Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ y tế

Trờng đại học y h nội


Lê văn hng


Xác định vi khuẩn lậu v phát hiện đột biến gen
kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007


Chuyên ngành: Vi khuẩn học
Mã số: 62.72.68.01


tóm tắt Luận án tiến sỹ y học




Hà Nội - 2009

Công trình đợc hoàn thành tại: Trờng Đại học Y Hà Nội


Ngời hớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Lê Văn Phủng
2. TS. Lê Thị Phơng

Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hiển

Phản biện 2: PGS.TS. Vũ Tân Trào

Phản biện 3: PGS.TS. Đinh Duy Kháng



Luận án đã đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm Luận án cấp Nhà nớc tại: Trờng Đại
học Y Hà Nội
Vào hồi 14 giờ 00 ngày 22 tháng 12 năm 2009



Có thể tìm hiểu luận án tại các th viện:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội
- Th viện thông tin Y học Trung ơng

Danh mục nhữ

n tác giả
Danh mục những công trình của tác giả
đ đăng in có liên quan đến luận án

1. Lê Thị Phơng, Dơng Thị Nở, Lê Văn Hng và cộng sự (1994), "Tìm hiểu sự
kháng lại penicillin có sản xuất men -lactamase của các chủng lậu cầu phân lập đợc
tại Viện Da liễu trong nhng năm gần đây", Viện thông tin th viện Y học trung ơng
Hà Nội 1994, trang 43-45

2. Lê Thị Phơng, Phạm Văn Hiển, Lê Văn Hng (2002), "Giám sát kháng kháng
sinh của lậu cầu tại Viện Da liễu Trung ơng từ năm 1996-2000". Nội san Da liễu, số
2, Tổng hội Y Dợc học Việt Nam: trang 34-43.

3. Lê Văn Hng (2006), "Sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập
đợc tại Viện Da liễu Quốc gia năm 2005". Tạp chí Nghiên cứu y học. 46 (6): trang
83-86.

4. Lê Văn Hng, Nguyễn Thị Nh Lan (2008), "Giá trị của kỹ thuật PCR trong
chẩn đoán vi khuẩn lậu", Tạp chí Y học Việt Nam, tập 351 (2): trang 66-70

5. Lê Văn Hng, Nguyễn Thị Nh Lan (2008), " Sự kháng kháng sinh của các
chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc tại Viện Da liễu Quốc gia năm 2006", Tạp chí Y
học Việt Nam, tháng 10 số 2/2008, trang 183-187.


1
Đặt vấn đề
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh Lậu là một trong những bệnh lây truyền qua đờng tình dục

(LTQĐTD) phổ biến hiện nay ở nớc ta và nhiều nớc trên Thế giới. Bệnh
không gây tử vong nhng nếu điều trị không kịp thời, không đúng phác đồ
sẽ để lại nhiều biến chứng và di chứng làm ảnh hởng không những đối với
bản thân mà còn đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi.
Ciprofloxacin là một kháng sinh mới đợc đa vào điều trị bệnh Lậu
trong những năm gần đây với một liều uống duy nhất (500 mg) đã điều trị
đợc bệnh Lậu cấp; vì vậy đây là kháng sinh đợc cả thầy thuốc và bệnh
nhân rất a chuộng. Chính vì thế, việc lạm dụng kháng sinh này đã làm gia
tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn và gây khó khăn rất nhiều cho việc
chẩn đoán. Các kỹ thuật chẩn đoán thông thờng nh nhuộm soi, nuôi cấy
thờng không phát hiện đợc vi khuẩn lậu trong các trờng hợp này. Vì
vậy, bổ sung phơng pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
hơn so với các phơng pháp kinh điển là cần thiết, để đánh giá đúng hơn về
tình hình bệnh Lậu hiện nay và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn
lậu, từ đó có biện pháp can thiệp hữu hiệu. Nếu không, ciprofloxacin có thể
trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời
gian tới. Tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu: - Xác định tỷ lệ
nhiễm vi khuẩn lậu ở những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo,
âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007.
- So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật: PCR, nhuộm soi
và nuôi cấy.
- Tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập
đợc tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007.
- Phát hiện đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.
2. ý nghĩa thực tiễn và đóng góp mới của luận án:
* ý nghĩa thực tiễn của luận án:
- Xác định đợc tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu qua từng năm ở bệnh nhân
có hội chứng tiết dịch niệu đạo âm đạo giúp cho vấn đề xây dựng chơng
trình can thiệp có hiệu quả nhằm hạ thấp tỷ lệ lây lan.
- Đánh giá đợc tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở giai đoạn cấp tính và mạn

tính bằng những phơng pháp chẩn đoán kinh điển và hiện đại, có thể áp
dụng đợc ở những labo có điều kiện.
- Xác định đợc tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu qua từng
năm, giúp cho bác sỹ lâm sàng lựa chọn kháng sinh thích hợp trong điều trị
bệnh Lậu.



2
* Những đóng góp mới:
- áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại vào phát hiện tỷ lệ
nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tợng bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo,
âm đạo và đề xuất bổ sung kỹ thuật này vào chẩn đoán nhằm nâng cao tỷ lệ
phát hiện bệnh, nhất là ở giai đoạn mạn tính.
- Lần đầu tiên kỹ thuật sinh học phân tử đợc áp dụng để giải trình tự
gen gyrA và parC và tìm hiểu cơ chế đề kháng ciprofloxacin của những
chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc.
3. Bố cục của luận án
Luận án gồm 118 trang trong đó:
- Đặt vấn đề: 2 trang
- Chơng I. Tổng quan 32 trang
- Chơng II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 19 trang
- Chơng III. Kết quả nghiên cứu 34 trang
- Chơng IV. Bàn luận 28 trang
- Kết luận và kiến nghị 3 trang

Chơng 1: Tổng quan
1.1. Tình hình bệnh Lậu trên thế giới
Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu
ngời bị bệnh Lậu. Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu ngời mới

mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6%. ở London (Anh), theo
dõi 516 thai phụ, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4%. Matsumoto (2008) cho
biết, tại Nhật Bản: tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis tăng trên toàn thế
giới, trong khi đó tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu lại giảm, trừ những nớc thuộc
châu á.
1.2. Tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam
Sau ngày giải phóng miền Nam, bệnh hoa liễu nói chung và bệnh Lậu
nói riêng lan tràn khắp nơi. Theo thống kê của ngành Da liễu từ năm 1999
đến năm 2007 số bệnh nhân bị bệnh Lậu mỗi năm là:
Năm 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Số
BN
6.747 6.375 5.581 5.699 6.740 6.409 5.233 5.526 5.491
Về tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam, tôi nhận thấy số lợng bệnh nhân
mắc bệnh Lậu hầu nh không giảm trong khoảng mời năm qua. Có những
lúc bệnh Lậu tởng chừng đã giảm nhng lại tăng ngay trong những năm
tiếp theo.


