LUẬN văn sư PHẠM SINH THỰC HIỆN TIÊU bản HIỂN VI cố ĐỊNH NHIỄM sắc THỂ KHỔNG lồ của RUỒI GIẤM BẰNG xử lý sốc NHƯỢC TRƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN SƯ PHẠM SINH HỌC

THỰC HIỆN TIÊU BẢN HIỂN VI CỐ ĐỊNH
NHIỄM SẮC THỂ KHỔNG LỒ
CỦA RUỒI GIẤM (Drosophila sp.)
BẰNG XỬ LÝ SỐC NHƯỢC TRƯƠNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

ThS. GVC. VÕ THỊ THANH PHƯƠNG

VÕ THỊ THANH QUYÊN
Lớp: Sư Phạm Sinh K33
MSSV: 3072285

NĂM 2011


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Quý thầy cô thuộc Bộ môn Sư phạm Sinh, Khoa Sư phạm, trường Đại học

Cần Thơ, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong
những năm học tại trường Đại học Cần Thơ.
Đặc biệt em xin bài tỏ lòng biết ơn của mình đến cô Võ Thị Thanh Phương,
người đã hướng dẫn trực tiếp, dành hết tâm huyết tận tình chỉ dạy, dẫn dắt em trong
suốt thời gian hoàn thành luận văn này.
Chú Trương Văn Mục, thầy Nguyễn Trọng Hồng Phúc, quý thầy cô tổ Sinh
lý động vật đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp Sư phạm Sinh học K33, các bạn cùng làm luận
văn trong tổ Động vật - Thực vật, tổ Sinh lý động vật và tổ Phương pháp giảng dạy
đã động viên, giúp đỡ, mang lại niềm vui cho em trong suốt thời gian học tập tại
trường và trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng con xin chân thành cảm ơn Ba và Mẹ, người đã chịu nhiều vất vả,
tạo điều kiện tốt nhất cho con học tập và đạt được kết quả như ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn!

Võ Thị Thanh Quyên

Ngành Sư phạm Sinh học

i

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Đề tài “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ của

ruồi giấm (Drosophila sp.) bằng xử lý sốc nhược trương” được tiến hành từ tháng
10 năm 2010 đến vào tháng 4 năm 2011. Mục tiêu của đề tài là: i) Tìm quy trình
thực hiện tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm (Drosophila
sp.), ii) Thực hiện 25 tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ của ruồi giấm
(Drosophila sp.).
Thí nghiệm được thực hiện trên tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm
(Drosophila sp.) ở giai đoạn dòi III. Mẫu vật, sau khi tách khỏi cơ thể, được xử lý
sốc nhược trương bằng dung dịch muối NaCl 0,5%. Acetocarmin 1% được sử dụng
với vai trò vừa là chất cố định và vừa là chất nhuộm nhiễm sắc thể. Các tiêu bản
hiển vi tạm thời được chuyển thành tiêu bản hiển vi cố định qua các giai đoạn phân
hóa màu, khử nước, làm trong mẫu và dán mẫu bằng Baume Canada.
Kết quả đề tài: chúng tôi đã xác định được quy trình thực hiện tiêu bản hiển
vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm (Drosophila sp.) và thực hiện được
25 tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm (Drosophila sp.) với
mẫu bắt màu đẹp, độ tương phản cao, tế bào không bị teo, quan sát rõ hình thái của
nhiễm sắc thể.

Ngành Sư phạm Sinh học

ii

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .........................................................................1

1.

Đặt vấn đề.........................................................................................1

2.

Mục tiêu của đề tài............................................................................1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................3
1.

Vị trí phân loại của Drosophila sp.....................................................3

2.

Đặc điểm hình thái............................................................................3

3.

Đặc điểm sinh học.............................................................................4

4.

5.

6.

3.1.

Phương thức sinh sản.................................................................4

3.2.

Chu trình sống của Drosophila sp. .............................................4

Quá trình phát triển ...........................................................................6
4.1.

Thời kỳ phát triển phôi thai........................................................6

4.2.

Thời kỳ phát triển hậu phôi........................................................7

Nhiễm sắc thể ...................................................................................9
5.1.

Hình thái và các loại nhiễm sắc thể ............................................9

5.2.

Kích thước và số lượng nhiễm sắc thể........................................9

5.3.

Hiện tượng đa bội và dị bội......................................................10

5.4.

Nhiễm sắc thể khổng lồ............................................................ 10

Nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ.................................................14
6.1.

Đối tượng thí nghiệm............................................................... 14

6.2.

Sốc nhược trương ....................................................................15

6.3.

Cố định mẫu ............................................................................15

6.4.

Nhuộm mẫu .............................................................................17

6.5.

Khử nước.................................................................................18

6.6.

Dán mẫu ..................................................................................18

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN ............................ 20
1.

Phương tiện và hóa chất..................................................................20

Ngành Sư phạm Sinh học

iii

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

2.

Trường Đại học Cần Thơ

1.1.

Phương tiện .............................................................................20

1.2.

Hóa chất ..................................................................................21

Phương pháp nghiên cứu.................................................................21
2.1.

Đối tượng thí nghiệm............................................................... 21

2.2.

Nuôi ruồi giấm.........................................................................21

2.3.

Chuẩn bị ấu trùng ....................................................................22

2.4.

Sốc nhược trương ....................................................................22

2.5.

Cố định và nhuộm mẫu ............................................................ 25

2.6.

Quy trình thực hiện tiêu bản cố định ........................................25

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................31
1.

