KHẢO sát KHẢ NĂNG SINH bào tử TRONG CHẾ PHẨM nấm metarhizium anisopliae SOROKIN TRÊN HAI nền cơ CHẤT gạo và tấm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.82 MB, 58 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
*******
HUỲNH HỮU ĐỨC
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ TRONG
CHẾ PHẨM NẤM Metarhizium anisopliae
SOROKIN TRÊN HAI NỀN CƠ CHẤT
GẠO VÀ TẤM
Luận văn tốt nghiệp
Ngành Bảo Vệ Thực Vật
Cần Thơ – 05/2010
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
*******
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ TRONG
CHẾ PHẨM NẤM Metarhizium anisopliae
SOROKIN TRÊN HAI NỀN CƠ CHẤT
GẠO VÀ TẤM
Cán bộ hướng dẫn:
Người thực hiện đề tài:
PGs Ts. Trần Văn Hai
Huỳnh Hữu Đức
MSSV: 3064930
Lớp: Bảo Vệ Thực Vật K32
TRƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SIN H HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
Luận văn tốt nghiệp kỹ sư
N gành: BẢO VỆ THỰC VẬ T
Tên đề tài:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ TRONG
CHẾ PHẨM NẤM Metarhizium anisopliae
SOROKIN TRÊN HAI NỀN
CƠ CHẤT GẠO VÀ TẤM
Giáo viên hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
PGs Ts. Trần Văn Hai
Huỳnh Hữu Đức
MSSV: 3064930
Lớp: Bảo Vệ Thực Vật K32
Cần Thơ, 2010
TRƯỜNG ĐẠ I HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật với đề tài:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ TRONG
CHẾ PHẨM NẤM Metarhizium anisopliae
SOROKIN TRÊN HAI NỀN
CƠ CHẤT GẠO VÀ TẤM
Do sinh viên Huỳnh Hữu Đức thực hiện
Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
Cán bộ hướng dẫn
PGs Ts. Trần Văn Hai
TRƯỜNG ĐẠ I HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SIN H HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư
Bảo Vệ Thực Vật với tên:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ TRONG
CHẾ PHẨM NẤM Metarhizium anisopliae
SOROKIN TRÊN HAI NỀN
CƠ CHẤT GẠO VÀ TẤM
Do sinh viên Huỳnh Hữu Đức thực hiện và bảo vệ trước hội đồng.
Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp: ...........................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá mức: ...............................................................
DUYỆT KHOA
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
Chủ tịch Hội đồng
HUỲNH HỮU ðỨC, 2010 : “Khảo sát khả năng sinh bào tử trong chế phẩm
nấm xanh Metarhizium anisopliae Sorokin trên hai nền cơ chất gạo và tấm”.
Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Trường ðại Học Cần Thơ.
TÓM LƯỢC
Thí nghiệm nhằm mục tiêu tìm môi trường cơ chất thích hợp cho việc sản
xuất chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae thu ñược lượng bào tử nhiều nhất
trong thời gian ngắn và khả năng duy trì mật số bào tử cao; khảo sát tỷ lệ nhiễm khi
sản xuất chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae cấp 2 từ chế phẩm nấm xanh
Metarhizium anisopliae cấp 1 nhằm hạ giá thành chế phẩm và rút ngắn thời gian
nuôi cấy. Qua thí nghiệm ñược kết quả sau:
Có thể dùng dung dịch chứa bào tử nấm Ma ñể sản xuất chế phẩm nấm
Ma với mật số ổn ñịnh là 109 bào tử/g chế phẩm. Nghiệm thức 9 NSKL thích hợp
nhất ñể sản xuất chế phẩm nấm Ma vì có tỷ lệ tạp nhiễm thấp nhất.
Ta có thể rút ngắn thời gian sản xuất chế phẩm từ 10 – 14 ngày khi
dùng môi trường SDAY3 lỏng ñể nuôi cấy so sử dụng môi trường SDAY3 ñặc.
Các nghiệm thức nước có thêm hàm lượng CaCO3 (5%) có tỷ lệ nhiễm
thấp nhưng số lượng bào tử tương ñương với các NT không thêm CaCO3 (5%).
Môi trường tấm và nước cho khả năng mọc nấm nhanh nhưng mật số
không cao và thời gian duy trì mật số bào tử không lâu.
