Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng Sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử (Luận án tiến sĩ)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦNTHƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM THỊ NGỌC NGA

NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN
CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN
BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM THỊ NGỌC NGA

NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN
CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN
BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN TRUNG KIÊN
2017


LỜI CẢM TẠ
Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến
- Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ.
- Ban giám đốc và các Thầy, Cô Viện Nghiên cứu & Phát triển Công
nghệ sinh học.
- Ban giám đốc trung tâm Thalasemia (TRC), Trường Đại học Mahidol,
Thái Lan.
- TS.BS. Hoàng Anh Vũ, Trưởng trung tâm Y - Sinh học phân tử,
Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
- Ban giám đốc và quý đồng nghiệp trung tâm chẩn đoán Y Khoa Medic,
thành phố Hồ Chí Minh.
Đã dạy dỗ, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Đốc các bệnh viện: đa khoa Nguyễn
Đình Chiểu, Bến Tre; đa khoa Kiên Giang; Nhi Đồng thành phố Cần Thơ; đa
khoa trung tâm An Giang, Huyết học và Truyền máu Cần Thơ, đa khoa Châu
Đốc và bệnh viện Nhi Đồng 1, thành phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập số liệu.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn đã tận
tình, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này.
Cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ và động
viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học.
Xin trân trọng cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 17 tháng 4 năm 2017
Học viên

i


TÓM LƯỢC
Tên đề tài: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân
Beta thalassemia ng
ng b ng sông Cửu Long b ng kỹ thuật sinh học
phân tử
Βeta thalassemia (β-Thal) là bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên
thế giới. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh à mang gen
bệnh β-Thal cao. Tại khu ực
ng b ng sông Cửu Long hiện nay có hơn
2.000 trẻ β-Thal mắc bệnh. Vì ậy, nghiên cứu thực hiện nh m mục tiêu: xác
định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin à xây dựng phả hệ theo dõi sự di
truyền bệnh β-Thal trên bệnh nhân β-Thal ở khu ực
ng b ng sông Cửu
Long. Nghiên cứu cũng xác định tỷ lệ mang gen bệnh à kiểu hình huyết học
của các thể bệnh trong phả hệ à tư ấn di truyền cho người mang gen bệnh
kết hợp chẩn đoán trước sinh cho các cặp ợ ch ng mang gen à đang mang
thai giai đoạn đầu. Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt
ngang trên 341 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal, có hộ khẩu tại 13 tỉnh, thành phố
thuộc khu ực
ng b ng sông Cửu Long. 12 trong số 341 bệnh nhân được
chọn ngẫu nhiên để xây dựng phả hệ nh m nghiên cứu sự di truyền bệnh βThal. Kết quả có 17 kiểu đột biến được xác định, 97,2% các đột biến thuộc 8
kiểu phổ biến của Việt Nam: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T,
Cd41/42 –TTCT, Cd71/72 +A, Cd95 +A và IVS2.654 C>T; 2,2% kiểu B
thuộc dạng không phổ biến: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5
G>C, ()del,-pro) del. Ngoài ra, có 3 kiểu đột biến mới được phát hiện:
Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C. Bên cạnh đó, có

tổng 12 phả hệ đã được xây dựng: 7 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer, 1 dân
tộc Chăm à 1 dân tộc Hoa. 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn
trên nhiễm sắc thể thường. Có 91/251 (36,3%) người mang gen bệnh à 7 thể
bệnh được xác định trong phả hệ. Các thể bệnh: β-Thal đ ng hợp tử, phối hợp
HbE/β-Thal, β-Thal dị hợp tử kép đều có kiểu hình thiếu máu nặng à cần
truyền máu phụ thuộc; các thể bệnh còn lại chỉ biểu hiện thiếu máu nhẹ,
không cần truyền máu. Tư ấn di truyền: 100% các nội dung kiến thức ề
bệnh β-Thal, kiến thức chăm sóc bệnh nhân, phòng bệnh β-Thal đều đã được
tăng lên có ý nghĩa thống kê (p<0,001) sau tư ấn. Như ậy, có nhiều kiểu đột
biến gây bệnh β-Thal tìm gặp ở khu ực
ng b ng sông Cửu Long à cũng
theo nghiên cứu thì khai thác tiền sử gia đình kết hợp ới tư ấn và sàng lọc
người mang gen đ ng thời sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp
chẩn đoán trước sinh sẽ là biện pháp phòng bệnh hiệu quả.
Từ khóa: β-Thal, bệnh nhi,
ng b ng sông Cửu Long, kỹ thuật sinh
học phân tử, tư ấn di truyền.
ii