3
1.3. Vi khuẩn lậu
Vi khuẩn lậu, Neisseria gonorrhoeae, thuộc họ Neisseriaceae, giống
Neisseria. Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh,
chúng khác biệt nhau về một số tính chất sinh vật hoá học (lên men đờng
glucose, không sinh hơi). Dựa vào tính chất này, ngời ta phân biệt vi
khuẩn lậu với một số Neisseria hoại sinh khác.
Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn đứng
thành đôi, hình hạt cà phê, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram (-),
có kích thớc 0,6
m x 0,8 m, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5

chiều rộng. Khi ở trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu là
loại vi khuẩn độc chiếm tế bào (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống
trong tế bào). Ngời ta có thể gặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều
hơn nữa trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính.
Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khi ra khỏi cơ thể, chúng dễ chết. Sức đề
kháng của vi khuẩn lậu rất kém, dễ bị bất hoạt khi ở điều kiện ngoại cảnh.
Nuôi cấy vi khuẩn lậu trên môi trờng Thayer-Martin có chất tăng sinh
Isovitalex và chất ức chế V-C-N. Nhiệt độ sinh trởng thích hợp là
35-36
0
C, độ ẩm > 70%, khí trờng CO
2
từ 3-10%, pH 7,3. Sau 24 giờ nuôi
cấy, đờng kính khuẩn lạc 0,5-1 mm, tròn, lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhầy và
có màu hơi xám, óng ánh nh hạt sơng.
1.4. Plasmid
Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp), có trọng lợng phân
tử 36 kb. Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36 kb đã đợc phân
lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin. Nhiều plasmid mang gen
kháng -lactamase (kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã đợc
phân lập và xác định đặc điểm. Hai plasmid hay gặp nhất là loại có kích cỡ
khoảng 5,3 hoặc 7,2 kb. Phần lớn vi khuẩn lậu chứa một plasmid 4,2 kb
(cryptic plasmid) nhng cha rõ chức năng. ADN của plasmid này đã đợc
giải trình tự hoàn toàn. Đôi khi có thể phân lập đợc vi khuẩn lậu không
chứa plasmid 4,2 kb sao chép tự do này nhng chúng vẫn có vẻ bình thờng về
các đặc tính sinh học.
Plasmid có khả năng tự nhân lên, nên trong một vi khuẩn sẽ có rất
nhiều những bản sao, do đó nếu chọn primer nhằm khuếch đại một đoạn
gen nào trên plasmid thì độ nhạy sẽ cao hơn khi đoạn gen đó nằm trên
nhiễm sắc thể. Tuy nhiên sẽ bỏ sót những chủng vi khuẩn lậu không có

plasmid. Nhng những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid chỉ chiếm
một tỉ lệ rất nhỏ và chỉ có ở một số nơi trên thế giới. Nên trong nghiên cứu
này đã chọn primer HO1 và HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản
nhằm vào gen cppB trên plasmid pJD1 mà gen cppB lại rất ổn định trên
plasmid pJD1. Các tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về plasmid


4
pJD1 này đã khảng định rằng có tới trên 96% số chủng vi khuẩn lậu chứa
plasmid pJD1.
1.5. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu
- ở ngời lớn: vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho cả nam và nữ. Triệu
chứng điển hình là đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo, âm đạo, tử cung, vòi
trứng, buồng trứng. Có khoảng 1/5 số ngời không có triệu chứng điển hình.
- ở trẻ em: thờng biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong
thời kỳ sinh con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày. Nếu
không điều trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà.
- Nhiễm trùng lan tỏa: bệnh thờng gặp ở những ngời bị bệnh Lậu
nhng không đợc điều trị kịp thời, đúng phác đồ. Hầu hết nhiễm vi khuẩn
lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ. Biểu hiện của bệnh nh: viêm khớp, viêm gan,
viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da.
1.6. Các kỹ thuật chẩn đoán ở phòng xét nghiệm
- Kỹ thuật nhuộm soi.
- Kỹ thuật nuôi cấy.
- Kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh: để phát hiện kháng thể kháng vi
khuẩn lậu hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng kết hợp bổ thể,
hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme
- Kỹ thuật sinh học phân tử thờng dùng.
* PCR: Năm 1985, nhà khoa học ngời Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển
phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR).

Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN
trong tế bào, trong đó, ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ
một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng đợc tách ra làm hai chuỗi
đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới.
* Tách, tạo dòng gen: là nhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của một
trình tự ADN xác định. Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong
một th viện gen, dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức là tập hợp ADN
cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm.
* Giải trình tự gen: là quá trình xác định thứ tự nucleotide của một đoạn ADN.
1.7. Nghiên cứu sinh học phân tử ở vi khuẩn lậu
Vi khuẩn lậu chỉ gây bệnh ở ngời. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể
của chủng N. gonorrhoeae FA1090 đã đợc giải và số lợng nucleotide là
2.153.922 (GenBank accession No NC 004969). Vi khuẩn lậu là một vi khuẩn
dễ bị chết khi ra ngoài môi trờng, nuôi cấy đòi hỏi những điều kiện ngặt
nghèo về chất dinh dỡng, khí trờng Các kỹ thuật sinh học phân tử đã
khắc phục đợc các nhợc điểm này của các kỹ thuật thông thờng vì các
kỹ thụât sinh học phân tử đợc sử dụng để phát hiện trực tiếp sự có mặt của


