Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới

1 of 128.

Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của
virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới
Vũ Thị Thanh Nhàn
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học
Luận văn ThS Chuyên ngành:Sinh học thực nghiệm; Mã số: CH.0900917
Người hướng dẫn: PGS. TS Đinh Duy Kháng
Năm bảo vệ:
Abstract: Tổng quan về virus cúm, vaccine phòng chống cúm và hệ thống
biểu hiện Baculovirus. Nghiên cứu về vật liệu vector tách dòng, vector biểu
hiện trong tế bào côn trùng, hóa chất và sinh phẩm. Trình bày phương pháp
nghiên cứu: tách chiết RNA tổng số, kiểm tra RNA bằng quang phổ kế,
tổng hợp cDNA, nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR, điện di
trên gel agarose, tách dòng gen, biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli, ...
Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết RNA tổng số; thiết kế hộp
gen M1 của virus cúm A/H1N1; tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1;
tinh sạch các plasmid tái tổ hợp; thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang
hộp gen M1.
Keywords: Sinh học thực nghiệm; Virut; Virus H1N1; Vaccine
Content
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bệnh cúm A/ H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm
A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, và một số quốc
gia khác. Ban đầu chỉ thấy nhiễm trên lợn nhưng sau đó phát hiện loại virus này còn
nhiễm trên nhiều đối tượng động vật khác.
Các vaccine truyền thống tuy đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngăn ngừa
và chống dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt động biến đổi của virus
A/H1N1 trong tế bào vật chủ đã gây ra những hạn chế về tính hiệu quả của vaccine. Do
vậy vấn đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chóng tạo ra
vaccine thế hệ mới nhằm đối phó với những hiểm họa cho cộng đồng trong tương lai.

VLPs (Virus like particles) vaccine là một trong những hướng đi mới trong công nghệ sản
xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ưu việt so với vaccine thế hệ trước đây.
Từ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế vector

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van1thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 1


baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới”.
2 of 128.

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dạng RNA
thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao
gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C và nhóm Thogotovirus.
Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng
hình sợi, đường kính 80 – 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da. Hệ
gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng
biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2),
NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2. Mỗi phân đoạn RNA của virus
cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm,
được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc
ribonucleoprotein (RNP). Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase chịu
trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn
của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo dạng vòm tại

giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ
dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông
tin di truyền và có cấu trúc xoắn α bên trong vỏ virus. Bao bọc hạt virus là một lớp
vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein màng của virus,
đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus. Bề mặt ngoài của vỏ được
bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Virus cúm có hai loại protein kháng
nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là
haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có
protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion.
Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix).

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van2thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 2


3 of 128.

1.1.2. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
Phân
Kích
Polypeptide(s)
Chức năng
đoạn: thƣớc (nt)
(protein)
1
2341
PB2
Liên quan đến quá trình sao mã: gắn mũ.
2
2341
PB1

Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài.
3
2233
PA
Liên quan đến quá trình sao mã.
HA
Liên kết với thụ thể trên tế bào chủ; gây ngưng kết
4
1778
(Haemgglutinin)
hồng cầu.
Nucleoprotein bám vào RNA, là thành phần trong
5
1565
NP
phức hợp sao mã; vận chuyển ra vào nhân của
vRNA.
NA
Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng
6
1413
(Neuraminidase)
của virut.
M1 (Matrix
Protein nền; thành phần chính của virion và liên
protein)
quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virut.
7
1027
M2

Có vai trò là kênh ion
Protein không cấu trúc liên quan đến sự vận
NS1
chuyển của RNA, ức chế interferon.
8
890
Protein không cấu trúc; chức năng chưa được biết
NS2
rõ.
1.1.3. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H1N1 thuộc dạng kí sinh nội bào bắt buộc. Quá trình xâm nhiễm và
nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của
cơ thể nhiễm, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng trên bề mặt các tế bào.
Màng tế bào bị uốn dần vào trong, bao quanh hạt virus, đưa virus vào trong tế bào và tách
ra tạo thành các khoang ẩm bào. pH trong các endosome giảm dần do tế bào tích cực bơm
ion H+ vào môi trường thủy phân các chất. Hoạt tính của kênh ion M2 được gia tăng để
cho các ion tràn vào bên trong vi hạt, dẫn đến pH thấp. Do kết quả này, cầu nối HA - M1
bị nhiễu loạn, vi hạt mở ra và HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào. Các
ribonucleoprotein được phóng thích vào trong bào tương và được vận chuyển tới hân tế
bào. Tại đây phức hợp bị phá vỡ và sự tổng hợp RNA virus bắt đầu. Quá trình cởi vỏ bọc
hoàn tất chỉ trong vòng 20 – 30 phút kể từ khi virus gắn vào tế bào
Trong nhân tế bào, virus lợi dụng bộ máy tổng hợp của tế bào vật chủ để tổng hợp
nên mRNA từ RNA hệ gen virus. Các sợi mRNA được vận chuyển ra bào tương tham gia
vào quá trình tổng hợp các protein virus. Các protein mới được tổng hợp được đưa trở lại
kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van3thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 3