ABSTRACT
Title: Study on inheritance of pathogenous mutations in Beta
thalassemia patients living in the Mekong Delta using molecular biology
technique.
Βeta thalassemia is the most commonly inherited genetic disorders in
the world. Vietnam is one of the countries with high incidence of β-Thal
disease. The Mekong Delta had more than 2,000 β-Thal children. Therefore,
the subject of the project: to determine the ratio of mutant genotypes and to
construct pedigree charts that study the β-Thal inheritance in β-Thal patients
who live in the Mekong Delta. Determining the ratio of gene carrier and the

hematological phenotypes of the diseases in the pedigree. Genetic counseling
for gene carriers and prenatal diagnosis for couples of gene carriers. The
study was conducted using a cross-sectional descriptive study was performed
on 341 patients, residents in 13 provinces and cities in the area of Mekong
Delta. 12 patients will be purposively selected for genealogy to study the
inheritance of β-Thal. The study results: 17 types of mutants were identified.
97.2% of the mutations belong to 8 common types of Vietnam: -28 A>G, Cd17
A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 -TTCT, Cd71/72 + A Cd95 +A and
IVS2.654 C>T; 2.2% uncommon mutations: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26
G>T, IVS1.5 G>C, ()del,-pro) del. There were three new mutant types
discovered accounting for 0.6%: Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499
C>T; IVS2.636 A>C. In addition, there were 12 pedigree charts: 7
Vietnamese, 3 Khmer, 1 Cham and 1 Chinese. All pedigrees were inherited in
an autosomal recessive pattern. There were 36,3% gene carriers and seven
diseases identified in the pedigrees: β-Thal homozygotes, compound
heterozygotes of HbE/β-Thal and compound heterozygotes β-Thal had a major
anemia and require dependent blood transfusion. The rest of the disease only
showed minor anemia, no blood transfusion. After genetic counseling: 100%
of knowledge about β-Thal disease, knowledge of patient health care and
pre ention of β-Thal disease have been increased significantly (p<0.001).
According to this study, genetic counseling combined with family history,
screening of gene carriers and using of various molecular biology techniques
for prenatal diagnosis is an effecti e way to rapidly reduce the β-Thal major,
disease prevention and improvement of population quality.
Keywords: β-Thal, molecular biology technique, genetic counseling,
pediatric patient, the Mekong Delta,

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy
hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa
được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây.
Người hướng dẫn

Tác giả luận án

PGS.TS. Nguyễn Trung Kiên

Phạm Thị Ngọc Nga

iv


MỤC LỤC
Trang
CẢM TẠ ............................................................................................................. i
TÓM LƯỢC ...................................................................................................... ii
ABSTRACT ...................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. iv
MỤC LỤC .......................................................................................................... v
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xii
TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. xv
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1. ặt ấn đề .................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài.............................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 2

1.4. Tính mới của luận án ................................................................................... 2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 4
2.1. Bệnh Beta thalassemia ................................................................................. 4
2.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia ................................. 4
2.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia ..................................................... 5
2.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen betaglobin ................................................................................................................... 5
2.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia ................................................ 7
2.1.5. Các thể bệnh Beta thalassemia ....................................................... 11
2.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia.................................................. 14
2.1.7. Điều trị Beta thalassemia ............................................................... 16
2.1.8. Phòng bệnh Beta thalassemia ......................................................... 17
2.2. Phương pháp lập à phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia ................. 18
2.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ................................ 18
2.2.2. Phương pháp lập phả hệ ................................................................. 19
2.2.3. Phân tích phả hệ.............................................................................. 19
v