5
vật liệu di truyền của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm thông qua quá trình
khuếch đại vật liệu di truyền. Các kỹ thuật này rất nhạy nên chỉ cần có một
số lợng rất ít vi khuẩn là phản ứng có thể cho kết quả dơng tính. Các kỹ
thuật sinh học phân tử sử dụng trong chẩn đoán bao gồm: kỹ thuật lai,
khuếch đại acid nucleic, giải trình tự gen
1.8. Một số gen liên quan đến đề kháng của vi khuẩn lậu
Những thay đổi ở các vị trí (locus) khác nh mtr và penB sẽ gây ra
các tác dụng phụ. Vị trí mtr quyết định sự đề kháng nhiều kháng sinh và
chất sát khuẩn qua hệ thống bơm chủ động. Đột biến ở vị trí penB, tác
động tới porin, dẫn tới giảm tính thấm của màng ngoài tế bào với kháng

sinh a nớc và các hợp chất khác. Vi khuẩn lậu cũng có "gen giả" porA
nhng không đợc biểu hiện. Tác động phối hợp của các đột biến penA và
tăng biểu hiện mtr là làm tăng MIC của penicillin lên 120 lần. Đề kháng
qua trung gian nhiễm sắc thể liên quan tới những biến đổi mtr và penB
cũng làm giảm độ nhạy với penicillin. Các tác giả trên thế giới: Xiahong Su
và Inga Lind; Tiffany R. Shultz; U. Chaudhry; Masatoshi Tanaka nghiên
cứu về đề kháng quinolon của vi khuẩn lậu lại có chung một nhận xét là
những chủng vi khuẩn lậu đề kháng với quinolon thì đều có những đột biến
trên gen gyrA, gen parC và số lợng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC.
Vậy, những gen quyết định sự đề kháng của vi khuẩn nh: gen gyrA, parC,
gyrB, parE, penA, penB, mtr những gen này trên nhiễm sắc thể và
plasmid dẫn tới sự đề kháng rõ rệt trên lâm sàng. Do hạn chế về thời gian,
kinh tế, hơn nữa qua tham khảo những nghiên cứu đi trớc của các tác giả
trên thế giới thì phần lớn những nghiên cứu này đều đề cập đến gen gyr
A
và parC, còn những gen khác ít đợc đề cập nên tôi đã chọn gen gyrA và
parC để nghiên cứu về sự đề kháng của vi khuẩn lậu với kháng sinh
ciprofloxacin và những gen khác ít đợc đề cập. Mặt khác tôi cũng muốn
giành cho nghiên cứu vào dịp khác khi có điều kiện. Gen gyrA có độ dài
2.751 nucleotid mã hoá 916 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon
dài khoản 279 nucleotid mã hoá 93 axít amin. Gen parC có độ dài 2.307
nucleotid mã hoá 768 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài
khoản 255 nucleotid mã hoá 85 axít amin.
1.9. Kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
1.9.1. Trên thế giới
Thông báo của WHO (2008), cho biết tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại
kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 ở khu vực châu á Thái Bình
Dơng: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật
Bản 83,4%; Việt Nam 82,1%; Brunei 81,7%; Singapore 70%; Philippines
69%; Malaysia 62%; Australia 38,7%; New Zealand 13,7% và tỷ lệ vi

khuẩn lậu kháng tetracyclin ở mức độ cao: Singapore 76,8%; Hong Kong


6
48,9%; Trung Quốc 35,2%; Philippines 31%; New Zealand 25%; Việt
Nam 16,2%; Australia 12%.
1.9.2. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam
Cũng giống nh tình hình kháng kháng sinh trên thế giới, tỷ lệ vi
khuẩn lậu không những ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh mà còn
gia tăng mức độ đề kháng, đặc biệt với ciprofloxacin, nh thông báo của
Lê Thị Phơng năm 1996-2000 tỷ lệ này là 35,6% nhng đến năm 2006
theo thông báo của Lê Văn Hng thì tỷ lệ này là 56,6% và giảm nhạy cảm
25,5% nâng mức tổng kháng 82,1% .
1.9.3. Ciprofloxacin và kháng ciprofloxacin
Kháng sinh ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon thế hệ thứ hai đợc
đa ra thị trờng vào những năm 1980 với liều uống duy nhất 500 mg đã
có thể điều trị đợc bệnh Lậu cấp. Nhng, bệnh nhân nớc ta khi bị các
bệnh LTQĐTD thờng dấu bệnh, ít khi đi khám, mà lại tự sử dụng kháng
sinh nên đã làm lan truyền và gia tăng những chủng vi khuẩn lậu kháng các
kháng sinh nói chung và kháng với kháng sinh ciprofloxacin nói riêng.

- Công thức hóa học của Ciprofloxacin: C
17
H
18
FN
3
O
3

Hình 1.1. Công thức phân tử của ciprofloxacin
- Dợc lý và cơ chế tác dụng
Hoạt động bình thờng:
Enzyme DNA gyrase

Gỡ xoắn ADN

ADN nhân lên

Tế bào vi khuẩn nhân lên

Cơ chế tác động khi có quinolon:
Quinolon phong bế DNA-gyrase làm cho nó không hoạt động bình
thờng đợc, dẫn tới vi khuẩn không nhân lên đợc (vi khuẩn nhạy với
kháng sinh này). Gen gyrase kiểm soát cấu trúc không gian của protein


7
Gyrase. Cấu tạo Gyrase gồm hai tiểu phần GyrA và GyrB do gen gyrA và
gyrB quy định. Tơng tự topoisomerase IV cũng tham gia vào mở xoắn
ADN. Cấu tạo topoisomerase IV gồm hai tiểu phần ParC và ParE do gen
parC và parE quy định. Khi enzyme DNA-gyrase bị thay đổi (do đột biến
gen), nó không tơng tác với quinolon nữa. Vì vậy, vi khuẩn vẫn nhân lên

bình thờng khi có mặt của quinolon (vi khuẩn kháng quinolon).
1.10. Các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến đề kháng
U. Chaudhry và cộng sự (2002) nghiên cứu 63 chủng vi khuẩn lậu
phân lập trên bệnh nhân ở Delhi, ấn Độ có 5 chủng (6%) nhạy cảm với
ciprofloxacin (MIC < 0,06 g/ml). Phân tích trình tự ADN của gen gyrA và
parC cho thấy: tất cả các chủng kháng ciprofloxacin (58 chủng) đều có sự
đột biến ở đoạn gen gyrA và parC. GyrA (Ser91 thành Phe, Asp-95 thành
Asn, Val-120 thành Leu). Cũng về vấn đề này, Xie P. và cộng sự (2003)
cho biết: 20 chủng đề kháng và 20 chủng nhạy cảm với kháng sinh nhóm
quinolon tại tỉnh Wusu, Trung Quốc đều có những đột biến điểm ở Asp-95
của gen gyrA và Asp-86, Ser-87, Ser-88, Glu-91 của gen parC. Liên quan
đến giá trị MIC và số lợng các đột biến, Xu J. S. và cộng sự (2006) nghiên
cứu 18 chủng kháng ciprofloxacin ở tỉnh Jiangsu, Trung Quốc và phát hiện
những đột biến tại gen gyrA và parC kết luận rằng những chủng có MIC
cao thì có nhiều điểm đột biến. Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới, các tác
giả đều có chung nhận xét rằng, đột biến gen gyrA và parC có liên quan
đến sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin.