Gạo và ½ gạo + ½ tấm là môi trường thích hợp ñể sản xuất chế phẩm
nấm Metarhizium anisopliae.
Sử dụng nấm Ma cấp 1 ñã phát triển ñược 8 ngày ñể cấy truyền sản xuất
chế phẩm nấm Ma cấp 2 có thể sử dụng ñược sau 10 ngày cấy truyền. Trong khi ñó,
nếu sử dụng nấm Ma cấp 1 ñã phát triển ñược 12 ngày ñể cấy truyền sản xuất chế
phẩm nấm Ma cấp 2 có thể sử dụng ñược sau 5 ngày cấy truyền.
i
MỤC LỤC
TÓM LƯỢC............................................................................................................. i
MỤC LỤC .............................................................................................................. ii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v
DANH SÁCH BẢNG............................................................................................. vi
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................. vii
MỞ ðẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 ............................................................................................................ 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................................ 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu, ñặc ñiểm phân loại và sự phân bố của nấm xanh
Metarhizium anisopliae Sorokin .............................................................................. 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu..................................................................................... 3
1.1.2. Phân loại .................................................................................................... 3
1.1.3. Sự phân bố ................................................................................................. 3
1.2. ðặc ñiểm hình thái và sinh học của nấm Metarhizium anisopliae ................... 4
1.2.1. ðặc ñiểm hình thái ..................................................................................... 4
1.2.2. ðặc ñiểm sinh lý – sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae ................... 5
1.2.2.1 Khả năng ñồng hóa các nguồn carbon, nitơ ............................................ 6
1.2.2.2 Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng ................................................... 7
1.2.2.3 Khả năng biến ñổi các cơ chất khác nhờ vào hệ thống enzym ................. 7
1.2.2.4 Khả năng sinh ñộc tố diệt côn trùng........................................................ 8
1.2.2.5 Cơ chế tác ñộng của nấm xanh Metarhizium anisopliae lên côn trùng .... 9
1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng và phát triển của nấm Metarhizium
anisopliae ................................................................................................................ 9
1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy ................................. 9
1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và ñộ ẩm ..............................................................10
1.3.3. Ảnh hưởng của ánh sáng ............................................................................10
1.3.4. Ảnh hưởng của ñộ thoáng khí ....................................................................11
1.3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước ................................................................11
ii
1.3.6. Ảnh hưởng của ñộ pH ................................................................................11
1.4. Tình hình sản suất chế phẩm Metarhizium anisopliae ....................................11
1.4.1. Trên thế giới .............................................................................................12
1.4.2. Tại Việt Nam ............................................................................................14
CHƯƠNG 2 ...........................................................................................................16
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................16
2.1. Phương tiện ...................................................................................................16
2.2. Phương pháp ..................................................................................................16
2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự hình thành và phát triển bào tử của nấm
Metarhizium anisopliae trong môi trường gạo khi nuôi cấy bằng dung dịch lỏng sau
khi lắc 3, 6 và 9 ngày..............................................................................................16
2.2.1.1 Chuẩn bị dung dịch có chứa bào tử nấm Ma ..........................................17
2.2.1.2. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................17
2.2.1.3. Chỉ tiêu ñánh giá ..................................................................................17
2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường gạo, tấm, và hàm lượng
nước có thêm CaCO3 (5%) lên sự hình thành và phát triển bào tử của nấm
Metarhizium anisopliae khi sản xuất chế phẩm.......................................................18
2.2.2.1. Chuẩn bị khuẩn ty nấm Ma ...................................................................18