2.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ ...................................................... 20
2.3. Tư ấn di truyền à các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh
Beta thalassemia ....................................................................................... 21
2.3.1. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia ........................ 21
2.3.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia ... 22
2.4. Tổng quan các nghiên cứu ề đột biến gây bệnh Beta thalassemia tại Việt
Nam .................................................................................................................. 28
CHƯƠNG III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 32
3.1. ối tượng nghiên cứu ............................................................................... 32
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến
gen ............................................................................................................. 32
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ ............... 32

3.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người
mang gen bệnh .......................................................................................... 32
3.2. Thời gian à địa điểm nghiên cứu ............................................................. 33
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 33
3.3.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 33
3.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu .............................................. 33
3.3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 35
3.3.4. Phương pháp thu thập số liệu ......................................................... 40
3.3.5. Phương pháp hạn chế sai số ........................................................... 52
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 52
3.4. Hạn chế của đề tài ..................................................................................... 53
3.5. ạo đức trong nghiên cứu ......................................................................... 53
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ .............................................................................. 55
4.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu ......................................................... 55
4.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến ............. 55
4.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ ..................................... 56
4.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn ...................................................... 57
4.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin gây bệnh Beta thalassemia ....... 58
4.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen β-globin ..... 58

vi


4.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta
thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................. 61
4.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ....................... 70
4.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền ............................................................. 70
4.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu .............................. 81
4.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ ......................................... 84
4.3.4. Tỷ lệ các thể bệnh trong phả hệ nghiên cứu .................................. 84

4.3.5. Kiểu hình huyết học của các thể bệnh Beta thalassemia trong các
phả hệ ................................................................................................................ 85
4.4. Tư ấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong
các phả hệ nghiên cứu ...................................................................................... 87
4.4.1. Kiến thức đúng về bệnh Beta thalassemia ..................................... 87
4.4.2. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia ............ 88
4.4.3. Kiến thức đúng về phòng bệnh Beta thalassemia .......................... 89
4.4.4. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta
thalassemia ....................................................................................................... 89
CHƯƠNG V. THẢO LUẬN .......................................................................... 91
5.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu ......................................................... 91
5.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến ............. 91
5.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ ..................................... 92
5.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn ...................................................... 92
5.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh Beta thalassemia ............. 93
5.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng để xác định đột biến gen beta
globin ........................................................................................................ 93
5.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta
thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................. 97
5.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ..................... 110
5.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền ........................................................... 110
5.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu ........................... 115
5.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ nghiên cứu ................... 117
5.3.4. Các thể bệnh Beta thalassemia và kiểu hình huyết học ............. 117

vii


5.3.5. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sàng lọc các thể bệnh trong gia
đình bệnh nhân và cộng đồng ......................................................................... 123

5.4. Tư ấn di truyền cho người mang gen đột biến trong các phả hệ .......... 126
5.4.1. Kiến thức về bệnh Beta thalassemia ............................................ 126
5.4.2. Kiến thức về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia ................... 129
5.4.3. Kiến thức về phòng bệnh Beta thalassemia ................................ 130
5.4.5. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta
thalassemia ..................................................................................................... 131
CHƯƠNG VI. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................ 135
6.1. Kết luận .................................................................................................... 135
6.1.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh Beta thalassemia
ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................................... 135
6.1.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ........... 135
6.1.3. Tư vấn di truyền cho người mang gen trong 12 phả hệ ............. 136
6.2. ề xuất ..................................................................................................... 136
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 137
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu.
Phụ lục 2: phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia
Phụ lục 3: phiếu thông tin
Phụ lục 4: bộ câu hỏi đánh giá kiến thức tư vấn di truyền
Phụ lục 5: kết quả MLPA trên gen α/β-globin của bệnh nhân Nguyễn
Thị Thu H và Nguyễn Thị Mộng N
Phụ lục 6: danh sách bệnh nhân tham gia xác định kiểu đột biến
Phụ lục 7: danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ

viii


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1

Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức

7

Bảng 2.2

Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới

9

Bảng 2.3

Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ

10

Bảng 2.4

Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo

11

chủng tộc
Bảng 2.5

Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng

12

của các thể bệnh -Thal
Bảng 2.6

Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng

13

của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE
Bảng 2.7

Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán β-

15

Thal
Bảng 2.8

Tỷ lệ 8 loại đột biến phổ biến trong nghiên cứu ở người Việt

30

Nam
Bảng 3.1

Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu

35

Bảng 3.2

Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen -globin

45

Bảng 3.3

Chỉ số DQ đọc kết quả MLPA

47

Bảng 3.4

Trình tự các primer trong phản ứng GAP-PCR

48

Bảng 3.5

Kích thước các loại đột biến

48

Bảng 4.1

Đặc điểm tuổi của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến

55

Bảng 4.2

Phân bố giới tính theo các dân tộc của đối tượng tham gia

55

xác định kiểu đột biến
Bảng 4.3

Đặc điểm nơi cư trú của đối tượng tham gia xác định kiểu đột

56

biến
Bảng 4.4

Phân bố độ tuổi, giới tính theo các dân tộc của đối tượng xây
dựng phả hệ

57

Bảng 4.5

Đặc điểm chung về tuổi, nghề nghiệp, trình độ, quan hệ với
bệnh nhân của đối tượng tư vấn

57

Bảng 4.6

Các kiểu đột biến phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự và loại

60

ix


β-Thal
Bảng 4.7

Số lượng bệnh nhân mang 2 đột biến và 1 đột biến theo dân
tộc

62

Bảng 4.8

Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông
Cửu Long

62

Bảng 4.9

Thể bệnh, kiểu phối hợp đột biến và dân tộc của 3 bệnh nhân
mang đột biến mới

63

Bảng 4.10

Chỉ số huyết học và hemoglobin của các đột biến mới

63

Bảng 4.11 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Kinh

64

Bảng 4.12 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Khmer

65

Bảng 4.13 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Hoa

65

Bảng 4.14 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Chăm

66

Bảng 4.15 Tỷ lệ các kiểu gen trên 341 bệnh nhân

66

Bảng 4.16 Tỷ lệ các thể bệnh trên 341 bệnh nhân

67

Bảng 4.17 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh
nhân β-Thal đồng hợp tử

67

Bảng 4.18 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh

68

nhân β-Thal dị hợp tử kép
Bảng 4.19 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh

69

nhân dạng phối hợp HbE/β-Thal
Bảng 4.20 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh

70

nhân β-Thal dị hợp tử
Bảng 4.21 Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ

83

Bảng 4.22 Tỷ lệ mang gen bệnh theo dân tộc trong 12 phả hệ

83

Bảng 4.23 Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ

84

Bảng 4.24 Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ

84

Bảng 4.25 Đặc điểm huyết học của các thể bệnh β-Thal trong phả hệ

85

Bảng 4.26 Đặc điểm thành phần Hb của các thể bệnh β-Thal trong phả

86

hệ
Bảng 4.27 Kiến thức đúng về bệnh β-Thal

x

87


Bảng 4.28 Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal

88

Bảng 4.29 Kiến thức đúng về phòng bệnh β-Thal

89

Bảng 4.30 Kết quả chẩn đoán trước sinh của các cặp vợ chồng mang
gen bệnh

90

Bảng 5.1

Ưu khuyết điểm của kỹ thuật RDB, SEQ, MLPA

97

Bảng 5.2

Tỷ lệ 8 kiểu đột biến của nghiên cứu so sánh với nghiên cứu
khác

Bảng 5.3

Phân bố các kiểu đột biến của nghiên cứu so với một số nước
tại khu vực Đông Nam Á