2.

Kết quả ...........................................................................................31
1.1.

Quy trình thực hiện ..................................................................31

1.2.

Số lượng tiêu bản.....................................................................31

1.3.

Chất lượng tiêu bản..................................................................31

Thảo luận........................................................................................33
2.1.

Chọn môi trường nuôi ruồi giấm (Drosophila sp.) ...................33

2.2.

Cách thu mẫu...........................................................................33

2.3.

Tách tuyến nước bọt của ấu trùng và xử lý mẫu .......................34

2.4.

Cố định và nhuộm mẫu ............................................................ 36

2.5.

Đậy mẫu ..................................................................................38

2.6.

Chuyển sang tiêu bản cố định ..................................................39

2.7.

Hình thái của nhiễm sắc thể .....................................................40

CHƯƠNG V KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...................................................44
1.

Kết luận ..........................................................................................44

2.

Đề nghị ...........................................................................................44

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………45

Ngành Sư phạm Sinh học

iv

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Số lượng nhiễm sắc thể ở một số loài............................................10
Bảng 2: Tên phương tiện ...........................................................................20
Bảng 3: Tên hóa chất .................................................................................21

Bảng 4: Quy trình thực hiện tiêu bản .........................................................25
Bảng 5: Nghiệm thức nồng độ và thời gian sốc nhược trương....................36
Bảng 6: Nghiệm thức thời gian và nhiệt độ nhuộm mẫu............................. 38

Ngành Sư phạm Sinh học

v

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Ruồi giấm (Drosophila sp.).............................................................3
Hình 2: Chu trình sống của Drosophila sp. ..................................................6
Hình 3: Cấu tạo cơ thể dòi III ......................................................................7
Hình 4: Nhiễm sắc thể của ruồi giấm Drosophila sp. .................................12
Hình 5: Sơ đồ sự nhân lên và hình thành của nhiễm sắc thể khổng lồ.........13
Hình 6: Cấu trúc đĩa và vùng búp hóa của nhiễm sắc thể khổng lồ.............14
Hình 7: Môi trường nuôi ruồi giấm ............................................................ 22
Hình 8: Quá trình tách lấy tuyến nước bọt .................................................23
Hình 9: Đôi tuyến nước bọt nằm hai bên ống ruột (X40) ...........................24
Hình 10: Đôi tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm (X40) .......................24
Hình 11: Sốc nhược trương trong dung dịch NaCl 0,5% ............................ 25
Hình 12: Nhuộm mẫu ................................................................................27
Hình 13: Thao tác đậy mẫu ........................................................................28
Hình 14: Tách lame và lammelle ............................................................... 28

Hình 15: Các lọ cồn dùng trong quá trình khử nước...................................29
Hình 16: Làm trong mẫu............................................................................29
Hình 17: Tuyến nước bọt (X100)............................................................... 32
Hình 18: Các tế bào của tuyến nước bọt (X600).........................................32
Hình 19: Hình dạng của nhiễm sắc thể khổng lồ (X1.000) .........................33
Hình 21: Ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.) ở giai đoạn dòi III ..............34
Hình 22: Nhiễm sắc thể của ruồi giấm (Drosophila sp.) được xử lý trong
nước cất (X100) ...................................................................................................34
Hình 23: Mẫu tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương (X100).........35
Hình 24: Cấu trúc nhiễm sắc thể của ruồi giấm Drosophila sp. (X1.000)...41
Hình 25: Cấu trúc đĩa của nhiễm sắc thể (X1.000) .....................................42
Hình 26: Hiện tượng búp hóa (X1.000)......................................................42

Ngành Sư phạm Sinh học

vi

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 27: Hai nhiễm sắc thể tương đồng không tiếp hợp (X1.000)..............43

Ngành Sư phạm Sinh học

vii

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU
1. Đặt vấn đề
Ruồi giấm (Drosophila sp.) là đối tượng kinh điển của các nghiên cứu trong
di truyền học và là sinh vật mà bộ gen được biết đến với nhiều gen được xác định.
Với các đặc điểm sinh sản nhanh, vòng đời ngắn, nên ruồi giấm là đối tượng được
lựa chọn khá nhiều trong nghiên cứu di truyền. Hơn nữa, với bộ nhiễm sắc thể có
số lượng khá ít 2n = 8 nên thuận lợi cho việc quan sát. Các tế bào tuyến nước bọt
của ấu trùng ruồi giấm có chứa các nhiễm sắc thể khổng lồ đa sợi, được tạo thành
do hiện tượng nội nguyên phân (endomitosis), các nhiễm sắc thể tự nhân đôi liên
tiếp 10 lần nhưng tế bào không phân chia và hầu như ở trạng thái mở xoắn. Vì vậy
chúng có thể chứa tới 210 = 1024 sợi chromatid dính nhau trong một bó, với chiều
dài hơn 100 lần so với các nhiễm sắc thể bình thường, đây là điểm thuận lợi cho
việc xác định các phần cụ thể của các nhiễm sắc thể.
Những kiến thức di truyền trong chương trình sinh học 12, cao đẳng, đại học
liên quan rất nhiều đến đối tượng ruồi giấm như: di truyền liên kết hoàn toàn, di
truyền liên kết không hoàn toàn, di truyền liên kết với giới tính. Đặc biệt trong
chương trình thực hành đã đề cập đến nhiễm sắc thể khổng lồ ở tuyến nước bọt của
ấu trùng ruồi giấm. Tuy nhiên, ở các trường phổ thông cũng như trường cao đẳng,
đại học hiện đang thiếu các tiêu bản quan sát bộ nhiễm sắc thể của ruồi giấm, nên
chưa thể minh họa sinh động cho các bài giảng nhằm giúp học sinh, sinh viên có
thể quan sát rõ về nhiễm sắc thể khổng lồ ở đối tượng này. Đáp ứng được những

yêu cầu thực tế trên cần thiết phải có một nghiên cứu về việc thực hiện tiêu bản cố
định, do đó mà đề tài: “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng
lồ của ruồi giấm (Drosophila sp.) bằng xử lý sốc nhược trương” được thực hiện
với mục đích phục vụ cho công tác dạy và học.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ
của ruồi giấm (Drosophila sp.).