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................18
2.2.2.3. Chỉ tiêu ñánh giá ..................................................................................19
2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ tạp nhiễm và mật số bào tử khi sử dụng chế
phẩm nấm Metarhizium anisopliae cấp 1 ñể cấy truyền tạo thành chế phẩm nấm
Metarhizium anisopliae cấp 2 .................................................................................19
2.2.3.1. Chuẩn bị chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae cấp 1 ....................... 19
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................19
2.2.3.3. Chỉ tiêu dánh giá ..................................................................................20
2.2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................20
CHƯƠNG 3 ...........................................................................................................21
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................21
Ghi nhận tổng quát .................................................................................................21
iii
3.1. Sự hình thành và phát triển bào tử của nấm Metarhizium anisopliae trong môi
trường gạo khi nuôi cấy bằng dung dịch lỏng sau khi lắc 3, 6 và 9 ngày. ................21
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường gạo, tấm, nước và dung dịch CaCO3
(5%) lên sự hình thành và phát triển bào tử của nấm Metarhizium anisopliae. ........25
3.3. Tỷ lệ tạp nhiễm và sự hình thành bào tử khi sử dụng chế phẩm nấm
Metarhizium anisopliae cấp 1 ñể cấy truyền tạo thành chế phẩm nấm Metarhizium
anisopliae cấp 2......................................................................................................30
CHƯƠNG 4 ...........................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ....................................................................................35
4.1. Kết luận ........................................................................................................35
4.2. ðề nghị .........................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................38
PHỤ CHƯƠNG
iv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Nội dung ñầy ñủ
BVTV
Bảo vệ thực vật
ðHCT
ðại học Cần Thơ
Ma
Metarhizium anisopliae
NN
Nông nghiệp
NSKC
Ngày sau khi cấy
NSKL
Ngày sau khi lắc
PTN
Phòng thí nghiệm
SDAY3
Sabouroud Dextrose Agar Yeast
SHƯD
Sinh học ứng dụng
v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng
2.1
Tên bảng
Mật số bào tử trong dung dịch ở ba thời ñiểm 3, 6, 9 ngày sau
khi lắc.
2.2
17
Mật số bào tử có trong chế phẩm nấm xanh Ma cấp 1 ba thời
ñiểm 6, 8, 12 ngày sau khi cấy.
3.1
Trang
19
So sánh số lượng bào tử của nấm xanh Ma trong cùng một
nghiệm thức qua các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện PTN, Bộ
môn BVTV, Khoa NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.2
21
So sánh số lượng bào tử của nấm xanh Ma giữa các nghiệm
thức qua các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện PTN, Bộ môn
BVTV, Khoa NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.3
23
So sánh số lượng bào tử của nấm xanh Ma trong cùng một
nghiệm thức qua các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện PTN, Bộ
môn BVTV, Khoa NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.4
26
So sánh số lượng bào tử của nấm Ma giữa các nghiệm thức qua
các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện PTN, Bộ môn BVTV, Khoa
NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.5
28
Tỷ lệ tạp nhiễm của chế phẩm nấm Ma cấp cấy truyền tạo thành
chế phẩm nấm Ma cấp 2 trong ñiều kiện PTN, Bộ môn BVTV,
Khoa NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.6
30
So sánh sự phát triển của chế phẩm nấm xanh Ma cấp 2 trong
cùng một nghiệm thức qua các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện
PTN, Bộ môn BVTV, Khoa NN & SHƯD, Trường ðHCT.
3.7
31
So sánh số lượng bào tử của nấm Ma giữa các nghiệm thức qua
các thời ñiểm nuôi cấy trong ñiều kiện PTN, Bộ môn BVTV, Khoa
NN & SHƯD, Trường ðHCT.
32
vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae.
3.1
Môi trường nuôi cấy gạo và tấm chuẩn bị thanh trùng.
35
3.2
Môi trường gạo và tấm sau khi thanh trùng.
35
3.3
Môi trường gạo và tấm sau khi thanh trùng.
35
3.4
Môi trường gạo sau khi thanh trùng.
35
3.5
Cấy nấm xanh Ma vào môi trường lỏng SDAY3.
35
3.6
Dung dịch chứa bào tử nấm xanh Ma sau 3 ngày nuôi cấy.
35
3.7
Dung dịch chứa bào tử nấm xanh Ma sau 6 ngày nuôi cấy.
35
3.8
Dung dịch chứa bào tử nấm xanh Ma sau 9 ngày nuôi cấy.
35
3.9
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 1 sau 6 ngày nuôi cấy.
36
3.10
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 1 sau 8 ngày nuôi cấy.
36
3.11
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 1 sau 12 ngày nuôi cấy.
36
3.12
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 2 bị tạp nhiễm sau 10 ngày nuôi cấy.
36
3.13
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 2 ở nghiệm thức Ma-8 sau 10 ngày.
