15
2. Phương pháp đĩa Wilhelmy:.................................................................................................................16
3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân:....................................................................19
2.Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa..........................................................................................22
3.Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy.......................................................................22
4.Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất.......................................................................................23
5.Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế........................................................................................23
6.Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa.................................................................23
7.Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel.............................................................................................23

8.Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học)..........................................................................25

VI.Tài liệu tham khảo...................................................................................................29


I.

Tổng quan về Lipase

1. Tên enzyme
Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase.
Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester.

EC 3. Hydrolase
Nomenclature

EC 3.1. Acting
onester bonds

EC 3.1.1. Carboxylic
ester hydrolases

EC 3.1.1.3
triacylglycerol lipase
 Là enzyme tan trong nước xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol không
tan trong nước tạo thành các glyceril và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động
của nó trên bề mặt phân pha dầu-nước.
 Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ
không cắt cùng một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với
các enzyme khác như protease, amylase…

1


 Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo. Tại bề mặt phân cách
giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất.

Phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và các acid béo

2. Cấu trúc enzyme Lipase
Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate.
Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được
hoạt hóa. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ
những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid. Do đó, sự hiện
diện của serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất
hiện trong chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly.

2


3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase.
Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá
trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tb
chất của VSV.
Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên
lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng
enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp
với chính chất ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xsuc
tác của lipase.
Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử

mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh
đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference
RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã
hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA. Vì vậy số lượng enzyme được tổng
hợp sẽ giảm đi đáng kể.
Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mRNA để
tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide
này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase. Quá trình này cần một loại protein
“chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded
protein) mà không còn sử dụng được nữa.
Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hơp khá nhiều thì những
polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho
khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh
học. Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức
năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận
chuyển qua màng mmebrane. Đối với pro-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp
trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được
gấp khúc trogn suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane. Do đó, một số
protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất
để không hình thành khối protein không tan và chống lại thủy phân nội bào.
Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự
cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của
enzyme. Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp
hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất.
Đối với pro-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng
như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế
bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme.
Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể
bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này
pro- enzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn

thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phân ứng thủy phân.

3


4. Phân loại enzyme

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật, lipase từ
động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có một vài lipase
thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại.
Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm. Lipase từ nguồn thu
nhậnnày hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là
không cao.
Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn.
Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá
thông dụng. Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị
khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng. Bên cạnh đó, nguồn
lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu
hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ
tách chiết và nguyên liệu vô hạn .
 Đặc hiệu vị trí:
o Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch
triglyceride (C.rugosa).
4


o Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger).
o Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum).
 Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của
enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. (C.rugosa, A.niger,

M.miehei …)

5. Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme.
a. Nhiệt độ, pH tối ưu
Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 400C, nhưng một số lipase ở
vi sinh vật lại có tính bền nhiệt.

b. Cofactor
Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một
số các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase. Hoạt tính của
lipase bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+ và
EDTA:
Đối với Bacillus sp
• Mg2+ làm tăng hoạt tính enzyme.
• Ca2+ tăng tiết enzyme ngoại bào, tăng hoạt tính enzyme.
Đối với Geotrichum sp:
• Ca2+ 1mM có tác dụng làm tăng 6% hoạt tính enzyme.
• Hoạt tính lipase mất gần hết với Pb2+ 10mM.
• Tween 20 làm tăng 10% hoạt tính lipase.
5


• Chất tẩy rửa SDS kiềm hãm lipase hoàn toàn.
c. Cơ chế xúc tác
Hoạt tính đạt cực đại khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầunước => quá trình hoạt hóa phân pha.
Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân,
phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester và phản ứng amin hóa
(aminolysis) .
Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng
của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng.

Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân:

Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động

Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất
tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian.Giai đoạn này được hỗ trợ bởi
hoạt tính xúc tác basơ của His trong bộ ba xúc tác.

Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxh của liên kết ester
(R1OH)

Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt
động của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu
trúc tứ diện.

Giải phóng acid carboxylic (R2COOH).

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai
pha dầu –nước nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết
định hoạt tính của lipase. => đó là hoạt tính bề mặt của
enzyme.
Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để
làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa.