Ngành Sư phạm Sinh học

1

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Thực hiện 25 mẫu tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi
giấm (Drosophila sp.) với yêu cầu: mẫu bắt màu đẹp, độ tương phản cao, tế bào
không bị teo, quan sát rõ hình thái nhiễm sắc thể.

Ngành Sư phạm Sinh học

2

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1. Vị trí phân loại của Drosophila sp.


Ngành: Arthropoda (Chân khớp)



Phân ngành: Tracheata (Có ống khí)



Lớp: Insecta (Sâu bọ, côn trùng)



Phân lớp: Ectognatha (Sâu bọ hàm lộ)



Bộ: Diptera (Hai cánh)



Họ: Drosophilidae (Ruồi giấm)



Giống: Drosophila



Loài: Drosophila sp.

♀

♂

Hình 1: Ruồi giấm (Drosophila sp.)
( />
2. Đặc điểm hình thái
Ruồi giấm (Drosophila sp.) trưởng thành thường gọi là ruồi quả hay ruồi
trái cây. Ruồi giấm thường xuất hiện ở những nơi có các rau quả chín, thối hay
nước rau bị chua. Chúng ta có thể dễ dàng tìm thấy chúng ở góc bếp, thùng rác,
những nơi ẩm thấp có quả thối. Kích thước của Drosophila sp. phụ thuộc vào đặc
điểm thức ăn và một số điều kiện ngoại cảnh khác, chiều dài trung bình của ruồi
trưởng thành khoảng 2 - 3mm. Con đực thường có kích thước nhỏ hơn con cái.
Ngành Sư phạm Sinh học

3

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Drosophila sp. được bao phủ bởi bộ xương ngoài bằng kitin, cơ thể phân đốt
dị hình, với 3 nhóm đốt khác nhau hình thành nên 3 phần của cơ thể là: đầu, ngực
và bụng.
Bộ phận đầu do 5 - 6 đốt phía trước cơ thể hợp lại, có dạng tròn, 2 bên đỉnh
đầu có 2 mắt kép, ở khu vực trán có 3 mắt đơn. Phía trên đỉnh đầu mọc ra 2 râu
đầu.
Bộ phận ngực do 3 đốt thân tạo thành, có 3 đôi chân ngực và 1 đôi cánh.
Bộ phận bụng gồm 8 đốt, không có chân, có mang lỗ thở, cuối bụng hình
thành bộ phận sinh dục ngoài (Demerec và Kaufmann, 1996).
3. Đặc điểm sinh học
3.1. Phương thức sinh sản
Ruồi giấm (Drosophila sp.) sinh sản hữu tính, đẻ trứng. Chúng đẻ nhiều lứa
trong đời, có thể thu được 25 – 30 thế hệ mỗi năm. Con cái đẻ trứng trực tiếp trên
môi trường dinh dưỡng sau này của ấu trùng (trái cây mục nát). Ở 250C, một con
ruồi cái có thể đẻ lên đến 3.000 trứng trong suốt đời sống, trong đó 95% có thể nở.
Ở ruồi đực lưỡng bội trưởng thành có một đôi tinh hoàn. Tinh trùng sau khi
được hình thành được giữ ở ruồi đực cho đến lúc phóng vào âm đạo của ruồi cái, từ
đó tinh trùng di chuyển vào các cơ quan nhận tinh của ruồi cái (một cặp ống nhận
tinh vào một túi nhận tinh cong về phía bụng).
Ở ruồi cái trưởng thành có một đôi buồng trứng, mỗi buồng trứng gồm hàng
chục ống trứng. Trứng được hình thành từ các nguyên bào trứng, qua các lần
nguyên phân và giảm phân. Tế bào trứng càng ngày càng phát triển, nó chuyển
theo vòi trứng vào ống dẫn trứng và sau đó vào tử cung. Tinh trùng đang nằm trong
cơ quan nhận tinh, tiến vào và thụ tinh trứng. Trong thân của ruồi cái có giữ hàng
trăm tinh trùng (thông thường chỉ có một tinh trùng xâm nhập vào tế bào trứng) bởi
vậy một lần giao phối có thể sinh hàng trăm con (Ân và cộng sự, 1978).

3.2. Chu trình sống của Drosophila sp.
Drosophila sp. là côn trùng mà chu trình sống của chúng trải qua 4 giai
đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và giai đoạn ruồi trưởng thành.