36
3.14
Chế phẩm nấm xanh Ma cấy 2 ở nghiệm thức Ma-12 sau 10 ngày.
36
3.15
Số lượng bào tử của nấm Ma giữa các nghiệm thức qua các thời
ñiểm nuôi cấy. (phụ chương)
3.16
Số lượng bào tử của nấm Ma giữa các nghiệm thức qua các thời
ñiểm nuôi cấy. (phụ chương)
3.17
Số lượng bào tử của nấm Ma giữa các nghiệm thức qua các thời
ñiểm nuôi cấy. (phụ chương)
vii
4
MỞ ðẦU
Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp, khí hậu nhiệt ñới nóng và ẩm nên
thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng nhưng cũng rất thuận lợi cho sự phát sinh,
phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng. Do vậy việc sử dụng thuốc bảo
vệ thực vật ñể phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng, giữ vững an ninh
lương thực quốc gia vẫn là một biện pháp quan trọng và chủ yếu. Nền nông nghiệp
nước ta ñang ñi vào mức ñộ thâm canh cao, khai thác sử dụng ñất theo chiều sâu,
chạy theo năng suất và sản lượng của toàn xã hội, nên việc lạm dụng nhiều phân
bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học ñể ñạt ñược nâng xuất cao là không thể
tránh khỏi.
Nhưng việc sử dụng các biện pháp hóa học ñể phòng trừ sâu hại, dịch bệnh
liên tục trong suốt thời gian dài nhằm cải thiện năng suất không những làm tăng áp
lực của dịch hại lên các vụ mùa tiếp theo mà còn gây ra nhiều tác ñộng xấu lên hệ
sinh thái và sức khỏe con người. Chính vì vậy, việc , giảm chi phí trong sản xuất,
cải thiện năng suất, phẩm chất cây trồng, tăng lợi nhuận kinh tế luôn là nỗi trăn trở
của các nhà khoa học, nhà quản lý và cả nhà nông.
Trong những năm qua bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh
học Ứng dụng, Trường ðại học Cần Thơ ñã sản xuất và thử nghiệm 3 loại chế phẩm
sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae, Paecilomyces sp. và Beauveria bassiana
ñể phòng trị rầy nâu và các loài côn trùng gây hại khác. Và ñặc biệt là nghiên cứu
quy trình sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae Sorokin phù hợp với ñiều
kiện nông hộ ñưa vào phục vụ sản xuất nhằm xã hội hóa nông dân trong canh tác
lúa theo hướng bền vững thân thiện với môi trường. Vì vậy, ñề tài “Khảo sát khả
năng sinh bào tử trong chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae Sorokin
trên hai nền cơ chất gạo và tấm” nhằm tìm ra cơ chất thích hợp thu ñược lượng
bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn, khả năng duy trì mật số bào tử cao và giảm
giá thành sản phẩm.
1
ðề tài ñược thực hiện với nội dung chính như sau:
- Nghiên cứu môi trường thích hợp cho việc sản xuất chế phẩm nấm
xanh Metarhizium anisopliae thu ñược lượng bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn
và khả năng duy trì mật số bào tử cao.
- Khảo sát tỷ lệ tạp nhiễm và mật số bào tử khi sản xuất chế phẩm nấm
xanh Metarhizium anisopliae cấp 2 từ chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae
cấp 1 nhằm hạ giá thành chế phẩm và rút ngắn thời gian nuôi cấy.
2
CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử nghiên cứu, ñặc ñiểm phân loại và sự phân bố của nấm xanh
Metarhizium anisopliae Sorokin
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Năm 1709, sau những phát hiện ñầu tiên của Balisneri về nấm gây bệnh trên
côn trùng và cũng từ ñó ra ñời ngành khoa học nghiên cứu bệnh côn trùng.
(yoshinori, 1993)
Năm 1836, Augustino Bassi ñã ñề xuất dùng vi sinh vật làm tác nhân sinh
học trong việc quản lý côn trùng gây hại. Năm 1873, Le Conte ñưa ra ñề nghị
nghiên cứu bệnh côn trùng trong phòng trừ sâu hại (Bartlett M. C. và Jaronski S. T.,
ñược trích dẫn bởi Yasuhisa Kunumi, 2005).