Chơng 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
Là bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung.
- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
+ Có triệu chứng lâm sàng: miệng sáo đỏ, sng, có mủ hoặc dịch tiết ở
niệu đạo màu trắng đục, vàng hoặc hơi xanh, khi đi tiểu thấy nóng buốt
hoặc có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, nóng rát khi đi tiểu.
+ Đồng ý tham gia vào nghiên cứu của tôi.
- Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
Đang dùng thuốc kháng sinh tại thời điểm lấy bệnh phẩm 7 ngày.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp

Nghiên cứu của tôi đợc thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội
chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ
năm 2005-2007 với số mẫu 5.091 bệnh nhân, để tôi: xác định tỷ lệ nhiễm vi


8
khuẩn lậu và tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu
phân lập đợc ở đối tợng này.
Trong tổng số 5.091 bệnh nhân, tôi chọn ngẫu nhiên lấy 500 bệnh
nhân để: so sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm
soi và nuôi cấy, tôi sử dụng phơng pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang.
Phân tích các trình tự nucleotide và acid amin tôi sử dụng phơng pháp kết
thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977).
2.2.2. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
+ ở nữ giới: lấy bệnh phẩm ở cổ tử cung, niệu đạo, 2 bên của tuyến Skène,
2 bên tuyến Bartholin.
+ ở nam giới: lấy bệnh phẩm ở niệu đạo.
2.2.3. Kỹ thuật nhuộm soi hình thể: sau khi phết bệnh phẩm, cố định trên
ngọn lửa đèn cồn, nhuộm Gram. Nhận định kết quả: vi khuẩn có hình hạt
cà phê, bắt màu Gram (-), nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính
(nghĩ tới vi khuẩn lậu).
2.2.4. Kỹ thuật nuôi cấy
Bệnh phẩm đợc ria trên môi trờng Thayer-Martin bằng những đờng
dích dắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng. Để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm nhiệt độ
35-36
0
C, có 3-10% khí CO
2
, độ ẩm > 70%. Sau 18-24 giờ, quan sát khuẩn
lạc. Nếu cha thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa.

2.2.5. Xác định vi khuẩn lậu
Nhuộm Gram khuẩn lạc: vi khuẩn có hình hạt cà phê, Gram (-).
Test Oxidase dơng tính; Kỹ thuật phân hủy đờng nhanh (Test
Neisseria4H): vi khuẩn lậu chuyển hoá đờng glucose.
2.2.6. Kỹ thuật kháng sinh đồ
+ Kỹ thuật khuếch tán trên thạch
Sử dụng môi trờng Thayer-Martin: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi
cấy 18-24 giờ, hoà đều với nớc muối sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu
chuẩn Mc Farland 0,5 (tơng đơng với 3x10
8
vi khuẩn/1ml). Huyền dịch
láng đều lên bề mặt đĩa thạch, để khô mặt thạch, đặt các khoanh giấy
kháng sinh, để 10 phút, ủ tủ ấm 35-36
0
C, 3-10% CO
2
, độ ẩm > 70%. Đọc
kết quả sau 18-24 giờ, đo đờng kính vùng ức chế (mm) và so kết quả với
bảng chuẩn.
Tất cả các lần thử nghiệm, kết quả đờng kính vùng ức chế của các
khoanh giấy kháng sinh trên chủng mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép;
chứng tỏ các yếu tố kỹ thuật đảm bảo chất lợng, từ đó tôi có thể khẳng
định rằng kết quả kháng sinh đồ ở các chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc là
chính xác.



9
+ Kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn lậu (E-test).
Tiến hành: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu hoà đều với nớc muối sinh lý

0,9%. So với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5. Dùng tăm bông nhúng vào
huyền dịch. Ria tăm bông. Đặt thanh giấy E-test. Để khoảng 10 phút ở
nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuyếch tán đều. Để vào
tủ ấm nhiệt độ 35-36
o
C, nồng độ CO
2
3-10%, độ ẩm >70%. Sau 18-24 đọc
kết quả.
2.2.7. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm
Sinh phẩm và hóa chất: QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit
hãng Qiagen. Thực hiện theo hớng dẫn của hãng: quy trình tách chiết
ADN, chạy PCR (Khuếch đại ADN), phát hiện sản phẩm khuếch đại gen
bằng điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose, xem và chụp ảnh bản
thạch. So sánh kích cỡ của sản phẩm với thang ADN chuẩn để kết luận sản
phẩm có đặc hiệu cho vi khuẩn lậu hay không.
2.2.8. Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC
Các hoá chất (hãng Bio-Rad) (Mỹ). Thực hiện theo hớng dẫn của
hãng: chạy PCR (khuếch đại ADN, phát hiện sản phẩm khuếch đại gen,
điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose, xem và chụp ảnh bản thạch các
băng ADN sẽ phát sáng. Xác định PCR bằng cách so sánh kích cỡ của
băng ADN với băng ADN của chứng dơng (gyrA và parC). Sản phẩm
PCR đợc dùng để giải trình tự.
2.2.9. Quy trình giải trình tự gen
Giải trình tự bằng ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Core Kit. Tinh sạch sản phẩm sau khi làm phản ứng giải trình tự gen. Đọc
kết quả bằng máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem. Trình tự
các nucleotide ở các mẫu nghiên cứu đợc so sánh với trình tự nucleotide
của gen gyrA và parC của các chủng lậu bình thờng để tìm ra điểm đột biến.
2.2.10. Xử lý số liệu

Số liệu xử lý theo chơng trình SPSS 16.0 và Whonet 5. Các trình tự
nucleotide và acid amin đợc phân tích bằng phần mềm Bioedit 7.0.9.0.
2.2.11. Y đức trong nghiên cứu
T vấn cho bệnh nhân khi lấy dịch tiết. Thông tin về bệnh nhân tuyệt
đối giữ bí mật. Đợc sự đồng ý của hội đồng y đức.
2.2.12. Địa điểm nghiên cứu
Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia. Labo trung tâm trờng Đại
học Y Hà Nội. Khoa xét nghiệm - Viện các bệnh truyền nhiễm Quốc Gia -
Nhật Bản.