6


d. Cơ chất tự nhiên
Natural Substrates
Peanut press cake

Organisms
Neurospora sitophita, R.oligosporus

Wheat bran

Several filamentous fungi

Coconut oil cake
Rice bran, wheat bran

Candida rugosa
Candida sp.

Wheat bran
Rice bran

A.niger
C.rugosa

e. Môi trường nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp Lipase:
Môi trường nuôi cấy Cadida rugosa
KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g;(NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g;
inositon:
0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2
g;H2O: 1000ml.
Số tế bào nấm men cấy ban đầu 2,6x10-6 cfu/ml môi trường nuôi cấy. Thời
gian nuối cấy 40 giờ.
Môi trường nuôi cấy Bacillus sp
Môi trường BMGY với thanh phần: 1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v)

bacto-peptone, 100mM kali phosphat, pH 7.0, 4x10-5% (w/v) biotin và 1% (v/v) Methanol.
7


Chủng VSV
Sản xuất enzyme
1. Quy trình tổng
Chuyển sang môi trường đã tiệt trùng
II.

Lipase:
quát thu nhận enzyme ngoại
bào từ VSV:

Môi trường lỏng

Môi trường bán rắn
Lên men(1-7 ngày;t°:25-45°C)

Lên men(1-5 ngày;t°:25-40°C)

Đưa ra khỏi phòng ủ

Thêm chất bảo quản,chất trợ lọc
Gạn,ly tâm hoặc lọc

Tách chiết bằng nước chứa

Sấy khô

chất bảo quản

Nghiền,sàng

Loại cặn bã

Enzyme thô

Enzyme đã tách chiết trong nước
Bổ sung chất bảo quản

Bổ sung chất trợ tủa

Cô đặc chân không

Ly tâm(lọc)

Enzyme lỏng

Enzyme lỏng

Enzyme dạng rắn

đậm đặc

Nghiền,sàng
Enzyme dạng bột thô
Bổ sung (NH4)2SO4

Bổ sung dung môi

Na2SO4

hữu cơ

Thu kết tủa
Sấy khô
Nghiền,sàng
Chế phẩm enzyme thô
8


2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật,thực vật:

Nguyên liệu động
vật,thực vật

Nghiền bằng
phương pháp thích
hợp

Trích ly với dung
môi

Kết tủa

Enzyme
Tinh sạch enzyme
theo mục đích sử
dụng

Lọc thu tủa

3. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV:

Ly tâm (4000 rpm /15
min) thu dịch trong

n men
Canh trường lê

Tủa protein bằng
Amonisunfat

Enzyme

Lọc thu kết tủa
Tinh sạc
h
mục đíc enzyme theo
h sử dụ
ng

9


4. Quy trình sản xuất Lipase ngoại bào từ Cadida rugosa:
Cadida rugosa

Nấm sợi

PDA nghiêng

Sợi nấm
Tiền xử lí với HCL 2%

Erlen 250 ml
Chất nền(sấy
60°C kích
thước hạt mịn

Bảo quản
trong điều
kiện chống ẩm

Lên men

Thu bào tử nấm

Lọc hoặc ly tâm
dung dịch trong

Thu lipase thô

Tủa với sodium sulfat

Thẩm tích tách muối

Lọc gel

Cô đặc,tinh sạch
enzyme

Enzyme
10


5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột:
Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt, lại có mùi hôi, sản xuất mất
nhiều công sức và tốn kém. Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hàng đầu.
Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ VSV ngày càng chiếm ưu thế.
Người ta sử dụng sắc ký ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn kém, do
cột đắc tiền, lại không bền. Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyễn tắc sự bắt cặp giữa
enzyme và cơ chất, tạo nên phức hợp E-S. Nhưng bản thân cơ chất của enzyme được nhồi vào
cột là protein, đó là nguyên nhân mà cơ chất dễ bị biến tính và mất khả năng kết hợp với
enzyme.
Từ đó, các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng
cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C (6His
lk đặc hiệu với Ni++ trên cột sắc ký ái lực). Mà việc nhồi cột Ni ++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử
dụng rất lâu. Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi
hơn. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột biến, làm tăng khả năng
biểu hiện gen, nâng cao hoạt tính lipase.
III. Phương pháp cố định enzyme lipase:
Tuy lipase có khả năng xúc tác nhiều phản ứng có giá trị trong thực phẩm, y học, môi
trường, công nghiệp da… nhưng việc ứng dụng còn hạn chế bởi chi phí cao. Có thể khắc phục
với pp cố định enzyme với mục đích thu hồi và sử dụng nhiều lần, không tốn chi phí cho quá
trình tách bỏ enzyme sau khi thu hồi sản phẩm. Có 3 phương pháp được sử dụng:

 PP hấp phụ vật lý: Dẫn xuất enzyme lipase từ C.antarcrica B cố định trên OctadecylSepabead giữ được 100% hoạt tính sau khi ủ 200h/50°C/pH=7. Lipase được hấp phụ
trên chất mang kị nước rất ổn định với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Mặc

dù phương pháp này đơn giản nhưng dẫn xuất của enzyme này có tính ổn định nhiệt hơn
các phương pháp khác.
 PP liên kết cộng hóa trị: Lipase đã được cố định thành công nhất trên các chất mang là
chitosan, agarose, …làm tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxyl của chất mang khi cố định
enzme lipase từ C.Rugosa. Ưu điểm của carbodiimide là khả năng hoạt hóa cao, độc tính
với enzyme thấp.
 PP nhốt/bao gói: Dùng các polymer dạng hạt: chitosan(hiệu suất 50%), agarose,
alginate…
IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase
Mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme dùng để:
Đánh giá mức độ mạnh hay yếu (cường độ xúc tác) của enzyme:
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời gian
nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ, áp suất tối ưu). Xác định hoạt độ của enzyme thông
qua xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trước phản ứng.
Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng. Đối
với lipase, 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác tạo thành 1µmol acid béo
11


trong 1 phút ở điều kiện xác định.
+Đánh giá mức độ tinh khiết của enzyme.
Đơn vị của hoạt độ Enzyme
a. Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa
được miccromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 UI = 1mol cơ chất/giây
b. Katal (kat) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất
sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/giây.
1 UI = 16,67 nKat (nanoKatal
 Nguyên tắc:

Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng
enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn
gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của emzyme
được biểu hiện bằng cách làm thay đổi tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của
hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động
của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong quá
trình phản ứng.
Về nguyên tắc có thể chia ra 3 nhóm sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất
định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản
phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định.
3. Chọn nồng độ enzyme cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được
sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau :
Nhóm
1

Các thông số cố định

Các thông số thay đổi

Thời gian

Biến thiên của S hay P

Nồng độ enzym
2

Lượng cơ chất mất đi (hay

lượng sản phẩm tạo thành).

Thời gian

Nồng độ [E]
3

Thời gian

Nồng độ E

Lượng S mất đi (hay P tạo
thành)

12


Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của
những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này
sang cơ quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ enzyme thuỷ phân chất béo là chúng chỉ
xúc tác cho các phản ứng lý hoá tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ
bề mặt (kiểu xúc tác sensu stricto).
Hầu hết enzym Lipase là enzyme hoà tan được trong nước hoạt động trên những cơ chất không
tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc tác này làm cho nó khó định lượng đươc chính
xác cả về tỷ suất bề mặt cũng như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực
căng bề mặt, tính nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất
mà quá trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hoá giữa nước và các chất không tan
trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt như: các chất tẩy rửa, các chất
béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một
cách mạnh mẽ đến phương pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm không đặc hiệu

của Lipase do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví dụ
điển hình.
Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được dựa trên
hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng hoạt tính xuất hiện khi
một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất không tan trong nước.
Có nhiều phương pháp để đo hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này
có thể được phân loại như sau :
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)

Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry )
Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry ))
Phương pháp sắc ký ( Chromatography )
Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity )
Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry )
Phương pháp đục kế ( Turbidimetry )
Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry )
Phương pháp hoá học miễn dịch ( Immuno-chemistry )
Phương pháp hiển vi ( microscopy )