Năm 1878, khi nghiên cứu về loài sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì Anisoplia
austriaca, nhà khoa học người Nga I. I. Metchnikov ñã phát phát hiện thấy một loài
nấm bào tử màu lục có thể gây chết hàng loạt loài sâu này. Ông xác ñịnh loài nấm
này có tên khoa học là Entomophthora anisopliae. Về sau, Sorokin kiểm tra lại và
thấy loài nấm này không thuộc giống Entomophthora mà thuộc về giống
Metarhizium (Nguyễn Lân Dũng, 1981, Trích dẫn bởi Lâm Tố Oanh, 2005).
1.1.2. Phân loại
Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G. C. Anisworth, 1966, 1970, 1971
(trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004) cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc
ngành phụ lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Metarhizium. Một giả thiết
khác cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm túi
Ascomycotina, lớp Plectomyces và giống Metarhizium.
1.1.3. Phân bố
Nấm Metarhizium anisopliae là nấm gây hại côn trùng, xuất hiện phổ biến
trong tự nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay ñược phân lập từ trong ñất.
3
Ở những nơi không có côn trùng, người ta cũng phân lập ñược nấm
Metarhizium anisopliae ngay cả trong ñiều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở
ðức) trên những khu ñất ở rừng sâu khi bị ñốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ
(chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa ñất ñầm lầy trồng những loại
cây ñước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có
thể phân lập ñược nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004).
1.2. ðặc ñiểm hình thái và sinh học của nấm Metarhizium anisopliae
1.2.1. ðặc ñiểm hình thái
Nấm Metarhizium anisopliae Sorok.: vì có màu lục hoặc xanh lục nên người
ta thường gọi là nấm lục cương.
Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang,
có ñường kính 3 – 4 µm (Trần Thị Thanh, 2004).
Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng ñến hồng, cuống
sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên ñám sợi nấm dày ñặc. Bào tử trần dạng hình que
có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám ñến ôliu – lục, bào tử xếp thành
chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường người ta có thể thấy bào tử ñược tạo ra
trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục. Sợi nấm khi phát
triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 – 4 µm, dày khoảng 20 µm, chia
thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Phạm Thị Thùy,
2004).
a
b
Hình 1.1 Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae.
a. Dạng bào tử hình ovale.
b. Dạng bào tử hình trụ.
(Nguồn: />isopliae&hl=en&hl=en&hr=&star=40&sa=N)
4
Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt ñậu, khuẩn
lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế, chúng phát triển
chậm trên môi trường không có pepton (ví dụ như môi trường PDA, Czapek –
Dox), thích hợp trên môi trường có pepton cụ thể trên môi trường Sabouraud, nấm
phát triển tốt trong ñiều kiện nhiệt ñộ 25oC sau 7 – 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc
có ñường kính 4 – 6 cm. Loài Metarhizium anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn,
dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var có kích thước bào tử 3,5 – 5,0 x 2,5 –
4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var. Major có kích thước bào tử
10,0 – 14,0 µm.
ðể phân biệt hai loài trên, tác giả Tsai và cộng sự (cs) ñã nghiên cứu ñặc tính
huyết thanh khác nhau của hai loài này và xác ñịnh rằng loài Metarhizium
anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng
Coleoptera. Nhiều nhà khoa học ñã nghiên cứu và tìm thấy có khoảng 204 loài côn
trùng thuộc họ Elateridae và Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium
anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004).
1.2.2. ðặc ñiểm sinh lý – sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae
Nấm Metarhizium anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất
không có kitin, chúng sống ñược ở nhiệt ñộ thấp 8oC, có biên ñộ về ñộ ẩm rộng, ở
nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày. Khi hoại sinh
trong ñất, bào tử ñính bị ức chế sự nảy mầm bởi khu hệ nấm ñất, trong ñó có chủng
Aeromonas.
Ở nhiệt ñộ dưới 10oC và trên 45 oC thì nấm thường không hình thành bào tử.
Nhiệt ñộ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 – 30oC và sẽ bị chết ở 49 –
55oC, nhiệt ñộ cho nấm phát triển tốt nhất là 25oC, pH thích hợp là 6,0 và có thể dao
ñộng trong khoảng 3,3 – 8,5. Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải
tinh bột, xenlulose và kitin (lông và da côn trùng) (Phạm Thị Thùy, 2004).
