SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bộ môn
LOGO

Hóa phân tích – Kiểm nghiệm

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY –HPLC)

1


Giới thiệu chung
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - sắc ký lỏng áp suất cao
 Kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên
một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động
lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
 Khi phân tích các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và
tách ở nhiệt độ thường.

 Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gian ngắn
(khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác
nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC.
2


Giới thiệu chung
 Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong
lĩnh vực phân tích hoá học nói chung cũng như trong
kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học

nói riêng.
 Trong phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký,
phần lớn các dược điển đều sử dụng sắc ký phân bố.

3


Giới thiệu chung

Ứng dụng

(1)
Định tính

(2)
Thử tạp
chất

4

(3)
Định lượng


Giới thiệu chung
Định tính

So sánh thời gian
lưu của chất phân
tích trong dung

dịch thử
với thời gian lưu
của chất chuẩn
trong dung dịch
chuẩn chạy cùng
Đk sắc ký

Mẫu thử

Mẫu chuẩn

5


Giới thiệu chung
Định lượng

Phương
pháp
chuẩn
ngoại

Phương
pháp
thêm
chuẩn

Phương
pháp
chuẩn

nội

6

Phương
pháp
chuẩn
hóa diện
tích.


Nội dung
1

• Thông số đặc trưng

2

• Hệ thống máy HPLC

3

• Các kỹ thuật HPLC

4

• Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC

5

• Chuẩn hóa cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

6

• Định lượng bằng phương pháp HPLC

7

• Các phương pháp định lượng HPLC
7


1. Thông số đặc trưng
Hệ số dung lượng k’
Hệ số chọn lọc α
Hệ số đối xứng F
Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Độ phân giải Rs

8


1. Thông số đặc trưng
Hệ số dung lượng k’

Tối ưu: 1 < k’ < 8

K : hệ số phân bố
Vs : thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động

Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha
động
tR : thời gian lưu
t’R : thời gian lưu hiệu chỉnh
t0: thời gian chết
9


1. Thông số đặc trưng
Hệ số chọn lọc α

1,05 ≤ α ≤ 2,0

Hệ số đối xứng F

W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
10


1. Thông số đặc trưng
Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
W: Chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Độ phân giải Rs

Rs >1. Tối ưu Rs = 1,5

tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A),
WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic,
W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn vị.
11


2. Hệ thống máy HPLC
1. Bình chứa dung
môi pha động
2. Bộ phận đuổi khí
3. Bơm cao áp
4. Bộ phận tiêm mẫu

5. Cột sắc ký
6. Detector
7. Máy tính –
phần mềm
8. Máy in
12


2. Hệ thống máy HPLC

13


3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

3

4
14

Trao đổi ion


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha tĩnh

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký lỏng- lỏng (LLC): lớp

Sắc ký pha liên kết (BPC):

mỏng pha lỏng hữu cơ bao

được liên kết hóa học với

trên bề mặt của các tiểu phân

chất mang. Các nhóm chức

chất mang

hữu cơ liên kết với bề mặt

Nhược điểm: bị rửa trôi dần

của các tiểu phân silica qua

theo dòng pha động  hiệu

các nhóm silanol

lực cột bị giảm dần trong quá
trình sử dụng.
15


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha tĩnh

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Một số pha liên kết thường dùng

16


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha tĩnh
- Khi sử dụng silica, nhôm oxyd hoặc polyme xốp
thì các chất được phân tách theo cơ chế hấp phụ
nên được gọi là sắc ký hấp phụ.

- Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký
trao đổi ion.
- Nếu pha tĩnh là polyme xốp như dextran..., ta có

sắc ký rây phân tử.
17


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh
người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha
thuận và sắc ký pha đảo)

18


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha động
 Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của

2, 3 hay 4 thành phần. Người ta có thể thay đổi độ
phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của
các thành phần dung môi trong hỗn hợp.
 Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi
trong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giải
gradient hoặc chương trình hóa dung môi.
19


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Sắc ký pha thuận

Các chất không
phân cực sẽ được
rửa giải sớm.
Thứ tự rửa giải sẽ
chậm
dần
theo
chiều tăng của độ
phân cực

Pha tĩnh phân cực
hơn pha động.
Pha động: không
phân cực (hỗn hợp
pentan,
hexan,
heptan, isootan)

20


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Phổ biến nhất

Sắc ký pha đảo

Pha động phân
cực hơn pha tĩnh.
Pha tĩnh: không
phân cực (C18, C8,
C6H5). Pha động:
phân
cực
(H20,
MeOH, acetonitril).

Thứ tự rửa giải:
chất phân cực ra
trước, các chất ít
và không phân cực
ra sau.

21

3. Các kỹ thuật HPLC
Một số chú ý

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký pha đảo
 Để điều chỉnh độ phân cực của pha động
có thể hòa lẫn thêm những dung môi như
methanol,
ethanol
(EtOH),
acetonitril,
dioxan,
tetrahydrofuran
(THF)
và
dimethylformamid.
 Một số thành phần khác cũng có thể được
thêm vào pha động như: các acid, base, đệm
, chất diện hoạt.
22


3. Các kỹ thuật HPLC
Một số chú ý

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký pha đảo
 Khi pha động có thêm các

muối vô cơ hoặc các chất
hoạt động bề mặt, nên lọc
nó trước khi dùng vì có thể
có cặn không tan trong
nước gây bẩn cột.
 Việc đuổi khí rất quan
trọng với pha động pha đảo
23


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký cặp ion (IPC)
Cơ sở: sự tạo thành cặp từ ion cần phân tích mang điện
và tác nhân tạo cặp mang điện trái dấu (đối ion).
Xn- +Qn+ = [XQ]hc
Thực chất là HPLC pha đảo.
Dung môi: phải đảm bảo thuốc thử tạo cặp ion đã tan
hết trong pha động để tránh kết tủa trong hệ thống.
Đối ion: thường là các amin bậc 4 hoặc các muối
sulfonat. Cần phải điều chỉnh pH của pha động với đệm
tới giá trị thích hợp. Đồng thời phải kiểm tra độ tan của
đệm trong dung môi trước khi bơm qua hệ sắc ký.
Cột: C2, C8, và C18....
24


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (LSC)

 Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ

biến.
 Chất cần phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất

hấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
 Pha tĩnh có thể là silicagel, nhôm oxyd ...
 Pha động thường là những dung môi ít hoặc không

phân cực. Khi rửa giải, các chất không phân cực sẽ ra
trước, các chất càng phân cực càng ra chậm.
25