nhân tế bào tham gia vào quá trình tổng hợp các sợi RNA dương từ khuôn là sợi âm của
4 of 128.

hệ gen virus.
Từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNApolymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở
đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein
hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Các phân tử NA và HA của virus
sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy
Golgi. Khi đạt đủ nồng độ tại màng bào tương, các RNP và M1 kết tụ lại thành những vi
hạt của virus. Nhờ hoạt tính của neuraminidase các hạt virus này được phóng thích ra khỏi
tế bào và lại tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào khác theo chu trình tương tự.
1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
1. 1.4.1 Hemagglutinin (HA)
HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể trung
hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng
RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử
HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Ao, cấu
tạo gồm ba đơn phân. Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị HA1 và HA2 liên kết
với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng
nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị HA1.
Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào
chủ trong quá trình xâm nhiễm . Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần HA1 và
HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đối với chủng virus
thể độc lực cao, vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ
dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ
quan khác nhau trong cơ thể. Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy
hiểm tới tính mạng vật chủ.
Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng
chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H1, H2 và H3).
1.1.4. 2 Neurominidase (NA)
Men neuraminidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus. Nó có một đầu gồm
4 tiểu đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị nước gắn vào
bên trong màng virus. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van4thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 4


capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Dal. Các nghiên cứu phân tử gen
5 of 128.

NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của
polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay
đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng
vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột
biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài
vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp.
1.1.4.3 Matrix protein ( M1) của virus cúm
M1 là một loại protein nền bao quanh vRNP, liên kết vRNP với vỏ virus và kênh
ion ( Hiện nay đã biết được trình tự acidamine từ 91 đến 116 và từ 165 đến 252 thực hiện
chức năng này). M1 có trọng lượng khoảng 27.8 kDal. Đơn phân của M1 là các cấu trúc
hình que dài khoảng 60A0 Các nghiên cứu về protein M1 đã chỉ rằng M1 chứa hai cấu
trúc cơ bản là α – Helicase ( được đánh dấu từ H1 đến H9) và cấu trúc cặp tóc – loop
( được đánh dấu từ L1 đến L8). Theo tính chất hóa sinh M1 được phân chia thành hai
vùng acidamine tạo cấu trúc hình cầu. Vùng thứ nhất từ acidamine số 1 đến 164 và vùng
thứ hai từ acidamine 165 đến 252. Hai vùng này được nối với nhau bởi vùng nhạy cảm
với protease, do vậy trong quá trình tinh sạch và biểu hiện nếu có mặt của protease nó
thường bị loại bỏ.
Protein M1 không chỉ là thành phần cấu trúc của virion, mà nó còn thực hiện rất
nhiều chức năng trong chu trình sống của virus, đó là:


Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân, M1 là yếu

tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này. Sau khi virus đi vào endoxom dưới tác dụng của
pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virus và phức hợp M1 - vRNP
bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân. Ngược lại, khi các vRNP mới được
tạo thành trong nhân thì M1 và NS2 sẽ đi vào nhân và kết hợp với vRNP cùng được vận
chuyển ra khỏi nhân. Sự tương tác của M1 với vRNP đã được nghiên cứu khá rõ. Hai
vùng trong M1 bám vào RNA được xác định ở hai vùng độc lập: ngón tay kẽm (a zinc
finger motif, ở vị trí axit amin 148 tới 162) và một chuỗi axit amin KKLKR (ở vị trí axit
amin 101 tới 105).


Điều hòa sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi M1.



Tương tác với protein vỏ của virus HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi.



Huy động các thành phần của virus với vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi.

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van5thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 5



6 of 128.

M1 là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus phân tử

M1 liên kết với vRNP, màng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai
glicoprotein là HA, NA, một số phân tử M1 khác thì tạo thành một lớp dưới vỏ bọc của

virus. Liên kết của M1 với màng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kỵ
nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ.


Huy động các thành phần của tế bào chủ cho việc hoàn thiện nảy chồi và sự

giải phóng virus.