xi

98
99


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1

Cấu trúc gen -Thal

5

Hình 2.2

Di truyền bệnh -Thal

5

Hình 2.3

Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal

6

Hình 2.4

Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á

8

Hình 2.5

Bệnh nhân -Thal thể nặng

12

Hình 2.6

Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội NST thường

19

Hình 2.7

Chọc dò dịch ối qua màng bụng

24

Hình 2.8

Sinh thiết gai rau qua âm đạo

25

Hình 2.9

Nguyên lý của kỹ thuật ARMS-PCR

26

Hình 2.10

Đọc kết quả của phương pháp ARMS-PCR

26

Hình 2.11

Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên phần mềm

27

Hình 2.12

Các bước chính trong kỹ thuật MLPA

28

Hình 3.1

Biểu đồ kết quả điện di Hemoglobin

40

Hình 3.2

Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Kit
QIAGEN

42

Hình 3.3

Các bước chính trong kỹ thuật RDB

42

Hình 3.4.

Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh -Thal tương ứng

43

Hình 3.5

Đọc kết quả kỹ thuật RDB

44

Hình 3.6

Đọc kết quả giải trình tự

45

Hình 3.7.

Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật MLPA

46

Hình 3.8

Kết quả của kỹ thuật MLPA

47

Hình 3.9

Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến α-Thal trên

gel

48

Hình 4.1

Kết quả một số mẫu bệnh nhân phát hiện đột biến bằng

59

RDB
Hình 4.2

Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA được phát hiện
bằng SEQ

xii

60


Hình 4.3

Đột biến (δ)del được phát hiện bằng MLPA

61

Hình 5.1

Test sức bền thẩm thấu hồng cầu

125

Hình 5.2

Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu HbE (bên phải) và mẫu 126
bình thường

Sơ đồ 2.1

Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi α ở bệnh nhân β-Thal

6

Sơ đồ 3.1

Các bước chính trong nghiên cứu

51

Sơ đồ 4.1

Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đã thực

58

hiện
Sơ đồ 4.2

Phả hệ gia đình Kinh 01

71

Sơ đồ 4.3

Phả hệ gia đình Kinh 02

72

Sơ đồ 4.4

Phả hệ gia đình Kinh 03

72

Sơ đồ 4.5

Phả hệ gia đình Kinh 04

73

Sơ đồ 4.6

Phả hệ gia đình Kinh 05

74

Sơ đồ 4.7

Phả hệ gia đình Kinh 06

75

Sơ đồ 4.8

Phả hệ gia đình Kinh 07

76

Sơ đồ 4.9

Phả hệ gia đình Khmer 01

77

Sơ đồ 4.10

Phả hệ gia đình Khmer 02

78

Sơ đồ 4.11

Phả hệ gia đình Khmer 03

79

Sơ đồ 4.12

Phả hệ gia đình Hoa

79

Sơ đồ 4.13

Phả hệ gia đình Chăm

80

Sơ đồ 4.14

Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và các đột

82

biến trong 12 phả hệ nghiên cứu
Sơ đồ 5.1

Sơ đồ phòng bệnh β-Thal cho gia đình bệnh nhân và 124
cộng đồng

Biểu đồ 4.1

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 01

71

Biểu đồ 4.2

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 02

71

Biểu đồ 4.3

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 03

72

Biểu đồ 4.4

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 04

73

Biểu đồ 4.5

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 05

74

xiii


Biểu đồ 4.6

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 06

75

Biểu đồ 4.7

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 07

76

Biểu đồ 4.8

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 01

77

Biểu đồ 4.9

Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 02

77

Biểu đồ 4.10 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 03

78

Biểu đồ 4.11 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Hoa

79

Biểu đồ 4.12 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Chăm

80

Biểu đồ 4.13 Kiến thức đúng về các đặc điểm lâm sàng trước và sau tư

88

vấn

xiv


TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh
ARMS
Amplification refractory
mutation system
Allele-specific
ASO
oligonucleotide
β-Thal
Beta Thalassemia