10
chơng 3: kết quả nghiên cứu

3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu
đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 (n=5.091)
Nhuộm soi Nuôi cấy
Kết quả
Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%)
Dơng tính
471 9,3 503 9,9
Âm tính
4.620 90,7 4.588 90,1
Tổng số
5.091 100 5.091 100
Giá trị P
0,29

3.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi
và nuôi cấy
3.2.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu của các bệnh nhân
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Marker







Hình 3.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu
của 8 bệnh nhân từ giếng 3-10.
Thang ADN mẫu: 100 bp. Giếng 1: chứng âm. Giếng 2: chứng dơng.
Giếng 5 và 10: dơng tính. Giếng 3, 4, 6, 7, 8 và 9: âm tính.

390
bp
400
bp
100
bp


11
3.2.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi, và
nuôi cấy
Bảng 3.13. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi,
và nuôi cấy (n=500)

Dơng tính Âm tính
Kết quả
Kỹ thuật
Số BN % Số BN %
Nhuộm soi
53 10,6 447 89,4
Nuôi cấy
65 13,0 435 87,0
PCR
141 28,2 359 71,8

3.2.3. Kết quả xét nghiệm tìm vi khuẩn lậu của ba kỹ thuật PCR,
nhuộm soi, nuôi cấy trên nhóm 1 và nhóm 2
Nhóm 1: Bệnh nhân đợc chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp
tính).
Nhóm 2: Bệnh nhân đợc chẩn đoán là hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm
đạo (mạn tính).
Bảng 3.14. Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi
cấy ở 2 nhóm (n=500)
Nhuộm soi Nuôi cấy PCR
Nhóm
nghiên cứu
Số
BN
Dơng
tính
%
Dơng
tính

%
Dơng
tính
%
Nhóm 1 86 50 58,1 57 66,3 80 93,0
Nhóm 2 414 3 0,7 8 1,9 61 14,7

3.3. Kết quả kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu năm 2005-2007
Bảng 3.21. So sánh mức độ đề kháng trong ba năm 2005-2006-2007

% đề kháng (R+I)
Kháng sinh
2005 (n=162) 2006 (n=212) 2007 (n=129)
Penicillin 61,7 54,2 41,9
Ceftriaxon 0 0 0
Ciprofloxacin 80,9 82,1 89,1
Spectinomycin 0 0 0
Tetracyclin 9,9 16,5 37,5
Azithromycin 5,6 1,9 0,8
Cefotaxim 1,2 0,9 3,1



12
3.4. đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin
3.4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA
Giếng 1: chứng âm; Giếng 2:chứng dơng, Giếng 3: thang ADN 100bp
Giếng 4 đến 10: kết quả dơng tính

3.4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10











Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC
Giếng 1: chứng âm; Giếng 2:chứng dơng, Giếng 3: thang ADN 100bp
Giếng 4 đến 10: kết quả dơng tính

279
bp
255
bp


13
3.4.3. KÕt qu¶ gi¶i tr×nh tù nucleotid ®o¹n gen gyrA chøa ®ét biÕn
H×nh 3.4. Tr×nh tù nucleotid cña ®o¹n gen gyrA chøa ®ét biÕn



















H×nh 3.5. Tr×nh tù nucleotid cña ®o¹n gen gyrA chøa ®ét biÕn

14

3.4.4. KÕt qu¶ gi¶i tr×nh tù nucleotid ®o¹n gen parC chøa ®ét biÕn
H×nh 3.6. Tr×nh tù nucleotid cña ®o¹n gen parC chøa ®ét biÕn

H×nh 3.7. Tr×nh tù nucleotid cña ®o¹n gen parC chøa ®ét biÕn
















15

3.4.5. Ph©n tÝch tr×nh tù ®o¹n ADN th−êng x¶y ra ®ét biÕn
dÉn tíi kh¸ng ciprofloxacin
B¶ng 3.22. Tr×nh tù ®o¹n ADN th−êng x¶y ra ®ét biÕn dÉn tíi
kh¸ng ciprofloxacin theo MIC (n=71)
Chñng
MIC (μg/ml)
GyrA ParC
ATCC 49226 0,001-0,008
Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91
63 0,002
27 0,060
67 1 Phe Ala Asn
69 1 Phe Ala
73 1 Phe Ala Asn
21 1,5 Phe Ala
28 1,5 Phe Gly Asn
47 1,5 Phe Gly
75 1,5 Phe Ala
2 2 Phe Ala
20 2 Phe Gly
23 2 Phe Gly Arg
26 2 Phe Ala
39 2 Phe Ala Asn
45 2 Phe Ala Asn
56 2 Phe Ala
60 2 Phe Ala
62 2 Phe Ala
64 2 Phe Ala
15 3 Phe Ala Arg
33 3 Phe Ala Asn

34 3 Phe Ala Asn
36 3 Phe Ala Asn
37 3 Phe Gly Asn
40 3 Phe Ala Asn
41 3 Phe Ala Arg
11 4 Phe Gly Asn
12 4 Phe Ala Asn
13 4 Phe Ala Asn
46 4 Phe Ala Asn
54 4 Phe Ala Asn
8 6 Phe Gly Asn
9 6 Phe Ala Asn
17 6 Phe Ala Asn
19 6 Phe Ala Asn
24 6 Phe Ala Asn
Ghi chó: ¤ trèng lµ gièng víi chñng chuÈn.