Tỷ lệ M1/NP của phân tử virus ảnh hướng đến hình thái của virion và sự lan

truyền của virus khi được giải phóng.
1.2 Vaccine phòng chống cúm
1.2.1 Đại cƣơng về vaccine
Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát
vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi. Đồng
thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch.
Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là
những khu đông dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H1N1 có thể tồn
tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh. Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ
biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A như:
 Amantadine và Rimantadine
 Leptomycine B
 Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir)
Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây
lan của dịch cúm. Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất
vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà
Lan, …. Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính
kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc. Việt Nam đang trong giai đoạn tập duyệt
sản xuất vaccine để phòng cúm H1N1. Các vắc-xin ngừa bệnh cúm mùa trước đây không

có hiệu quả đối với cúm A /H1N1 mới. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở
hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới.
1.2.2. Tổng quan về VLPs
Về mặt cấu tạo VLPs được gọi là hạt giả virus vì hình thái cấu trúc của nó tương tự
như một virus tự nhiên. Phía ngoài là lớp vỏ chứa thành phần chủ yếu là lớp kép
kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van6thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 6


photpholipid của tế bào vật chủ và các loại protein đặc trưng của từng chủng virus. Tuy
7 of 128.

vậy bên trong của VLPs lại

không có lõi chứa vật liệu di truyền.

Về phần kỹ thuật, VLPs là phương pháp cloning trình tự DNA của các siêu vi để
tạo protein tái tổ hợp làm kháng nguyên cho vaccine. Điểm đặc biệt là các protein kháng
nguyên này có hình dạng và kích thước giống một virus nhưng không có DNA/RNA của
virus. Các ưu điểm của VLPs vaccine bao gồm:
 Độ an toàn rất cao
 Khả năng tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt
 Sản xuất nhanh để đáp ứng khi dịch bệnh bộc phát.
 Giá sản xuất thấp và khả thi ở Việt Nam. .
Để khai triển ứng dụng kết quả nghiên cứu vaccine VLP - H1N1, trước hết biểu hiện
3 loại protein tương ứng của gen NA, HA, M1 của virus H1N1, sau đó VLPs được tạo ra
bằng việc tổ hợp của ba loại protein, đồng thời cần thiết lập những thử nghiệm lâm sàng
để minh chứng độ an toàn và hữu hiệu trong cộng đồng
1.3 Hệ thống biểu hiện Baculovirus
Baculovirus là nhóm virus kí sinh ở hơn 600 loài côn trùng khác nhau. Cái tên
Baculovirus bắt nguồn từ chữ baculum trong tiếng Latinh - có nghĩa là hình que, mô tả

hình dạng của virus. Khi những côn trùng bị nhiễm độc baculovirus sẽ gây biến tính cấu
trúc keo, đặc biệt đối với các polyhedrin protein. Trong môi trường sống của virus,
polyhedrin protein có chức năng bảo vệ virus khỏi tia cực tím.
Tế bào côn trùng có thể thực hiện nhiều sửa đổi hợp lý đối với các hoạt động sinh
học của các protein phức tạp như quá trình đường hóa, sự hình thành mối liên kết disulfua,
và sự photphoryl hóa.
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Chủng virus cúm A/H1N1 đã được bất hoạt trong dung dịch Trizol được lưu giữ tại
phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học.
2.2. Vật liệu
2.2.1 Vector tách dòng
Chúng tôi đã sử dụng vector pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ) để tách dòng gen M1 trong
tế bào E. coli chủng DH5α. .
kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van7thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 7


8 of 128.

2.2.2. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
Vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO được sử dụng để biểu hiện gen M1 trong tế bào
côn trùng. Vector có ưu điểm nổi bật là sử dụng promoter polyhedrin của virus đa nhân
(AcMNPV -Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) để biểu hiện
các gen mong muốn ở mức độ cao (Crawford, Miller, 1998).
2.2.3. Hóa chất và sinh phẩm
Sinh phẩm: Bộ Kit tách dòng – TA cloning Kit (Invitrogen, Kit tinh sạch plasmid –
S.N.A.P.TM (Invitrogen), Kit thôi gel – S.N.A.P free UV (Invitrogen), Kit tinh sạch sản
phẩm PCR (Fermentas, Đức).
Hóa chất dùng cho nghiên cứu được cung cấp từ các hãng BioRad, Invitrogen,
New EnglDNA Biolabs, Sigma (Mỹ), Fermentas, Merck (Đức): cao nấm men, trypton,