Tiếng việt
Hệ thống nhân bản đột biến
chịu nhiệt
Oligonucleotide đặc trưng alen

Cd
DCIP

Bộ ba giải mã
Test tủa HbE

DGGE
ddNTP
DQ
ĐB
ĐBSCL
Hb
HMO
HLA
MCH
MCV
MLPA

Codon
2,6‐dichlorophenolindophe
nol
Denaturing gradient gel
electrophoresis
Dideoxynucleotide

Điện di DNA biến tính trên gel
gradient
Liều lượng
Đột biến
Đồng bằng sông Cửu Long

Dosage quotient

Hemoglobin
Health maintenance

organization
Human leukocyte antigen
Mean Corpuscular
Hemoglobin
Mean Corpuscular Volume

Tổ chức bảo vệ sức khỏe
Kháng nguyên bạch cầu người
Số lượng hemoglobin trung
bình trong một hồng cầu
Thể tích trung bình một hồng
cầu
Khuếch đại đa đoạn dò

Multiplex Ligationdependent Probe
Amplification

Nhiễm sắc thể

NST
OF

Osmotic fragility

PCR

Polymerase chain reaction

Test đo sức bền thẩm thấu hồng
cầu

Phản ứng khuếch đại chuỗi

Red blood cell
Reverse Dot Blot
Sequencing

Đoạn dò
Hồng cầu
Lai dò ngược
Giải trình tự

Probe
RBC
RDB
SEQ

xv


TRC

Thalassemia reseach center

Trung tâm Thalassemia

TIF

Thalassaemia International
Federation

Liên đoàn Thalassemia thế giới

TVDT
WHO
WT

World Health Organization
Wild type alleles

Tư vấn di truyền
Tổ chức Y tế thế giới
Alen hoang dã ( Alen không
mang ĐB)

xvi


Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu
Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. 71%
quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen
bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung Cận Đông, châu Á đến
Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực thấp và tạo ra một
gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này (Harper, P., 2010; Higgs, D.R.

et al, 2011). Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe
nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là
một trong những ưu tiên về di truyền người (Laosombat, V., 2001; Dương Bá
Trực và ctv, 2002; Eleftheriou, A., 2003).
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh
cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh βThal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc. Theo hiệp hội Tan huyết
Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm
có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu
bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có
khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán.
Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển
cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu
là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm
thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép
tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp. Đây là
lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì
vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan
tràn của bệnh di truyền này (Cai, S. and Chehab, F.F, 1996; Gallanello, R.,
2005).
Liên đoàn thalassemia thế giới (TIF) đã đưa ra chương trình quản lý bệnh
bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu
dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị cũng như quản lý
lâu dài lại đòi hỏi rất nhiều nguồn lực. Một số ít quốc gia có tần suất bệnh
thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

1

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH

Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc nghiên cứu về
tầm soát bệnh và chẩn đoán trước sinh (Cao, A. et al, 1996; Shu-Rern Chern
and Chih-Ping Chen, 2000; Moghaddam, Z.K. et al, 2012).
Với tỷ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam cũng rất cần một chương
trình quản lý và phòng chống thalassemia. Do vậy, nghiên cứu ứng d ng các
k thuật sinh học phân tử để tìm hiểu r các đột biến gây bệnh; sự di truyền
bệnh trong các gia đình là hết sức cần thiết. Ngoài ra, tư vấn cho người mang
gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao ý thức về căn bệnh. Người mang gen có
thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong
trường hợp cần thiết. Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh, làm
giảm tỷ lệ mắc bệnh β-Thal ở trẻ em. Đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các
đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia ng Đồng bằng sông
Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện nhằm có thêm
thông tin về bệnh β-Thal trong khu vực.
1.2. Mục tiêu đề tài
(1 ác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể
bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các k
thuật sinh học phân tử.
(2) ây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và
xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu
hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-thal trong phả hệ.
(3 Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người
mang gen bệnh được phát hiện trong các phả hệ nghiên cứu.
1.3. Ý nghĩa của luận án

* Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo:
- Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh βThal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân (bệnh
nhân ) khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Ý nghĩa về mặt xã hội:
- Nâng cao hiểu biết của người mang gen về bệnh -Thal từ đó góp phần
làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho
người bị bệnh thalassemia.
- Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng,
giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

2

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH


Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

1.4. Tính mới của luận án
- Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm,
Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
- Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới:
+ Phối hợp nhiều k thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định nhiều
nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu quả, nhanh
chóng.
+ Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu

đột biến , sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán
trước sinh cho người mang gen.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

3

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH


Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Bệnh Beta thalassemia
Bệnh β-Thal là một loại bệnh Hb xảy ra do các đột biến gen làm giảm
hoặc không tổng hợp được chuỗi β-globin của phân tử Hb. Kết quả tạo nên
các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận
chuyển khí cho cơ thể. Nếu ĐB gen làm chuỗi -globin giảm hay không được
tạo thành gọi là bệnh -Thal. Cũng có trường hợp cả hai chuỗi β và α bị thiếu
h t hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp α/β thalassemia.
Bệnh hemoglobin E (HbE do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của
chuỗi -globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1 : GAG bị thay bằng AAG,
làm cho acid amin vị trí thứ 26 là Glutamic acid bị thay bằng Lysine, dẫn đến
giảm số lượng chuỗi -globin. Như vậy, HbE cũng là -Thal thể nhẹ.
2.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia
C m gen β-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11
(11p15.5 , với đoạn DNA dài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là

U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A –
delta – beta – 3’.
Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide 52032725204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của c m gen
β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106
và 62144.
Gen β-globin có 3 exon và 2 intron mã hoá cho chuỗi -globin dài 146
acid amin. Exon 1 ở nucleotide 1-142 và mã hoá các acid amin 1-30, acid
amin thứ nhất bắt đầu từ vị trí nucleotide 50. Exon 2 ở nucleotide 273-495 và
mã hoá các acid amin 31-104. Exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606 và mã
hoá các acid amin 105-146. Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và
chức năng của chuỗi -globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là
các acid amin ưa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin
kỵ nước. Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi. Các acid
amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin kỵ nước và tạo ra các thay đổi hoá
học dẫn đến giảm đàn hồi, gây mất ổn định của phân tử protein, tạo ra các
chuỗi β-globin bị lỗi (Wochenschr, S.M., 1983; Quách Thị Hoàng Oanh, 2009;
Fettah, A. et al, 2013).

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

4

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH


Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

Hình 2.1. Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009)

2.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật di
truyền Mendel. Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con
sinh ra là thalassemia dị hợp tử và không có trẻ đồng hợp tử bị bệnh. Nếu cả
cha và mẹ đều bị thalassemia dị hợp tử thì 25% khả năng sinh con bình
thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử
(Nguyễn Công Khanh, 1985; Wochenschr, S.M., 1983; Thein S, 2005).

Hình 2.2. Di truyền bệnh -Thal
2.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen
beta-globin
Khi các ĐB xuất hiện trên gen β-globin tùy theo vị trí mà ĐB này sẽ làm
thay đổi cấu trúc và số lượng của phân tử Hb và tạo ra các hồng cầu với nhiều
biến đổi khác nhau. Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp
loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các
hồng cầu non trong tủy.
Đột biến gây thiếu h t chuỗi  dẫn đến dư thừa chuỗi . Các chuỗi  dư
thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng
cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu
mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng
lọc” ở lách (Maria-Domenica Cappellini et al, 2008; Srisupundit K, 2013).