Những phương pháp thường sử dụng nhất được dựa vào sự chuẩn độ những axit béo tự do
được giải phóng trong suốt thời gian thuỷ phân. Tuy nhiên, những phương pháp này yêu cầu có
sự chuẩn bị của những hệ nhũ tương bền của những cơ chất và sự điều khiển pH trong thời

gian thuỷ phân. Phương pháp đồng vị phóng xạ có độ nhạy lớn hơn, nhưng yêu cầu các cơ chất
phải được đánh dấu. Phương pháp so màu (colorimetric) dựa trên sự thuỷ phân những ester của
p-nitrophenol hoặc thioesters có sẵn. Các cơ chất huỳnh quang đã được sử dụng để phân tích
Protease, phosphatase, glycosidase, sulfatase và những hoạt tính của enzym lipase. Chẳng hạn
như, rhodamine 6G thì hữu ích để đo hoạt tính của những enzym lipase và những ester của
C6NBD{ [(7-nitro-2,1,3-benzoxandiazol-4-yl)amino]-caproyl } thì thích hợp để đo hoạt tính
của những enzym phospholipase.Một dẫn xuất coumarin (C 9H8O2 : anhydrit của axit ocumarin,lacton kết tinh màu trắng, độc tìm thấy ở nhiều loại cây và chế tạo tổng hợp, được
13


dùng trong sản xuất nước hoa và xà phòng, còn gọi là 1,2-benzopyrone) cũng đã được sử dụng
để phân tích hoạt tính lipase.
Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau:
• Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão
hoà enzym nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme.
• Với những enzim cần có chất hoạt hoá hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này
vào enzyme trước khi 14hoc ơ chất vào hỗn hợp phản ứng.
• Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định. Nhưng cần phải chú ý là
pH thích hợp có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành phần dung
dịch đệm, lực iôn của dung dịch đệm ( thường trong phạm vi từ 0,01 – 0,1 )
• Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề
phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao
• Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút. Trong một số trường hợp có thể
kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ của enzyme quá thấp. Trong trường hợp đó cần phải cho
thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm
thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật.
Đối với cơ chất dạng lỏng
Ví dụ
đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành các acid béo (ở
điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cụ thể cho các thử nghiệm xác định yếu tố cụ thể

được đo trực tiếp) sau khi bất hoạt enzyme với ethanol 99,5° bằng phương pháp
chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng NaOH 0,1 N; chất chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Khi
đó, hoạt tính (HT) và hoạt tính riêng (HTR) của lipase được tính theo công thức:
HT = [(a-b)*1000*0,1] (U/mL)
Trong đó: a: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (mL);
b: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu trắng (mL).
HTR = ∑ ĐVHT/P
Trong đó: ∑ ĐVHT: Tổng số đợn vi hoạt tính enzyme/g;
P: Hàm lượng protein (mg/g).
Đối với cơ chất dạng khô
Hoạt tính xúc tác của Lipase là số đơn vị hoạt độ có trong 1g chất khô môi trường nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận enzyme. Môi trường sử dụng là bã dậu nành đã sấy khô, nên công
thức hoạt tính Lipase được biểu diễn như sau:
Hoạt tính Lpase ( IU/g) = ( V * N * 1000 * v1)/(v2 * t *m)
Trong đó:
V : hiệu số mL dung dịch NaOH chuẩn độ mãu so với mẫu trắng.
N: nồng độ đương lượng dung dịch NaOH 0.1N trong chuẩn độ.
1000: Hệ số quy đổi đơn vị.
v1: số mL nước cất dùng để trích ly mẫu canh trường rắn.
v2: số mL dịch enzyme thô đem phản ứng.
14


t: thời gian phản ứng tính bằng phút.
M: số gram môi trường bả đậu nành đem nuôi cấy.
Enzyme Lipase bên trong bộ máy tiêu hoá đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong những chu
trình cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao. Lipase hiện nay
được sử dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn lọc trong môi trường có nước ( hoặc ít
nước ) và nhiều phân tử tổng hợp mà có thể được sử dụng như những cơ chất của Lipase.
Trong quá trình này, chúng ta chỉ đề cập đến sự phân tích Lipase kéo theo sự thuỷ phân ester