agar, Amp, X- gal, EDTA, MgCl2, SDS 10%, ethanol, NaCl, SolI, Sol II, Sol III.
Các enzym giới hạn BamH I và Hind III (New EnglDNA Biolabs, Mỹ), T4 DNA
ligase (Invitrogen, Mỹ).
2.2.4. Trang thiết bị:
Lò vi sóng (Samsung), Máy lắc ổn nhiệt 37°C (Multitron-Đức), Máy khuấy từ
(Rotolab,Osi), Máy ly tâm (microcentrifuge-sorvall,Mỹ), Tủ lạnh sâu (Sanyo), Máy
khuấy trộn vortex (rotolab,osi), Máy soi ảnh gel (BIO-RAD), Cân phân tích (mettle
toledo) , Tủ cấy vô trùng (Sanyo), Nồi khử trùng (Nhật Bản), Máy ly tâm lạnh (sorvall
biofuge fresco) , Bộ điện đi DNA, Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100,
applied biosystems-Mỹ), Máy PCR (MJ Research-Mỹ); pipettman các loại (gilson).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Tách chiết RNA tổng số
2.3.2 Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế.
2.3.3 Tổng hợp cDNA
2.3.4. Nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR
2.3.5. Điện di trên gel agarose
2.3.6 Tách dòng gen
2.3.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli
2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
2.3.9. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
2.3.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van8thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 8


9 of 128.

Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh nhiễm RNase từ

môi trường ngoài vào mẫu vì RNA trong nghiên cứu sinh học đòi hỏi phải có độ tinh sạch
cao (không lẫn protein, DNA). Để đo nồng độ và độ tinh sạch RNA cần dùng cho việc tạo
cDNA chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ kế xác đinh độ hấp phụ tại bước sóng
260nm (A260). Kết quả trình bày tại bảng dưới:

A260

Công thức tính

Tỷ lệ A260/A280

Nồng độ RNA

0,13 x 40 x 20

1,87

104 μg/ml

(độ pha loãng 20 X)
0,13

Ở bảng trên cho thấy, ước tính có 104 ng trong 1 µl dung dịch RNA đã tách chiết.
RNA có độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1.
RNA tổng số tinh sạch được sử dụng để tạo cDNA sử dụng bộ kit tổng hợp
cDNA của Invitrogen (Mỹ). Nguồn cDNA thu được sau đó được sử dụng làm khuôn để
khuếch đại gen mã hóa protein M1 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
M1pBac-F và M1pBac-R.
Để gen M1 có thể biểu hiện tốt trong tế bào côn trùng chúng tôi đưa thêm trình tự

Kozak, trình tự đóng vai trò quan trọng trong việc khởi đầu quá trình dịch mã ở sinh vật
nhân chuẩn (Kozak, 1987) vào đầu 5’ của gen ngay trước mã mở đầu ATG của mồi xuôi.
Sản phẩm PCR (hộp gen M1) được kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.1). Kết quả cho
thấy có một băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 780 bp tương đương với kích
thước gen M1 có gắn thêm các trình tự thiết yếu theo tính toán lý thuyết. Như vậy có thể
sơ bộ kết luận hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 đã được khuếch đại đặc hiệu.
kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van9thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 9


1

10 of 128.

2

2

750 bp

~780 bp

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen M1 trên gel agarose 1%.
1: thang DNA 1kb chuẩn (fermentas, Đức)
2: sản phẩm PCR
3.3. Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Trước khi đưa vào vector biểu hiện baculovirus, sản phẩm PCR của gen M1 được
tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức), sau đó được đưa vào vector tách dòng
pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ). Việc tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản
phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 sau đó biến nạp vào E.coli rồi tách chiết lại
plasmid để chọn lọc vector tái tổ hợp. Các vector chứa gen M1 được kí hiệu là pCRM1.

3.3.1. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Quá trình gắn dựa vào đặc tính xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn DNA của
enzym T4 DNA ligase. Chúng tôi sử dụng enzym T4 DNA ligase có nguồn gốc từ phage
T4 xâm nhiễm E.coli. Mẫu được ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đây là nhiệt độ thích hợp nhất
cho enzym T4 DNA ligase hoạt động. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với
sản phẩm PCR mang gen mã hóa protein M1.
3.3.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
Plasmid tái tổ hợp thu được từ phản ứng gắn trên được biến nạp vào tế bào E.coli
chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, thể biến nạp được cấy trải
trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp, IPTG, và X-gal. Sau đó nuôi trong tủ ấm 370C
qua đêm. Kết quả thu được hai loại khuẩn lạc có màu xanh, trắng (hình 3.2).

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van10thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10


11 of 128.