Ngành Sư phạm Sinh học

4

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Ruồi cái sau khi giao phối với con đực, trứng được thụ tinh sẽ phát triển bên
trong cơ thể ruồi mẹ.
Ở 25 0C, trứng sau khi được đẻ ra sau khoảng một ngày sẽ nở thành ấu trùng.
Thời gian phát triển ở giai đoạn ấu trùng là khoảng 4 ngày. Sau hai lần lột xác, ấu
trùng già trở thành nhộng. Chừng qua bốn ngày sau khi nhộng thoát ra khỏi vỏ, nó
thành ruồi non hay thành trùng. Như vậy qua một chu trình sống của mình, ruồi
giấm trải qua biến thái hoàn toàn. Mặc dù thông thường sự giao phối xảy ra trong
thời gian những ngày đầu sau khi ruồi nở nhưng trứng thường được đẻ ra vào ngày
hôm sau cho nên thời gian của một lứa vào khoảng độ mười ngày. Theo nhà di
truyền học người Mỹ T.H. Morgan, ruồi đực và cái giao phối với nhau 12 giờ sau
khi trưởng thành. Những con ruồi trưởng thành có thể sống tới mười tuần lễ. Trong
khoảng thời gian này, một con ruồi cái có thể đẻ đến vài nghìn trứng (Ân và cộng
sự, 1978).
Thời gian hoàn thành chu trình sống của Drosophila sp. phụ thuộc chặt chẽ
vào nhiệt độ, thời tiết và thức ăn của môi trường. Ở nhiệt độ 250C tính từ khi trứng

được sinh ra cho đến khi hình thành dạng trưởng thành khoảng 10 ngày. Ở 20 0C
thời gian này tăng lên, cả chu trình sống là khoảng 13 ngày, còn ở 150C là 90 ngày.
Theo T.H. Morgan, thời gian để có một thế hệ ruồi cần 10 – 15 ngày ở 200C. Sự
thay đổi thời gian ở các giai đoạn trong chu trình sống đã dẫn đến sự thay đổi thời
gian cả chu trình. Ở 200C chiều dài trung bình của giai đoạn trứng - ấu trùng
khoảng 8 ngày, ở 250C là 5 ngày. Giai đoạn nhộng ở 200C là 6,3 ngày, trong khi ở
250C là 4,2 ngày. Nhiệt độ thích hợp nuôi Drosophila sp. trong phòng thí nghiệm
là từ 200C đến 25 0C. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều không thích hợp.

Ngành Sư phạm Sinh học

5

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 2: Chu trình sống của Drosophila sp.
( />
4. Quá trình phát triển
Quá trình phát triển cá thể của Drosophila sp. trải qua 2 giai đoạn: phát triển
phôi (tiến hành trong trứng), phát triển hậu phôi (từ khi trứng nở cho đến giai đoạn
trưởng thành).
4.1. Thời kỳ phát triển phôi thai
Trứng Drosophila sp. có hình bầu dục, dài khoảng 0,5mm (Demerec và
Kaufmann, 1996). Trứng là một tế bào lớn, bao gồm nguyên sinh chất, nhân và
noãn hoàng. Trứng được bao bọc ngoài cùng bởi vỏ trứng. Vỏ trứng có chức năng

bảo vệ cho mầm phôi bên trong, chống thấm nước nhưng không cản trở hoạt động
trao đổi khí của tế bào trứng. Từ phần trước của trứng Drosophila sp. mọc lên một
cặp mấu dài (còn gọi là sợi), cặp mấu này bảo vệ trứng khỏi chìm vào môi trường
dinh dưỡng. Ở cực phía trên của trứng có một lỗ nhỏ gọi là lổ thụ tinh (lổ noãn), là
lối cho tinh trùng xâm nhập vào trứng để thụ tinh.

Ngành Sư phạm Sinh học

6

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

4.2. Thời kỳ phát triển hậu phôi
Thời kỳ phát triển hậu phôi ở Drosophila sp. là thời kỳ diễn ra hiện tượng
biến thái hoàn toàn với việc trải qua các giai đoạn: ấu trùng, nhộng, trưởng thành.
4.2.1. Giai đoạn ấu trùng
Sau khi hoàn thành giai đoạn phát dục phôi thai, ấu trùng phá vỡ vỏ trứng
chui ra ngoài, đó là hiện tượng trứng nở (Nguyễn Thị Thu Cúc, 2000). Ấu trùng
của ruồi thường được gọi là dòi.
Dòi không có chân, cơ thể phân đốt màu trắng. Dòi gần như trong suốt và có
thể nhìn thấy các cơ quan bên trong như ruột cuộn.
Sau khi nở ra từ trứng, dòi trải qua hai lần lột xác sinh trưởng. Về mặt cấu
tạo hình thái không thay đổi, dòi chỉ gia tăng về kích thước. Do đó, giai đoạn dòi
có thể chia thành ba giai đoạn nhỏ hơn là: dòi I, dòi II và dòi III. Sau mỗi lần lột
xác dòi lớn thêm 1 tuổi. Ở giai đoạn dòi III, chiều dài của dòi khoảng 4,5 mm. Về

mặt giải phẩu, chúng ta có thể nhìn thấy tuyến nước bọt, hạch não và tuyến sinh
dục. (Demerec và Kaufmann, 1996).