16
Chñng
MIC (μg/ml)
GyrA ParC
ATCC 49226 0,001-0,008
Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91
42 6 Phe Ala Asn
43 6 Phe Ala Asn
66 6 Phe Ala Asn
4 12 Phe Ala Asn
32 12 Phe Ala Asn
38 12 Phe Ala Asn

49 12 Phe Ala Asn
51 12 Phe Ala Asn
53 12 Phe Gly Arg
55 12 Phe Ala Asn
61 12 Phe Ala Asn
68 12 Phe Ala Asn
71 12 Phe Ala Asn
30 16 Phe Ala Gln
1 32 Phe Asn Ile
5 32 Phe Gly Arg
6 32 Phe Asn Ile
10 32 Phe Asn Ile
16 32 Phe Gly Gln
18 32 Phe Gly Gln
22 32 Phe Gly Gln
25 32 Phe Gly Arg
29 32 Phe Asn Ile
35 32 Phe Gly Arg
44 32 Phe Gly Arg
48 32 Phe Gly Arg
52 32 Phe Asn Ile
57 32 Phe Gly Gln
58 32 Phe Gly Arg
59 32 Phe Ala Ile
65 32 Phe Ala Arg
70 32 Phe Gly Arg
72 32 Phe Ala Asn
74 32 Phe Asn Ile
14 32 Phe Ala Asn

Ghi chó: ¤ trèng lµ gièng víi chñng chuÈn.


17
3.4.6. Số lợng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ
kháng ciprofloxacin
Bảng 3.23. Số lợng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức
độ kháng ciprofloxacin (n=69)
MIC
(g/ml)
Số
chủng
(n=69)
Tỷ lệ
(%)
Số lợng đột
biến trên
gyrA
Số lợng đột
biến trên
parC
Tổng số đột
biến tại 2
gen
1 3 4,3 2 0-1 2-3
1,5 4 5,8 2 0-1 2-3
2 10 14,5 2 0-1 2-3
3 7 10,1 2 1 3
4 5 7,2 2 1 3
6 8 11,6 2 1 3

12 10 14,5 2 1 3
16 1 1,4 2 1 3
32 21 30,4 2 1 3
Tổng 69 100 18 6-9 24-27

3.4.7. Phân tích các đột biến trên gen gyrA
Bảng 3.24. Phân tích các đột biến trên gen gyrA của 69 chủng vi
khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69)
Loại đột biến (n=69) Số chủng (%)
MIC trung bình (g/ml)
Ser-91 Phe
69 (100) 14,4
Asp-95 Ala
44 (63,8) 9,5
Asp-95 Gly
19 (27,5) 20,2
Asp-95 Asn
6 (8,7) 32,0

3.4.8. Phân tích các đột biến trên gen parC
Bảng 3.25. Phân tích các đột biến trên gen parC của 69 chủng vi
khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69)
Loại đột biến (n=69) Số chủng (%)
MIC trung bình (g/ml)
Không đột biến 11 (15,9%) 1,77
Asp-86 Asn
3 (4,3%) 4,33
Ser-87 Asn
31 (44,9%) 10,24
Ser-87 Arg

12 (17,4%) 23,00
Ser-87 Ile
7 (10,1%) 32,00
Glu-91 Gln
5 (7,2%) 28,80



18
3.4.9. Phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen
Bảng 3.26. Phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen (n=44)
Các chủng mang đột biến
Ser91Phe và Asp95Ala
trên gen gyrA (n=44)
Số chủng
(%)
MIC
trung bình
(g/ml)
Không kèm đột biến trên parC
9 (20,5) 1,78
Kèm đột biến trên parC
35 (79,5) 11,49

3.4.10. Mối liên quan giữa MIC và đột biến
Bảng 3.27: Mối liên quan giữa MIC và đột biến (n=71)
MIC (g/ml)
Số chủng (%) Số lợng đột biến
0,002-0,060 2 (2,8) 0
1-2 11 (15,5) 2

1-2 6 (8,5) 3
3-32 52 (73,2) 3
Tổng
71 (100)

Chơng 4: Bn luận
4.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu
đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007
Từ 2005 đến 2007, trong tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết
dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia đợc tôi thực
hiện các xét nghiệm: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đã phát
hiện đợc 503 chủng vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9%. Kết quả nghiên cứu
của tôi thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Văn Huân và cộng sự (1998) ở
Quảng Ninh là 17,12% và tơng đơng với kết quả của Diệp Xuân Thanh
khi nghiên cứu tại Viện Da liễu Quốc Gia (1998), tỷ lệ này là 10,05%. Sở
dĩ có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là do mẫu nghiên cứu của
tôi lớn, thời gian nghiên cứu dài. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao hay thấp
còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh hay
cha sử dụng kháng sinh, kinh nghiệm và kỹ năng của xét nghiệm viên,
chất lợng của các phòng xét nghiệm, trình độ hiểu biết về bệnh tật của
bệnh nhân
Theo nghiên cứu của Creighton và cộng sự (2003) tại Khoa Hoa liễu
bệnh viện Hoàng gia Anh cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 18,8%.
Nghiên cứu của Van der Pol (2001) tại Uganda tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở
đây là 3,4%. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn kết quả của Creighton tại
Anh, Adaskevich tại Belarus và cao hơn so với kết quả nghiên cứu của các
tác giả khác trên thế giới nh Van der Pol tại Uganda.