Hình 3.2: Kết quả biến nạp DNA plasmid vào DH5α
3.3.3. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli
Để chọn được dòng plasmid tái tổ hợp pCRM1 mang hộp gen M1, chúng tôi nhặt
một số khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh, nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung
kháng sinh Amp (100µg/ml), lắc tốc độ 200v/p ở 37°C qua đêm. Tách chiết plasmid từ
các tế bào nuôi cấy, sau đó tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1% kèm theo đối
chứng là plasmid gốc. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
1

2

3

4

5

Hình 3.3: Chọn lọc các dòng plasmid pCR2.1 tái tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di
trên gel agarose 1%.
Đường chạy từ 1-4: DNA plasmid tách từ khuẩn lạc trắng
Đường chạy 5:

DNA plasmid tách từ khuẩn lạc xanh

Quan sát kết quả điện di trên cho thấy có sự chênh lệch về kích thước giữa
plasmid tách từ khuẩn lạc xanh và plasmid tách từ khuẩn lạc trắng. Các plasmid từ 1 đến

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van11thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 11


4 được tách từ khuẩn lạc trắng đều có đường chạy cao hơn plasmid số 5 được tách từ
12 of 128.

khuẩn lạc xanh. Điều đó chứng tỏ các dòng plasmid từ 1-4 có khả năng mang hộp gen M1.
Để khẳng định các plasmid được tách từ khuẩn lạc trắng có mang hộp gen hay
không chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn.
3.3.4. Chọn lọc vector tái tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn
Để khẳng định chắc chắn các dòng DNA plasmid có mang hộp gen M1, chúng
tôi tiến hành cắt kiểm tra các DNA plasmid này bằng enzym giới hạn BamH I và Hind III.
Hai enzym này được gắn tương ứng ở đầu 5’ và 3’ của gen. Ba dòng plasmid có kích
thước lớn hơn plasmid gốc được chọn để phân tích tiếp bằng phản ứng cắt với hai enzym
giới hạn BamH I và Hind III . Sau đó kiểm tra điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4).
1

2

3

4

M

3000bp

780bp

750bp

Hình 3.4: Kiểm tra các dòng vector tái tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trên gel
agarose 1%.
1: Sản phẩm PCR gen M1 (dùng làm đối chứng)
2 – 4 : 3 dòng DNA plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng enzym giới hạn
BamH I và Hind III.
M : Marker DNA
Kết quả phân tích sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp cho thấy ở đường chạy số 3,
4 xuất hiện băng có kích thước khoảng 780bp tương đương với kích thước của gen M1.
Đường chạy số 2 chỉ xuất hiện băng DNA plasmid mở vòng, có khả năng plasmid này
không mang sản phẩm PCR hoặc do trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamH I và
Hind III ở sản phẩm PCR đã bị biến đổi khiến cho enzym không thể nhận biết để cắt. Từ

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van12thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 12

kết quả trên, chúng tôi có thể kết luận sơ bộ đã thu được 2 dòng plasmid tái tổ hợp mang
13 of 128.

hộp gen M1. Tuy nhiên để khẳng định cần có các phân tích tiếp theo.
3.4. Tinh sạch các plasmid tái tổ hợp
Để khẳng định chính xác những plasmid tái tổ hợp mang hộp gen M1, chúng tôi
tiến hành giải trình tự plasmid đó. Hai trong số 3 dòng plasmid mang sản phẩm PCR được
tinh sạch lại bằng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit (Invitrogen). Kết quả tinh sạch
được kiểm tra bằng điện di DNA trên gel agarose 1% (hình 3.5) và đo quang phổ kế ở
bước sóng 260-280nm. Kết quả đo OD260-280 (không nêu ở đây)

1
2

Hình 3.5: Kết quả kiểm tra tinh sạch DNA plasmid trên gel agarose1%.
1,2: 2 dòng plasmid tái tổ hợp số sau tinh sạch.
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy, plasmid tái tổ hợp có độ tinh
sạch cao, có thể sử dụng cho mục đích giải trình tự gen.
3.5. Kết quả xác đinh trình tự
Bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của Applied
Biosystems được sử dụng để xác định trình tự DNA. Qúa trình giải trình tự được thực
hiện trên máy giải trình tự tự động ABI3100 (Applied Biosystems). Sau khi giải trình,
trình tự gen mã hóa protein M1 của virus H1N1 được phân tích bằng phần mềm PC – Gen
(hình 3.6).
ID M1-PCR

PRELIMINARY; DNA; 775 BP.