Tuyến nước bọt

Hạch não

Tuyến sinh dục

Tỷ lệ

Hạch
Tuyến
nước bọt

Mỡ

não Ống
khí

Dạ

Buồng Ruột

dày

trứng

Hình 3: Cấu tạo cơ thể dòi III

A- nhìn từ mặt bên

B- nhìn từ mặt lưng của dòi cái

( />Ngành Sư phạm Sinh học

7

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

4.2.2. Giai đoạn nhộng
Để bước vào giai đoạn nhộng, dòi III di chuyển đến vùng khô ráo và hóa
nhộng. Nhộng của Drosophila sp. thuộc loại nhộng bọc. Nhộng bọc cũng chính là
nhộng trần nhưng được bọc trong một lớp vỏ cứng, lớp vỏ này còn được gọi là kén
giả.
Khi vừa biến thái từ dòi sang nhộng, cơ thể nhộng có màu trắng. Đây chính
là giai đoạn tiền nhộng. Sau đó trong suốt quá trình phát triển, lớp vỏ nhộng sẫm
màu dần và trở nên cứng hơn.
Trong lúc này, chúng nằm yên, không cử động, không dinh dưỡng. Chức
năng sinh học quan trọng của pha nhộng là làm tiêu biến cấu tạo và cơ quan của
dòi, đồng thời hình thành các cấu tạo và cơ quan của con trưởng thành.
Mô của ấu trùng (dòi) được chia nhỏ (ngoại trừ não bộ và một vài mô khác).
Cơ thể dòi có chứa các tế bào đĩa mầm (đĩa imaginal). Các tế bào đĩa mầm phát
triển để hình thành các cấu trúc của cơ thể trưởng thành như đầu, chân, cánh, ngực
và bộ phận sinh dục.

Khi nhộng đã phát triển đầy đủ, các con nhộng sẵn sàng biến thái bước vào
giai đoạn trưởng thành. Hiện tượng nhộng biến thái thành con trưởng thành có
cánh và biết bay được gọi là vũ hóa (Demerec và Kaufmann, 1996).
4.2.3. Giai đoạn trưởng thành
Khi vừa mới vũ hóa, các con ruồi giấm (Drosophila sp.) có màu nhạt hơn
bình thường. Lúc đầu, cánh của chúng không mở rộng được. Sau khoảng một giờ,
chúng mới có thể nâng cánh được. Màu sắc cơ thể bắt đầu tối dần lại. Sau khoảng 6
giờ hóa thành dạng trưởng thành, con đực và cái có thể giao phối với nhau.
Ruồi đực phân biệt với ruồi cái bằng gai giao cấu ở chân trước, ở đuôi về
phía lưng có một dải đen rộng, tròn (con cái có một loạt vạch).

Ngành Sư phạm Sinh học

8

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

5. Nhiễm sắc thể
Nhiễm sắc thể được phát hiện rất sớm nhờ nghiên cứu hiện tượng phân bào
có tơ. Từ năm 1883, Roux đã đưa ra ý kiến là nhiễm sắc thể tham gia vào hiện
tượng di truyền và đến năm 1887, Weisman đã đề xuất học thuyết nhiễm sắc thể về
di truyền.
Nhiễm sắc thể là cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, có khả năng tái sinh, bắt
màu thuốc nhuộm kiềm tính, tập trung lại thành sợi ngắn, có kích thước và hình
dạng đặc trưng (Lê Đình Trung, 2000).

5.1. Hình thái và các loại nhiễm sắc thể
Nhiễm sắc thể có hình dạng và kích thước đặc trưng ở kỳ giữa khi mà các
nhiễm sắc thể ở trạng thái kết xoắn, co ngắn và phân bố trên mặt phẳng xích đạo
(Phan Cự Nhân, 2004). Lúc đó, nhiễm sắc thể gồm hai nhiễm sắc tử chị em dính
nhau ở tâm động, chia nó thành hai cánh. Căn cứ vào vị trí tâm động, người ta phân
biệt 3 kiểu hình thái:
Nhiễm sắc thể tâm cân, hình chữ V, có 2 cánh bằng nhau.
Nhiễm sắc thể tâm lệch, 1 cánh ngắn, 1 cánh dài.
Nhiễm sắc thể tâm mút, một cánh hết sức ngắn.
5.2. Kích thước và số lượng nhiễm sắc thể
Nhiễm sắc thể của tế bào nhân chuẩn quan sát được ở kỳ giữa của quá trình
nguyên phân thường có dạng hình chấm hoặc hình que và thường có kích thước
vào khoảng 0,2 – 3 µm đường kính và 0,2 – 50 µm chiều dài. Ví dụ nhiễm sắc thể
bé nhất ở người là nhiễm sắc thể 21 và 22 có kích thước L = 1,5 µm; còn chiếc lớn
nhất là nhiễm sắc thể số 1 có L = 10 µm.
Ở các tế bào sinh dưỡng, bộ nhiễm sắc thể tồn tại thành từng cặp tương
đồng (trong đó một chiếc có nguồn gốc từ bố và một chiếc có nguồn gốc từ mẹ).
Tập hợp tất cả các nhiễm sắc thể trong 1 tế bào sinh dưỡng của loài được gọi là bộ
nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n). Trong các tế bào và cơ thể đơn bội, ví dụ như các tế
bào giao tử thì bộ nhiễm sắc thể có số lượng chỉ còn một nửa số nhiễm sắc thể
trong tế bào lưỡng bội của loài, được gọi là bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n).

Ngành Sư phạm Sinh học

9

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 1: Số lượng nhiễm sắc thể ở một số loài

Loài

Số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào 2n

Ngô (Zea mays mays)

20

Đậu Hà lan (Pisum sativum)

14

Ruồi giấm (Drosophila sp.)