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

5

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH


Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Bình thường

Trường ĐHCT

α-Thal

β-Thal

Hình 2.3. Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal
(Gelehrter, T.D. et al, 2000)
Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tiếp xúc, dễ
bị các tác nhân oxy hóa phá hủy. Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên
kali ở bên trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương. Những tác hại trên của các
hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu.

Sơ đồ 2.1. Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân β-Thal
(Olivieri,N.F., 1999)
Còn ở tủy xương, các hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất và màng của hồng
cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh
mạnh các hồng cầu trong tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thu sắt
dẫn đến nhiễm sắt cho cơ thể. Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

6

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH

Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013

Trường ĐHCT

đến được giai đoạn trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu
không hiệu quả. Như vậy, dư thừa chuỗi dẫn đến tuỷ xương sinh hồng cầu
không hiệu quả, đây là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và
huyết học ở những bệnh nhân -Thal thể nặng (Sơ đồ 2.1 .
Ở thể dị hợp tử, các biến đổi về hồng cầu cũng tương tự như đồng hợp
tử, nhưng mức độ không trầm trọng, vì thế chỉ có hiện tượng thiếu máu nhẹ.
Cũng tương tự, ở các bệnh nhân thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi  và
chuỗi  không nặng nề nên bệnh nhân hầu như không có biểu hiện lâm sàng
thiếu máu (Run, D. et al, 1992).
2.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia
Bệnh β-Thal phân bố rộng rãi từ Địa Trung Hải, Trung Đông, Ấn Độ
qua Pakistan cho đến Đông Nam Á (Hình 2.4) (De Siva, S. et al, 2000 . Bệnh
cũng có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên ô cũ và Trung Quốc. Ở châu
Âu, châu Phi bệnh tương đối ít gặp, gần đây do sự di dân, gen bệnh phát tán đi
khắp nơi và thalassemia trở thành vấn nạn toàn cầu.
Đức, một quốc gia không nằm trong vành đai phân bố của bệnh β-Thal
là một minh chứng. Theo nghiên cứu của Elisabeth Kohne và Enno Kleihauer
(2010) β-Thal chiếm 23,2% trên tổng số bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tại
Đức. Trong tổng số 23.330 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal ở quốc gia này, số
người có nguồn gốc bản địa là 3.693 chiếm chỉ 15,8%. 84,2% bệnh nhân còn
lại được di cư từ các quốc gia Địa Trung Hải nằm ở phía nam châu Âu và Thổ
Nhĩ Kì.
Bảng 2.1. Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức
Thể bệnh - thal
- thal
- thal thể ẩn

- thal thể nặng
- thal thể trung gian
- thal dạng phối hợp

Số người (%)
23.330 (100)
21.555 (92,4)
861 (3,7)
96 (0,4)
818 (3,5)

Dân nhập cư (%)
19.637 (84,2)
18.101 (84)
858 (99,7)
94 (97,9)
584 (73,4)

Dân bản xứ (%)
3.693 (15,8)
3.454 (16)
3 (0,3)
2 (2,1)
234 (26,6)

Ngày nay, gần 200 kiểu ĐB khác nhau trên gen β-globin đã được mô tả.
Có rất nhiều dạng như: ĐB điểm (point mutations , ĐB khung (frameshift
mutation , ĐB vô nghĩa (nonsense mutations ,… xuất hiện trên tất cả các vùng
của gen β-globin bao gồm cả intron, vùng promotor. Các ĐB xuất hiện tùy
theo kiểu và vị trí mà sẽ ảnh hưởng nhiều hay ít đối với việc tổng hợp chuỗi β

gây ra bệnh β-Thal với biểu hiện thiếu máu mức độ nặng, nhẹ khác nhau. Các
ĐB chủ yếu rơi vào các nhóm sau (Weathrall .D.J. et al, 2001; Peng, C.T. et
al, 2013):

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

7

Viện nghiên cứu & phát triển CNSH