SQ SEQUENCE 775 BP; 223 A; 174 C; 210 G; 168 T;
GGATCCGGTC ATGGGTCTTC TAACCGAGGT CGAAACGTAC

GTTCTCTCTA TCATCCCGTC
AGGCCCCCTC AAAGCCGAGA TCGCGCAGAA ACTTGAAGAT
GTCTTTGCAG GAAAGAACAC

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van13thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 13


CGATCTCGAG GCTCTCATGG AATGGCTAAA GACAAGACCA
14 of 128.

ATCCTGTCAC CTCTGACTAA
AGGGATTTTG GGATTTGTAT TCACGCTCAC CGTGCCCAGT
GAGCGAGGAC TGCAGCGTAG
ACGCTTTGTC CAGAACGCCC TAAATGGAAA TGGAGATCCA
AATAATATGG ATAGGGCAGT
TAAGCTATAT AAGAAGCTGA AAAGAGAAAT AACATTCCAT
GGGGCTAAGG AGGTCGCACT
CAGCTACTCA ACCGGTGCAC TTGCCAGTTG CATGGGTCTC
ATATACAACA GGATGGGAAC
GGTGACTACG GAAGTGGCTT TTGGCCTAGT GTGTGCCACT
TGTGAGCAGA TTGCAGATTC
ACAGCATCGG TCTCACAGAC AGATGGCAAC TATCACCAAC
CCACTAATCA GACATGAGAA
CAGAATGGTG CTGGCCAGCA CTACAGCTAA GGCCATGGAG
CAGATGGCGG GATCAAGTGA
GCAGGCAGCG GAAGCCATGG AGATTGCTAA TCAGGCTAGG
CAGATGGTGC AGGCAATGAG
GACAATTGGG ACTCATCCTA ACTCTAGTGC TGGTCTGAGA
GATAATCTTC TTGAAAATTT
GCAGGCCTAC CAGAAACGAA TGGGAGTGCA GATGCAGCGA

TTCAAGTGAA AGCTT

Hình 3.6: Trình tự hộp gen M1có thêm các yếu tố cần thiết.
Ở hình 3.6 thể hiện trình tự hộp gen mã hóa protein M1có gắn các trình tự cần
thiết (trình tự kozak, mã khởi đầu – trình tự in đậm) cho sự biều hiện của gen M1 trong tế
bào côn trùng được đưa vào trong quá trình thiết kế mồi và phản ứng PCR.
Phân tích tiếp bằng phần mềm tìm kiếm BLAST và Fasta3 chúng tôi khẳng định
chắc chắn đoạn gen được tách dòng chính là gen M1 của virus cúm A/H1N1. So sánh
trình tự đoạn gen M1 phân lập từ virus cúm ở Việt Nam với trình tự đã công bố trong
ngân hàng dữ liệu gen quốc tế cho thấy, trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên M1 của

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van14thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 14


virut cúm phân lập ở Việt Nam có độ tương đồng cao so với các chủng lưu hành trên thế
15 of 128.

giới, đạt từ 99,5 -100%.
3.6. Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1
3.6.1. Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-HisTOPO
Vector pCRM1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO được xử lý bằng 2 enzym
giới hạn BamH I và Hind III. Sản phẩm cắt được điện di phân tách trên gel agarose 1%.
Cắt lấy phần gel mang hộp gen M1 và vector mở vòng, tinh sạch lại nhờ kit thôi gel của
Fermentas (Đức) sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy,
hai đoạn DNA này đã được tinh sạch thành công, thể hiện bởi một băng DNA có kích
thước khoảng 775 bp (hộp gen M1) và một băng có kích thước khoảng 5000 bp (vector
pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vòng) ở các đường chạy tương ứng (hình 3.9).
1

2

3

5000bp

755bp

775bp

Hình 3.9: Kiểm tra gen M1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đã được xử lý bằng
BamH I và Hind III sau tinh sạch trên gel agarose 1%.
1: thang DNA chuẩn 1kb (fermentas)
2: gen M1
3: vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO.
3.6.2. Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1
Chúng tôi tiến hành ghép nối đoạn gen M1 với vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO
mở vòng thu được ở trên nhờ ezyme T4 DNA ligase. Sản phẩm lai được biến nạp vào tế

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van15thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 15


bào E.coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiệt. Các thể biến nạp sau đó được cấy
16 of 128.

trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Ampicilin 100 µg/ml.
Chọn ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy để tách plasmid và kiểm tra sự có
mặt của hộp gen M1 bằng điện di trên gel agarose và xử lý với 2 enzym giới hạn BamH I
và Hind III. Kết quả (hình 3.10A) cho thấy cả 6 plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn hơn
plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc không mang gen ngoại lai khi cắt bằng BamH I
và Hind III cho ra hai đoạn DNA có kích thước khoảng 5000 bp và 755 bp tương ứng với

kích thước của plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc và hộp gen M1 (hình 3.10B). Như
vậy có thể khẳng định chúng tôi đã thiết kế thành công vector baculovirus mang hộp gen
M1 của virus cúm A/H1N1. Các plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp
gen M1 kí hiệu là pBluBacM1.
Tuy nhiên để biết gen đó được gắn đúng chiều hay không 3 dòng plasmid
pBluBacM1 được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi “lai” với mồi xuôi PFSP-F bám vào
vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO và mồi ngược M1pBac-R bám vào hộp gen M1. Bằng
cặp mồi này với plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen M1 gắn
đúng chiều sẽ cho sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước theo tính toán khoảng 900bp
(780bp của gen M1 và 120bp của vector).
1

2

3

4

5

6

8

7

9

10 11 12 13 14 15 16 17

5000bp
900bp

775bp

A

B

Hình 3.10: Điện di plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp kiểm tra khả năng mang
gen M1.
A: Đường chạy 1-6 plasmid tách từ đĩa biến nạp sản phẩm lai gen M1 và plasmid
pBluBac4.5/V5-His-TOPO.
Đường chạy 7 plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc không mang gen.

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van16thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 16


B: ĐC 8-13 plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp được cắt bằng enzym
17 of 128.

BamH Ivà Hind III.
Đường chạy 14 thang DNA chuẩn 1kb.
Đường chạy 15-17 sản phẩm PCR nhân đoạn gen M1 từ plasmid pBluBacM1
clone 1, 3, 6 bằng cặp mồi PFSP-F và M1pBac-R.
Kết quả điện di (đường chạy 15-17) cho thấy cả 3 dòng plasmid này đều mang hôp
gen M1 gắn đúng chiều. Các plasmid này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo
để tạo vaccine VLP virus cúm A/H1N1.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN

1. Đã thiết kế được hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 mang đầy đủ các thành phần
cần thiết cho sự biểu hiện của gen trong hệ thống tế bào côn trùng bao gồm trình tự
Kozak, mã khởi đầu và mã kết thúc.
2. Đã tạo dòng và xác đinh trình tự hộp gen mã hóa protein M1 của virus cúm
A/H1N1.
3. Đã phân tích được trình tự đoạn gen mã hóa protein M1 phục vụ công tác nghiên
cứu về protein M1. Qua đó kết luận trình tự gen mã hóa protein M1 đã tạo dòng có
độ tương đồng cao (99,5% đến 100%) với các trình tự đã công bố.
4. Thiết kế thành công vector biểu hiện baculovirus (pBluBac4.5/V5-His-TOPO)
mang hộp gen M1.
KIẾN NGHỊ
Được tiếp tục hướng nghiên cứu của đề tài để tiến tới phát triển được vaccine VLP
cúm A/H1N1 ở Việt Nam.

References
tiếng việt:
[1].

Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội

[2].

Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải,
Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình.(2008). Vấn đề dịch tễ học,
tiến hóa, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên – miễn dịch – vaccine.
Tạp chí công nghệ sinh học 6(4).tr 529 – 560.

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van17thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 17

[3].
18 of 128.

Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Vă Hải, Trương Nam Hải,
Lê Trần Bình (2004). Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động
vật sang người. Tạp chí công nghệ sinh học, 2(1):1-

[4].

Văn Thị Như Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phước Hải,
Trương Văn Dung, Trương Nam Hải, Biểu hiện gen HA5-1 mã hóa tiểu phần
kháng nguyên Hemagglutinin (HA) của virus cúm A/H5N1 trong Escherichia coli.
Tạp chí công nghệ sinh học, 2007; 5(3): 313-320

[5].

Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.

[6].

Tô Long Thành (2004). Bệnh cúm gia cầm ở người và vấn đề phòng chống. Tạp
chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XI, số 3, trang 76-83.

[7].

Phạm Văn Ty (2005). Virus học. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

tiếng anh:
[8].

RNAon R, Ben-Yedidia T (2009) Preclinical efficacy of a virus-like particle-based
vaccine against avian influenza H5N1. Future Microbiol 4:503-5.

[9]. Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology DNA potential drug targets. Infect
Disord Drug Targets 7(4): 282-93. Review.
[10]. Bosch F. X., M.. Orlich, H. D. Klenk, R. Rott (1979), “The structure of the
hemagglutinin, a determinant for the pathogencity of influenza viruses”, Virolory,
95, pp 197-207.
[11]. Bosch FX, Garten W, Klenk HD, Rott R (1981) Proteolytic cleavage of influenza
virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1
DNA HA2 determines proteolytic cleavability DNA pathogenicity of avian
influenza viruses. Virology 113: 725-735.