8

Người (Homo sapiens sapiens)

46

5.3. Hiện tượng đa bội và dị bội
Đa bội là hiện tượng khi số lượng nhiễm sắc thể trong bộ tăng lên theo bội
số của n xuất phát (3n, 4n…), là hiện tượng thường xuyên quan sát thấy ở thực vật,
hiếm thấy ở động vật.
Đột biến dị bội là những thay đổi về số lượng nhiễm sắc thể xảy ra ở một

hay một số cặp nhiễm sắc thể tương đồng. Ví dụ: 2n – 2, 2n – 1, 2n + 1, 2n + 2...
Hiện tượng này thường xảy ra do sự sai lệch trong phân ly của các cặp nhiễm sắc
thể trong giảm phân hoặc nguyên phân (Phan Cự Nhân, 2004).
5.4. Nhiễm sắc thể khổng lồ
Một dạng đa bội hóa đặc biệt được gọi là dạng đa sợi hóa (politenisation) sẽ
dẫn tới tạo thành các nhiễm sắc thể đặc biệt là nhiễm sắc thể đa sợi (politene
chromosome) hay còn gọi là nhiễm sắc thể khổng lồ (giant chromosome), là do
nhiễm sắc thể được cấu tạo bởi rất nhiều sợi nhiễm sắc (có thể tới hàng nghìn sợi)
xếp song song sát nhau, có kích thước rất lớn và rất dài so với kích thước của
nhiễm sắc thể bình thường.
Nhiễm sắc thể khổng lồ lần đầu tiên được phát hiện vào cuối thế kỷ XIX
bởi nhà tế bào học người Italia là Balbiani vào năm 1881 ở muỗi (Chiromomus),
nhưng mãi đến những năm 30 của thế kỷ XX nhờ công trình nghiên cứu của
Painter, Bridges (Nguyễn Như Hiền, 2006) trên đối tượng ruồi giấm (Drosophila
melanogaster) thì cấu trúc và chức năng của nhiễm sắc thể khổng lồ mới được làm
sáng tỏ. Nhiễm sắc thể khổng lồ thường được quan sát thấy trong các tế bào tuyến
nước bọt của ấu trùng sâu bọ 2 cánh. Ở Drosophila melanogaster, vào giai đoạn ấu
Ngành Sư phạm Sinh học

10

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

trùng muộn (giai đoạn tuổi III) thì các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào tuyến nước
bọt có kích thước dài gấp hơn 100 lần (đạt 1.000 µm) so với nhiễm sắc thể ở kỳ

giữa bình thường (có độ dài khoảng 7.5 µm).
Ở muỗi (Chiromomus), nhiễm sắc thể khổng lồ trong tuyến nước bọt có
đường kính 20µm và chiều dài 270µm. Một đặc điểm nữa của cấu trúc nhiễm sắc
thể khổng lồ không chỉ thể hiện ở kích thước mà còn thể hiện ở sự tiếp hợp soma
(tức là tiếp hợp không qua giảm phân).
Đối với ruồi giấm, bộ nhiễm sắc thể 2n = 8 gồm 3 cặp tương đồng và 1 cặp
giới tính, ở con cái là XX và ở con đực là XY. Nhưng do hiện tượng tiếp hợp soma
nên trên tiêu bản nhiễm sắc thể khổng lồ có cấu tạo rất đặc biệt: gồm 1 dải ngắn và
5 dải dài tỏa ra từ 1 thể cố định gọi là tâm nhiễm sắc (chromocenter) chính là vùng
tâm động của các nhiễm sắc thể dính với nhau. Người ta phân biệt các dải này bằng
cách sau: dải ngắn nhất là nhiễm sắc thể thường số 4 là nhiễm sắc thể bé nhất, một
dải có chiều dài lớn hơn là nhiễm sắc thể X (đây là bộ nhiễm sắc thể của ruồi cái và
2 nhiễm sắc thể X tiếp hợp nhau nên trông thành 1), còn lại 4 dải dài nhất là 4 vế
của các nhiễm sắc thể thường số 2 và số 3. Nếu ta quan sát tiêu bản bộ nhiễm sắc
thể của ruồi đực ta sẽ thấy 1 nhiễm sắc thể X, còn nhiễm sắc thể Y rất khó phát
hiện vì chùng thường bắt màu kém và lẫn vào vùng tâm nhiễm sắc. Ngoài ra, còn
quan sát thấy trên nhiễm sắc thể có chỗ tạo nên hình vòng là vùng mà 2 nhiễm sắc
thể tương đồng không tiếp hợp, tách rời nhau. Người ta theo dõi được sự hình
thành các nhiễm sắc thể khổng lồ từ các tiền thân soma của chúng (Nguyễn Như
Hiền, 2006).

Ngành Sư phạm Sinh học

11

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Tâm động
Hình 4: Nhiễm sắc thể của ruồi giấm Drosophila sp.
( />
Ở quá trình nguyên phân bình thường, qua giai đoạn S của kỳ trung gian,
ADN được tái bản, các sợi nhiễm sắc trong nhiễm sắc thể đều được nhân đôi và
trong trường hợp bình thường ở các mô của cơ thể dẫn tới mỗi nhiễm sắc thể đều
được nhân đôi, nghĩa là mỗi nhiễm sắc thể đều gồm 2 nhiễm sắc tử chị em nghĩa là
mỗi nhiễm sắc thể đều gồm 2 nhiễm sắc tử chị em. Đến kỳ sau và kỳ cuối của phân
bào, các nhiễm sắc tử chị em sẽ phân ly về 2 tế bào con. Do đó, mỗi tế bào con có
bộ nhiễm sắc thể 2n đặc trưng (Nguyễn Như Hiền, 2006).
Trong các tế bào tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm, do 1 cơ chế nào đó,
ADN được tái bản rất nhiều lần và không phân ly dẫn tới tăng cao số lượng sợi
nhiễm sắc trong từng nhiễm sắc thể (tạo nên nhiễm sắc thể đa sợi), trong lúc đó số
lượng nhiễm sắc thể của bộ vẫn giữ nguyên (2n = 8). Số lượng sợi nhiễm sắc trong
mỗi nhiễm sắc thể đạt tới 1024 sợi (Winchester, 1958).