19

4.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật: PCR, nhuộm soi
và nuôi cấy
Các kỹ thuật sinh học phân tử đã đợc áp dụng rộng rãi trên thế giới
từ nhiều năm nay. Đặc biệt, kể từ sau khi kỹ thuật PCR ra đời (nửa đầu
những năm 1980), sinh học phân tử đã có những bớc tiến vợt bậc. Ngời
ta đã có thể thao tác với các vật liệu di truyền nh ADN, ARN trong phòng
thí nghiệm. Thêm nữa, việc tổng hợp ra các vật liệu di truyền trên với số
lợng lớn đã không còn là một vấn đề khó khăn. Nhiều dự án giải trình tự
bộ gen của nhiều động vật, thực vật và vi sinh vật đã và đang đợc tiến
hành. Một trong những công trình nghiên cứu lớn trong y sinh học là "Dự án
Gen ngời".
ở Việt Nam, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong các
lĩnh vực khoa học nói chung và y sinh học nói riêng cũng mới đợc triển
khai trong vòng hơn 20 năm. Nhiều đề tài và dự án nghiên cứu đã và đang
đợc triển khai nhằm áp dụng các tiến bộ của khoa học vào nghiên cứu,
sản xuất, chẩn đoán và điều trị hoặc nghiên cứu phục vụ sản xuất thuốc,
chế phẩm sinh học, vacxin đã và đang đợc triển khai.
Trong lĩnh vực Y học PCR có rất nhiều ứng dụng trong việc xác định
căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng nh Chlamydia đờng sinh dục,
phong, lao
Trong tổng số 500 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo
đợc tôi dùng đồng thời ba kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy và PCR. Kỹ PCR
phát hiện có 141 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ là 28,2%, nuôi cấy phát
hiện có 65 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ là 13% và nhuộm soi phát
hiện có 53 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ là 10,6%. Trong số 65 bệnh
nhân dơng tính bằng kỹ thuật nuôi cấy và thử đầy đủ các tính chất sinh
vật hóa học thì kỹ thuật PCR chỉ cho kết quả dơng tính với 64 bệnh nhân,
còn một bệnh nhân kỹ thuật PCR lại cho kết quả âm tính. Mẫu này đã đợc
tôi làm đi làm lại nh
ng kết quả PCR vẫn âm tính. Điều này có thể giải

thích là có thể ADN của vi khuẩn không đợc tách triết hoặc do tác dụng
của hóa chất, mồi, nên không có sản phẩm trong quá trình nhân gen, điện
di, nên cho kết quả âm tính hoặc chủng vi khuẩn lậu này không có plasmid
pJD1 nên không có sản phẩm trong quá trình khuếch đại, điện di sẽ cho kết
quả âm tính và cũng phù hợp với nhiều tác giả khác trên thế giới khi
nghiên cứu về loại plasmid pJD1 này đều có chung một nhận xét: plasmid
pJD1 chỉ có ở 96% số chủng vi khuẩn lậu. Theo thông báo của Gaydos và
cộng sự thuộc trờng Đại học Y Johns Hopkins và trờng Đại học Công
cộng và vệ sinh ở Baltimore, Maryland, tác giả tiến hành xét nghiệm PCR
dịch âm đạo cho 793 phụ nữ quân nhân ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh
đến khám tại phòng khám STD đã phát hiện 3,3% số nữ quân nhân nhiễm
vi khuẩn lậu, trong khi đó nuôi cấy chỉ phát hiện 2,1%. Boel và Van Herk


20
tại phòng xét nghiệm vi sinh thuộc Bệnh viện Catharina, Veldhoven và
Khoa Da liễu ở Eindhoven, Hà Lan cho biết: khi nghiên cứu 765 bệnh nhân
nam và nữ đợc lấy bệnh phẩm ở sinh dục và hầu họng để xét nghiệm PCR
chẩn đoán vi khuẩn lậu, có 229 bệnh phẩm đợc khẳng định dơng tính
chiếm tỷ lệ 30%.
Để so sánh về tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của kỹ thuật PCR, kỹ
thuật nhuộm soi và kỹ thuật nuôi cấy, tôi tiến hành đồng thời ba kỹ thuật
trên 500 bệnh nhân và đợc chia làm hai nhóm. Nhóm 1 là nhóm bệnh
nhân đợc chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp tính) tỷ lệ phát
hiện bệnh là: 93%, 58,1% và 66,3% nhng cũng không thấy có sự khác
biệt nhiều giữa ba kỹ thuật này. Sự khác biệt đặc biệt rõ ở nhóm 2: nhóm
bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) nhng bằng
kỹ thuật PCR vẫn phát hiện đợc 61 (14,7%) bệnh nhân dơng tính trong
khi đó kỹ thuật cổ điển nh nuôi cấy chỉ phát hiện đợc 8(1,9%) và nhuộm
soi thì tỷ lệ phát hiện lại quá thấp chỉ phát hiện đợc 3 (0,7%) bệnh nhân.

Nh vậy tỷ lệ phát hiện bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả rất cao (gấp
trên 20 lần kỹ thuật nhuộm soi và hơn 7 lần kỹ thuật nuôi cấy). Vậy kỹ
thuật PCR rất đợc khuyến cáo trong các trờng hợp lậu mạn tính hoặc khi
các kỹ thuật khác không phát hiện đợc mà bệnh nhân vẫn có triệu chứng
lâm sàng.
Chính vì vậy, khi chẩn đoán một bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu
đạo, âm đạo đợc chẩn đoán là bệnh Lậu mạn tính thì chỉ cần làm xét
nghiệm nhuộm soi và làm thêm xét nghiệm PCR nếu nghi ngờ. Không nên
lựa chọn đồng thời cả ba kỹ thuật trong chẩn đoán bệnh Lậu mạn vì sẽ gây
rất nhiều phiền hà cho bệnh nhân và tốn kém.
Nhng điều này lại hạn chế đối với các nhà giám sát kháng kháng
sinh muốn khoanh vùng hoặc cô lập đối với những chủng vi khuẩn lậu
kháng thuốc để thông báo trong nớc và quốc tế về tình hình kháng kháng
sinh của chúng từ đó có những biện pháp can thiệp hữu hiệu.
Với tình hình sử dụng kháng sinh tuỳ tiện không theo một chỉ định
điều trị nào nh
hiện nay thì kỹ thuật PCR là một kỹ thuật lý tởng đợc áp
dụng để phát hiện vi khuẩn lậu ở mọi giai đoạn. Tuy mẫu nghiên cứu với
số lợng cha lớn nhng cũng phần nào cũng đánh giá đúng về tỷ lệ nhiễm
vi khuẩn lậu hiện nay ở nớc ta trên những bệnh nhân có hội chứng tiết
dịch niệu đạo, âm đạo.
4.3. Kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007
- Penicillin
Từ các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nớc cùng với chính
nghiên cứu của mình, tôi nhận thấy tỷ lệ vi khuẩn lậu đề kháng với
penicillin đang giảm dần qua từng năm. Có lẽ do penicillin ít đợc sử dụng
điều trị bệnh Lậu và các nhiễm khuẩn khác nên vi khuẩn lậu đã giảm tính