[12]. Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Atmad A (2007) Influenza viruslike particles elicit broader immuno responses than whole virion inactivated
influenza virus or recombinant hemagglutinin. Vaccine 25: 3871-3878.
[13]. Chackerian B (2007) Virus-like particles: flexible platforms for vaccine
development. Expert Rev. Vaccines 6 (3): 381-390.
[14]. Crawford AM, Miller LK (1998) Characterization of an early gene accelerating
expression of late genes of the baculovirus Autographa carlifornia nuclear
polyherosis virus. J Virology 62: 2773-2781.

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van18thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 18


[15]. De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza. J Clin Virol 41(1): 1-6. Review
19 of 128.

[16]. Eric Ka – wai Hui, Subrata Barman, Domimic Ho – Ping Tang, Bryan FRNAce
DNA Debi P. Nayak, YRKL sequence of Influenza virus M1 funtion as the domain
motif DNA interracts with VPS28 DNA CDc42.

[17]. Fedson DS (2005) Preparing for pDNAemic vaccination: an international policy
agenda for vaccine development. J Public Health Policy 26: 4-29.
[18]. Galarza JM, Latham T, Cupo A (2005) Virus-like particle (VLP) vaccine conferred
complete protection against a lethal influenza virus challenge. Viral Immunol 18:
244-251.
[19]. Grgacic EV, DNAerson DA (2006) Virus-like particles: passport to immune
recognition. Methods 40:60-5.
[20]. Joel R. Haynes , Leslie Dokken , James A. Wiley , DNArew G. Cawthon , John
Bigger, Allen G. Harmsen, Charles Richardson (2009) Influenza-pseudotyped Gag
virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic
avian influenza challenge. Vaccines 27: 530-541.
[20]. J. S. Malik Peiris, Menno D. de Jong, DNA Yi Guan( 2007), Avian Influenza Virus:
a Threat to Human Health, p. 243-267, Vol. 20, No. 2
[21]. Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW (2009) Influenza virus-like
particles as pDNAemic vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 333:269-89.
[22]. Kozak M. (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate
messenger RNAs. Nucleic Acids Res 15:8125–8148.
[23]. Neirynck S, Deroo T, Saelens X, VanlDNAschoot P, Jou WM, Fiers W. (1999) A
universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein.
Nat. Med. 5 (10): 1157-1163.

[24]. Nicholson KG (2009) Influenza DNA vaccine development: a continued battle.
Expert Rev. Vaccines 8: 373-374.
[24]. M.Uiprasertkul et al, Apoptosis DNA Pathogensis of Avian Influenza A (H5N1)
Virus in Humans, Emerging Infectious Diseases, 13 (5):708-712 (2007).
[25]. Murphy B.P, Webster R.G ( 1996), Orthhomyxoviruses, In Flields BN, Knipe DM,
Howley, fields virology, 3rd ed, Lippincott- Raven Publisher, Philadenphia, PA,pp
1397 - 1445

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van19thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 19

[26]. Peter pushko, Terrence M. Tumpey, Fang Bu, John knell, Robin Robinson, Gale
20 of 128.

Smith (2005) Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, DNA M1
proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c
mice. Vaccines 23: 5751-5759.
[27]. Qiao C, Tian G, Jiang Y, Li Y, Shi J, Yu K, Chen H (2006) Vaccines developed for
H5 highly pathogenic avian influenza in China. Ann N Y Acad Sci 1081: 182-192.
[28]. Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB
(2006) Evolution DNA adaptation of H5N1 influenza virus in avian DNA human
hots Indonesia DNA Vietnam. Virology 350: 68-258.
[29]. Song JM, Hossain J, Yoo DG, Lipatov AS, Davis CT, Quan FS, Chen LM, Hogan
RJ, Donis RO, Compans RW, Kang SM (2010) Protective immunity against H5N1
influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles. Virology
405:165-75.
[30]. Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease. Emerg Infect Dis 4: 436-441
[31]. Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm-Breschkin JL,
Zambon M, Hayden FG. Evaluation of neuraminidase enzyme assays using
different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to
neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility
network. J Clin Microbiol 2003; 41: 742-750
[32]. Wiley, D. C., I. A. Wilson, DNA J. J. Skehel. 1981. Structural identification of the
antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin DNA their
involvement in antigenic variation. Nature 289:373-378.

kho tai lieu -123doc-doc-luan an - luan an tien si -luan van20thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 20