Carboxylic.
Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước thấp. Hơn nữa,
người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên quan đến enzyme Lipase trong
phép phân tích lập thể chọn lọc.
Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase có thể được viết :
TAG

DAG
FFA

MAG
FFA

Glycerol
FFA

TAG = triacylglycerols
DAG = diacylglycerols
MAG = monoglycerols
FFA = free fatty acids.
1. Các phương pháp hoá lý :
1.1. Sự biến mất của cơ chất :
1.1.1. Phương pháp đo độ đục :
a) Trong môi trường rắn :
Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được
dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. Sự phân
giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch. Hiện tượng quang học này chỉ
quan sát được khi các acid béo được giải phóng ra hoà tan một phần vào nước. Quá trình sáng
màu này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm
ánh sáng khuyếch tán.

b) Trong môi trường lỏng:
Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Twees do
các enzyme Lipase khác nhau xúc tác.
Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất
nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn,
thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình. Thêm vào đó, kết quả
không hoàn toàn tuyệt đối là những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu
15


đáng tin cậy. Vì vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường
chuẩn. Bước chuẩn hoá này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy cảm này.
Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử dụng một dung
dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl2, và sử dụng esterase từ Lysobacter enzymogenes làm
nguồn enzyme. Phản ứng được theo dõi bằng việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sóng
500nm vì quá trình thuỷ phân giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng
dưới dạng muối Canxi.
Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính riêng của enzyme
Lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87 IU.mg-1) và chủng Candida
cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg-1).
2. Phương pháp đĩa Wilhelmy:
2.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:
Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề
mặt tiếp xúc của không khí -nước đã được phát triển rộng và được nhóm nghiên cứu của
Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ
bản gồm một lớp Teflon (lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch. Một
bản mỏng Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để
đo áp suất bề mặt mà nó trực tiếp liên quan đến sức căng bề mặt.

Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân bố tại bề mặt của pha nước, sử dung

dung môi dễ bay hơi như chloroform để hoà tan chất béo. Dung dịch chất béo được áp dụng ở
dạng những giọt nhỏ mà chúng có khả năng bay hơi được. Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo
có thể là hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon quét trên bề mặt của pha nước. Áp suất
bề mặt có thể được duy trì bề mặt có thể được duy trì không đổi tự động bằng cách sử dụng sự
thuyên chuyển của Teflon mà được kiểm soát và điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của
electromicrobalance.
16


Dung dịch chứa enzyme Lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ
giảm vì sự hoà tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo. Khi lớp màng chắn này
di chuyển có tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học của phản ứng có thể được theo
dõi bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp màng chắn này theo thời gian.
Với kỹ thuật này, ta có thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề
mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và vùng phân tử của cơ chất. Phương
pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà
được phân bố tại bề nặt tiếp xúc không khí-nước.
Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những
phép đo động học đáng tin cậy.
2.2. Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:
Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất béo đã được thực
hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất. Thực tế, tất cả các mặt phân cách
của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và Protein. Kỹ thuật đơn lớp lý
tưởng thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt
phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất
béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo
không tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ
tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan.
Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc
nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành

phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A.
Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “ để ngăn truyền
thông bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment). Áp
suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi
mà hỗn hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản
Pt tới màng chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của
màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn
di động. Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với
nhau và enzyme được tiêm vào trong bộ phận phản ứng.
2.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:
Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối
ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá trị chính xác của điểm tối ưu
biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất được sử dụng.
Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là:

17


• Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều
hoà mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc. Sử dụng những enzyme đã được đánh
dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự
tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính
hoạt động bề mặt của enzyme.
Sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và
tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là
1 cm-1, phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng
10-5 cm-1, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết quả là ở
trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzyme xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong
khi ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzyme trong hàng trăm các enzyme có thể xuất hiện tại bề mặt
giao tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ không xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ

thuỷ phân được hấp phụ trên lớp đơn.
Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng
enzyme đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp.
Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và
những enzyme được hấp phụ sau đó được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Sau khi so
sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang ( subphase ), số lượng của những enzyme được hấp
phụ sẽ được tính toán từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzyme đặc hiệu.
Trong bảng phân tích những enzyme hoạt động phóng xạ, màng film được hút ra bằng cách
lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của
một phần thành Teflon. Khi những phân tử enzyme được đánh dấu phóng xạ tan trong pha
mang sẽ bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra
dựa trên sự hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự khác
biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp
xúc, được quy cho phân tử enzyme có liên kết với màng film. Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật
lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm -2.min-1 và sự vượt mức của
enzym ở bề mặt bằng đơn vị mg.cm -2. Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của
enzyme thường được đo bằng đơn vị là mol.min-1.mg-1( IU.mg-1).


Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta có thể đo
được hoạt tính của enzyme Lipase trong đường ruột của người ( HGL-Human gastric
lipase). Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng có thể xác định
được sự vượt mức của enzyme bề mặt tương ứng. Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia
tăng một cách ổn định với màng bao lipit. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên
lớp dicaprin tại 35mN.m-1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới
điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều
lượng là 1000IU cho 1mg enzym). Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang
nước, sự liên kết bề mặt của các HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của
18

lòng đỏ trứng đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng
dicaprin.
2.4. Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy):
Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A 2,
Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong môi
trường chất lỏng. Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzym của màng
acylglycerols/phospholipids kép bằng enzyme Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã
được nghiên cứu bằng phương pháp AFM.
Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL và vì sản phẩm hoà tan trong dung dịch
đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM. Chúng ta sẽ có
được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân
tích chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn. Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất
hiện của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10 -9 một cách gia tăng dần. Thêm vào đó, sự gia tăng
diện tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và
hoạt tính đặc hiệu của enzyme sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động
trong 1 lỗ.
Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzyme tại bề mặt tiếp xúc giữa
2 pha béo-nước. Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình
phân giải lipit.
2.5. Quang phổ học hồng ngoại:
Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do Lipase xúc tác micell đảo ngược
sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared
spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi [80]. Sự phân hủy chất béo có thể được theo
dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng. Số lượng những ester axit béo
và FFAs ( mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm -1 và tại 1715 cm-1 ) có thể dựa trên cơ sở của
những hệ số tắt và định luật của Beer. Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất
béo của những cơ chất khác nhau ( như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật ).
3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân:
3.1. Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp:

3.1.1. Những chất chỉ thị màu:
a) Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester
carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu
của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân
gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar.Ở đây tồn tại
một mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm ( vị trí ) khuyếch tán axit béo và
logarit của vùng phân bố enzym. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh
chóng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar. Tuy nhiên một vài
19


sai sót có thể là kết quả từ quá trình axit hóa của môi trường, vì sự phát sinh của những
chất chuyển hóa axit khác với FFAs mà được giải phóng bởi những vi khuẩn lipase.
b) Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này
cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần
nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát
những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất
ester.
Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng
mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị
thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase.
3.1.2. Phép chuẩn độ:
Phương pháp pH-stat. Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mô tả đặc điểm và sự đặc biệt của Lipase
cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha.
Với phương pháp pH-stat, hoạt động của Lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ
tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFA s được giải phóng
theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối
không đổi. Thiết bị
pH-stat có sẵn đã được sản xuất thương mại như bức xạ kế
(Copenhagen,Denmark ) hoặc Metrohm Ltd (Herisau, Switzerland ).

Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể
thực vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo arabic như cơ chất.
Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, plasma
và dịch tá tràng.
Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong
giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút. Khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn
độ thì phương pháp này không đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ
hơn 0.1 mol/phút.
Nhược điểm:
Ngoài tính nhạy thấp của nó, nhược điểm của phương pháp pH-stat là vùng phân bố hẹp của
những giá trị pH mà có thể được nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton
được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme
Lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng. Bởi vậy, những
giá trị pH của điểm cuối của môi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn, thích hợp
hơn giá trị pKa hiển thị của axit béo được giải phóng. Hơn nữa, nên chú ý rằng: khả năng ion
hóa cũng như sự có mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá
trị pKa hiển thị. Sự có mặt của những ion Ca 2+ có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả ion hoá của
những axit béo mạch dài. Hiện tượng kết tủa vi mô này điều khiển cân bằng hóa học bằng định
luật hoạt động khối lượng.
20


V.
Ứng dụng
1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp
Công nghiệp

Hoạt tính

Sản phẩm/ứng dụng

Thủy phân chất béo

Loại các vết bẩn dầu từ vải
Tăng cường các chất mùi thơm
trong sữa, phomat và bơ.