21

đề kháng với kháng sinh này qua từng năm: 61,7% (2005), 54,2% (2006)
và 41,9% (2007).
- Tetracyclin
Tetracyclin thờng không đợc khuyến nghị để điều trị bệnh Lậu vì
kháng sinh phải đợc dùng với nhiều liều trong vài ngày, làm tăng khả
năng kém tuân thủ điều trị và liều không đúng. Tuy nhiên, kháng sinh rẻ và
do đó đợc sử dụng rộng rãi, nhất là trong lĩnh vực y tế không chính quy.
Trong nghiên cứu của tôi tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại tetracyclin lại có xu
hớng gia tăng: 9,88% năm 2005, năm 2006 là 16,51%, năm 2007 là
37,5%.
- Cephalosporin
Tôi chọn cefotaxim vào nhóm bổ xung vì giá thành của cefotaxim
thấp hơn nhiều so với ceftriaxon và cũng thuộc nhóm cephalosporin thế hệ
thứ 3. Dùng trong điều trị bệnh Lậu thấy kết quả tơng đối tốt, nhng gần
đây đã xuất hiện những chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh này.
- Spectinomycin
Kết quả nghiên cứu của tôi không thấy có chủng vi khuẩn lậu nào
kháng lại kháng sinh spectinomycin. Nh vậy kháng sinh spectinomycin
vẫn là 1 kháng sinh có tác dụng rất tốt trong điều trị vi khuẩn lậu tại Việt
Nam với liều sử dụng duy nhất 2 g tiêm bắp.
- Azithromycin
Azithromycin là kháng sinh đợc WHO khuyến cáo trong phác đồ
điều trị bệnh Lậu kết hợp với Chlamydia trachomatis. Nghiên cứu của tôi
trong những năm qua cho thấy số chủng vi khuẩn lậu đã giảm nhạy cảm
với azithromycin: 5,56% năm 2005, 1,89% năm 2006, 0,81% năm 2007.
- Ciprofloxacin
Ciprofloxacin là kháng sinh đợc cả bác sỹ và bệnh nhân tin dùng đối
với các bệnh nhiễm trùng nói chung và bệnh Lậu nói riêng. Kết quả nghiên
cứu của tôi về tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: năm 2005
là 80,86%, năm 2006 là 82,07%, năm 2007 là 89,14%, cao hơn thông báo

của Lê Thị Phơng năm 2001 và tơng đơng với thông báo của một số
nớc trong khu vực. Vì vậy ciprofloxacin cũng không nên đa vào danh
mục các kháng sinh sử dụng điều trị bệnh Lậu ở Việt Nam.
Khi nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu
phân lập đ
ợc tại Viện Da liễu Quốc Gia, những hiểu biết về cơ chế đề
kháng và cơ chế di truyền của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn đã giúp
đợc rất nhiều cho các thầy thuốc lâm sàng trong công tác điều trị. Vi
khuẩn lậu kháng kháng sinh chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể đã
làm xuất hiện chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh trong chính quần thể vi
khuẩn nhạy cảm, đặc biệt là khi liều điều trị thấp, không đạt nồng độ tiêu


22
diệt vi khuẩn thì sự có mặt của kháng sinh trở thành một chất chọn lọc, giữ
lại vi khuẩn đề kháng.
4.4. Đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin
Muốn xác định đợc điểm đột biến gen ta phải giải trình tự đoạn gen
liên quan đó rồi so sánh với đoạn gen gốc. Hai phơng pháp xác định trình
tự chính là phơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phơng
pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhau về
nguyên tắc, hai phơng pháp này có một số điểm chung: hình thành một
tập hợp nhiều oligonucleotid có chiều dài khác nhau, mỗi oligonucleotid có
xác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó đợc
phân tách dựa vào kích thớc của oligonucleotid bằng kỹ thuật điện di trên
gel polyacrylamid có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau 1
nucleotid.
Với việc sử dụng kháng sinh tùy tiện nh hiện nay ở nớc ta cũng
nh một số nớc trên thế giới đã làm gia tăng tính kháng thuốc của vi
khuẩn lậu; nguy hại hơn là nhiều gen kháng những kháng sinh khác nhau

đã đợc tìm thấy ở vi khuẩn lậu. Mặc dù bệnh Lậu ở nớc ta chiếm một tỷ
lệ tơng đối cao, nhng việc nghiên cứu một cách có hệ thống về sự đề
kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu vẫn còn hạn chế. Khoa Xét nghiệm
Viện Da liễu Quốc Gia thống kê hàng năm: mức độ đề kháng ciprofloxacin
của vi khuẩn lậu phân lập năm 2007 là 89,15% (MIC lên tới 32 g/ml). ở
Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về đột biến gen kháng
ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Khi nghiên cứu 71 chủng vi khuẩn lậu, có 2
chủng nhạy cảm với ciprofloxacin và 69 chủng kháng ciprofloxacin, tôi
tiến hành giải trình tự tại Khoa Xét nghiệm-Viện các bệnh truyền nhiễm
Quốc Gia, Nhật Bản để xác định điểm đột biến liên quan đến sự đề kháng
ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả nh sau: đối với chủng nhạy cảm
tôi không thấy có điểm đột biến. Phân tích 69 chủng đề kháng (MIC = 1-32
g/ml) nhận thấy: các chủng đề kháng đều có những thay đổi trên gen
gyrA và parC.
Các chủng đề kháng đều có đột biến Ser-91 thành Phe.
Ngoài ra, trên gen gyrA còn phát hiện đột biến tại Asp-95 ở tất cả các
chủng kháng ciprofloxacin với 3 kiểu đột biến là Asp-95 thành Ala (chiếm
63,8%), Asp-95 thành Gly (chiếm 27,5%) và Asp-95 thành Asn (chiếm
8,7%). Những đột biến trên gen gyrA và parC dẫn đến những thay đổi axit
amin ở protein GyrA (đặc biệt tại Ser-91 và Asp-95) và protein ParC liên
quan mật thiết với tính kháng ciprofloxacin. Nghiên cứu của tôi cũng tơng
tự U. Chaudhry và cộng sự. Về số lợng đột biến trên 2 gen gyrA và parC
trong nghiên của tôi: ở những chủng đề kháng yếu (MIC 2 g/ml) có 2
đột biến trên gen gyrA và có thể có hoặc không có đột biến trên gen parC,
những chủng MIC 3 g/ml đều có 3 đột biến trên 2 gen nói trên; nh vậy
mức độ kháng ciprofloxacin có liên quan đến số lợng các đột biến điều