Ngành Sư phạm Sinh học

12

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

2 sợi nhiễm sắc

Nhân đôi lần 1

Nhân đôi lần 2

Nhân đôi lần 3

Hình 5: Sơ đồ sự nhân lên và hình thành của nhiễm sắc thể khổng lồ
(Winchester, 1958)

Một đặc điểm nữa trong cấu trúc của nhiễm sắc thể khổng lồ là cấu trúc dĩa.
Trên tiêu bản ta có thể quan sát thấy rõ là mỗi vế của thể nhiễm sắc đều có xen kẽ
các đĩa nhuộm màu sẫm được gọi là đĩa Balbiani (do ông Balbiani phát hiện). Ví
dụ, nhiễm sắc thể X có đến 1.000 đĩa và người ta đã tính được tất cả các nhiễm sắc
thể có thể đến 5.000 – 6.000 đĩa. Khi nghiên cứu kỹ cấu trúc siêu vi và phân tử
cũng như chức năng của nhiễm sắc thể đa sợi, người ta nhận thấy các đĩa thể hiện
trạng thái hoạt động khác nhau của các họ gen trong hệ gen (genome). Trên nhiễm
sắc thể, các vùng nhuộm màu đậm được gọi là chất dị nhiễm sắc
(heterochromatine), phân biệt với phần còn lại nhuộm màu nhạt là chất nguyên
nhiễm sắc (euchromatine) (hình 6). Chất nguyên nhiễm sắc là chất nhiễm sắc ở
trạng thái dãn xoắn, còn chất dị nhiễm sắc là biểu hiện dạng cuộn xoắn cao. ADN
của chất nguyên nhiễm sắc ở trạng thái hoạt động, còn ở chất dị nhiễm sắc thì ADN
không phiên mã và thường được sao chép muộn hơn (Phạm Thành Hổ, 2002)
Nhiễm sắc thể khổng lồ thay đổi về độ lớn và cấu trúc đĩa theo sự phát triển của ấu
trùng qua các giai đoạn. Khi ấu trùng chuyển từ giai đoạn II sang giai đoạn III, các
nhiễm sắc thể đa sợi không chỉ to ra, dài ra, đạt kích thước tối đa mà cấu trúc của
Ngành Sư phạm Sinh học

13

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

các đĩa cũng bị biến đổi. Các đĩa được mở rộng phình ra, người ta nói là chúng
được “búp” hóa. Nơi các đĩa được búp hóa là nơi ở đó các nhiễm sắc thể được mở
xoắn và các gen đang hoạt động, nghĩa là đang xảy ra sự phiên mã (tổng hợp ARN)
và dịch mã (tổng hợp protein) (Nguyễn Như Hiền, 2006).

Vùng búp hóa

Hình 6: Cấu trúc đĩa và vùng búp hóa của nhiễm sắc thể khổng lồ
( />
6. Nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ
6.1. Đối tượng thí nghiệm
Nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ có thể tiến hành trên nhiều đối tượng
khác nhau. Ruồi giấm cũng được chọn làm đối tượng thí nghiệm vì ruồi giấm là đối
tượng quen thuộc trong các nghiên cứu di truyền học. Ngoài ra còn có các đặc
điểm thuận lợi khác là:

Ngành Sư phạm Sinh học

14

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Dễ phá vỡ màng nhân để làm cho nhiễm sắc thể dễ dàng bung ra ngoài khi
làm tiêu bản ép.
- Nhiễm sắc thể có kích thước lớn, số lượng nhiễm sắc thể ít.
6.2. Sốc nhược trương
Sốc nhược trương là phương pháp nhằm làm cho các tế bào trương lên, phá
vỡ màng nhân và đồng thời giúp cho các nhiễm sắc thể phân tán, không chồng
chéo lên nhau thuận lợi cho quá trình quan sát. Vật mẫu được ngâm trong dung
dich muối nhược trương trong 1 khoảng thời gian nhất định. Vì đây là dung dịch
muối nhược trương nên nước từ môi trường ngoài sẽ đi vào trong tế vào, làm cho
các tế bào trương lên, phá vỡ màng nhân và vì vậy các nhiễm sắc thể sẽ bung ra, dễ
quan sát hơn.
Trong sốc nhược trương, các loại muối thường được sử dụng như: Citrat
natri, NaCl, KCl, CaCl2, hoặc có thể sử dụng hỗn hợp của nhiều muối như NaCl,
KCl và CaCl2 (Fankhauser, 2011).
6.3. Cố định mẫu
Cố định là nhằm giữ nguyên cấu trúc các mô cũng như cấu tạo tế bào bằng
cách làm chết tế bào thật nhanh trong dung dịch cố định, một loại hóa chất độc đối
với tế bào. Chất cố định khi ngấm vào tế bào sẽ làm đình chỉ mọi quá trình sống
xảy ra trong tế bào và không gây ra quá trình thuận nghịch (Trần Tú Ngà, 1982).
Ngoài ra, việc cố định mẫu còn nhằm mục đích sau:
- Ngăn chặn quá trình phá hủy do men, hay phá hủy trong các mô.
- Làm cho các mô cứng dễ nhuộn hơn.
Trong thành phần thuốc cố định nhân có thể có: axit acetic, axit cromic, axit
osmic, formalin, cồn, chlorofom… và tác dụng của chúng khi cố định như sau:
- Axit acetic là một chất lỏng không màu, có mùi khó chịu, dễ hòa tan trong
nước, trong cồn, trong ete… nó ngấm rất nhanh vào mẫu vật, có thể làm cho mẫu
vật bị trương lên, gây kết tủa đối với acid nucleic rất tốt.