Thực phẩm sữa

Thủy phân chất béo của sữa,
làm chín phomat, biến đổi chất
béo của bơ.

Các loại bánh

Cải thiện mùi thơm

Kéo dài thời gian sử dụng

Nước giải khát

Cải tiến mùi hương

Các loại nước giải khát

Bao bì thực
phẩm
Thực phẩm
chức năng

Cải tiến chất lượng

Mayonnaise, các loại bao bì và
các loại chỉ khâu

Chuyển đổi sự ester hóa

Thực phẩm chức năng

Tăng cường hương vị

Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ
chất béo

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy
phân

Bơ cocoa, margarine, các acid
béo, glycerol, các glyceride đơn,
đôi

Chọn lọc đối kháng, tổng hợp

Các khối kết tinh, hóa chất

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy
phân

Các lipid đặc trưng, các chất trợ
tiêu hóa

Tổng hợp

Chất nhũ tương hóa, chất tạo ẩm

Da

Thủy phân

Các sản phẩm da

Giấy

Thủy phân

Cải thiện chất lượng giấy

Chất làm trắng

Thủy phân

Loại bỏ chất béo

Chất tẩy

Thịt và cá
Các chất béo và
dầu
Hóa chất
Dược phẩm

Mỹ phẩm

21


2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa
Ứng dụng thương mại quan trọng của lipase là làm phụ gia trong công nghiệp
chất tẩy rửa và bột giặt gia đình. Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy hiện đại đều
chứa một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulose và lipase.
Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong công nghiệp chất tẩy
rửa. Trong điều kiên bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt. Lipase
bổ sung vào chất tẩy rửa phải có đặc tính: chịu nhiệt, chịu kiềm (pH khoảng 7.5 đến 11)
và chịu các tác động của các chất cấu tạo nên chất tẩy rửa (Jäeger và cs, 1994). Lipase
kiềm chịu nhiêt đã được dùng trong công nghiệp tẩy rửa để loại bỏ các vết triglyceride
từ người và các loại thức ăn, trước kia, việc loại bỏ các chất này trong điều kiện giặt ủi
bình thường rất khó khăn.
Năm 1988, Lipase được cho vào chất tẩy rửa dưới tên thương mại là lipolase
100T thu từ Humicola lanuginose được sản xuất bởi Novo Nordisk Bioindustry (Jäeger
và cs, 1994).
Lipase từ các chủng vi khuẩn P.medocina và Pseudomonas alcaligenes đã đươc
sản xuất và bổ sung vào chất tầy rửa ở công ty Genecor international USA (Jäeger và
cs, 1994; Reetz và Jäeger, 1998).

3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy
Quá trình thuộc da là quá trình khá phức tạp gồm loại bỏ chất béo, rủ lông và
làm mềm. Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng các vi
khuẩn kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao. Dòng bacillus sp. có thể phát triển trong môi
trường kiềm sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc
da (Haalck và cs, 1992; Wang và cs, 1995).
Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch. Lipase cũng

cải thiện tính không thấm nước của da và da không bị vết hoan ố như sử dụng dung
môi và chất hoạt động bề mặt.
Trong công nghiệp giấy, sáp và triglyceride gây trở ngại cho sản xuất nên loại bỏ
các chất này là điều cần thiết (Bajpai 1999). Công ty giấy công nghiệp Nippon (Nhật
Bản) đã dùng lipase từ nấm Canada rugosa để loại 90% các chất này có trong gỗ.
Một số sản phẩm lipase được thương mại hóa dùng cho công nghệ thuộc da:
Greasex®, NovoCor® ADL, dệt: Novozyme® 375, giấy: Resinase®.
22