Ngành Sư phạm Sinh học

15

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Cồn (Ethanol) là chất lỏng không màu, dễ bay hơi, vị nóng và có mùi thơm
đặc biệt, dễ bắt lửa, dễ trộn lẫn trong nước và nhiều dung môi hữu cơ khác. Cồn
thường được dùng trong các mục đích sau:
+ Dùng các độ cồn khác nhau để loại nước trong quá trình làm tiêu
bản cố định hoặc quá trình chuẩn bị để cắt lát mỏng bằng máy cắt.
+ Để cố định đồng thời ngâm giữ nguyên liệu thực vật trong thời gian
dài, người ta thường dùng cồn 700 - 900. Những nguyên liệu đã ngâm trong cồn thì
không thể dùng để quan sát thành phần của tế bào chất nhưng để nghiên cứu về cấu
tạo giải phẫu thì tốt hơn nhiều so với nguyên liệu tươi (dễ cắt, dễ nhuộm hơn, trong
các khoảng gian bào không còn bọt khí).
+ Ngoài ra, cồn còn dùng để pha dung dịch làm mềm, các dung dịch
cố định, hoặc để rửa vi mẫu sau khi nhuộm màu…
Có nhiều loại chất cố định mẫu vật trong nghiên cứu nhiễm sắc thể như
Carnoy, Navashin…Chất cố định Carnoy biến đổi thường được sử dụng trong
nghiên cứu tế bào và phôi, đặc biệt khi cần làm tiêu bản tạm thời. Thành phần của
thuốc cố định Carnoy biến đổi (3:1) là cồn và axit acetic. Thời gian cố định từ 2
đến 12 giờ. Ở nhiệt độ 0 - 30C vật có thể giữ lâu trong chất cố định này (Trần Tú
Ngà, 1982).

Ngoài ra, trong một số trường hợp, để cố định mẫu vật người ta còn sử dụng
ngay chính dung dịch thuốc nhuộm mẫu.
Nguyên tắc cố định mẫu vật:
Tính chính xác của kết quả nghiên cứu tiêu bản tế bào phụ thuộc rất nhiều
vào quá trình cố định mẫu. Muốn cố định mẫu vật phải thực hiện đúng những
nguyên tắc sau đây:
- Chất cố định phải chọn sao cho phù hợp với mục đích nghiên cứu.
- Dung lượng chất cố định phải lớn hơn hẳn dung lượng mẫu vật cần cố định
(thông thường phải gấp từ 20 đến 100 lần).
- Vật cố định phải còn tươi nguyên.

Ngành Sư phạm Sinh học

16

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 33 – 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Những mẫu vật có kích thước lớn, nên cắt thành những mẫu nhỏ khi cố
định, cắt bỏ những bộ phận không cần thiết để chất cố định có thể ngấm nhanh vào
mẫu vật.
- Thông thường thì chất cố định ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Riêng đối với
những mẫu vật dùng để nghiên cứu nhiễm sắc thể nên giữ ở nhiệt độ 4 0C trong
ngăn mát của tủ lạnh.
- Thời gian cố định phụ thuộc vào thể chất, vào độ lớn của mẫu vật cố định
cũng như vào loại dung dịch cố định. Đối với chất cố định là Carnoy thì thời gian

cố định là từ 2 đến 12 giờ, đối với những nguyên liệu cứng rắn thì thời gian cố định
có thể kéo dài lâu hơn khoảng 24 giờ.
- Sau khi cố định cần rửa sạch mẫu vật đã cố định bằng chất lỏng thích hợp.
Nếu dung dịch cố định pha trong nước thì dùng nước để rửa, nếu dùng dung dich
cố định pha trong cồn thì dùng cồn để rửa.
- Ghi nhãn với nội dung gồm có: số thứ tự mẫu cố định, ngày giờ cố định,
tên vật cố định, tên chất cố định…
- Trong thời gian cố định đôi khi phải thay chất cố định mới. Chẳng hạn như
sử dụng chất cố định Carnoy nếu trong thời gian cố định thấy dung dịch Carnoy
chuyển màu thì thay bằng dung dịch mới.
- Ghi vào sổ theo dõi thí nghiệm những gì đã ghi trên nhãn và ghi thêm mục
đích nghiên cứu.
6.4. Nhuộm mẫu
Có thể nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm bằng tiêu bản tạm
thời với thuốc nhuộm acetocarmine.
Carmine là một dạng nước chiết sắc tố từ những thể lipid trong con cái của
một loài côn trùng gọi là coccuscacbi. Carmine nhuộm nhân tế bào và nhiễm sắc
thể rất tốt, là một loại thuốc nhuộm không thể thiếu trong nghiên cứu nhanh tế bào
và phôi. Thông thường người ta sử dụng carmine trong dung dịch axit acetic 45%
(acetocarmine). Khi sử dụng thuốc nhuộm acetocarmine cần chú ý một số điểm
sau:

Ngành Sư phạm Sinh học

17

Bộ môn Sư phạm Sinh học