Nấm Metarhizium anisopliae có thể ñồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon
khác nhau. Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid.
5
Muốn tạo thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae ñòi hỏi phải có ẩm ñộ không
khí khá cao.
Sản phẩm trao ñổi chất có thể làm tê liệt ấu trùng của sâu loài Galleria,
Mellonela và Bombyx mori. Trong dịch nuôi cấy người ta ñã tách ñược dung dịch
toxin và xác ñịnh bản chất hóa học của chúng là peptid vòng destruxin A, B, C và D
(Phạm Thị Thùy, 2004).
1.2.2.1. Khả năng ñồng hóa các nguồn carbon, nitơ
Các công trình nghiên cứu của Hegendus và cs. ñã xác ñịnh môi trường tốt
nhất ñể phân lập nấm Metarhizium anisopliae là môi trường có chứa kitin làm
nguồn carbon.
ðể thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhu cầu
về nguồn thức ăn carbon khác nhau. Hegendus và cs., Dorta và cs. cho biết nấm
Metarhizium anisopliae khi nuôi cấy chìm, nếu bổ sung thêm kitin hoặc
hexosamines và glucose thì thu ñược lượng bào tử cao nhất. Theo các tác giả thì
nhu cầu không giống nhau về nguồn gốc thức ăn carbon nhưng các loại ñường này
rất thích hợp ñối với sự hình thành hệ sợi nấm, song chưa chắc ñã là thích hợp cho
việc hình thành các cơ quan sinh sản hoặc việc tích lũy những chất chuyên hóa
khác.
Trên nguồn thức ăn phức tạp như tinh bột, xenlulose, kitin, ñầu tiên nấm
phải sinh ra các enzym ñể thủy phân các hợp chất này thành các hợp chất ñơn phân
tử sau ñó mới ñồng hóa chúng ñược. Nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu và họ
ñều khẳng ñịnh rằng quá trình xâm nhập của chủng nấm Metarhizium anisopliae
này trước hết là quá trình phân hủy lớp vỏ kitin ở ngoài lớp da côn trùng, sau ñó là
phân hủy protein của các mô côn trùng, ñồng thời với protein là sự phá hủy lipid.
Khi nuôi cấy chủng Metarhizium anisopliae trên môi trường có nguồn
carbon khác nhau, người ta thấy chúng ñồng hóa tốt các loại ñường glucose,
maltose, saccarose nhưng lại ñồng hóa ñường rafinose yếu. Mối quan hệ giữa nguồn
thức ăn carbon với sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Metarhizium
6
anisopliae ñã ñược tác giả Jenking và Prior xác ñịnh ñược tỷ lệ thích hợp giữa
saccarose và pepton trong dịch nuôi cấy có ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng và hình
thành bào tử nấm.
Khi nghiên cứu về hiệu quả của nguồn carbon, nitơ và vitamin ñối với nấm
Metarhizium anisopliae ñược phân lập từ sâu Inoplus ruoricus, người ta nhận thấy
quá trình nảy mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae
ñã sử dụng cả nguồn nitrate và nitơ amon. Trong nguồn nitơ ñã thử, chỉ có axit amin
cystein là ức chế cả sự sinh trưởng và hình thành bào tử của nấm. Những vitamin ñã
thử cũng không làm tăng sự sinh trưởng và hình thành bào tử của nấm Metarhizium
anisopliae.
Ngoài việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ, nấm Metarhizium anisopliae còn
có thể sử dụng tốt những nguồn nitơ hữu cơ như protein, pepton và các axit amin.
Axit glutamic là một trong những axit amin thích hợp hơn cả cho sự phát triển của
nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004).
1.2.2.2. Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng
Trong môi trường nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae nếu ñược bổ sung
thêm kitin tự nhiên của vỏ châu chấu di cư Locusta migratonia sẽ làm tăng khả
năng sinh bào tử (theo Li và Holdom, trích dẫn bởi Phạm Thị Thuỳ, 2004).
Các nguyên tố vi lượng có tác dụng kích thích sự phát triển của nấm
Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004).
Một ñặc tính sinh lý, sinh hoá rất quan trọng của Metarhizium anisopliae là
khả năng biến ñổi các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzym sinh ra trong quá trình
trao ñổi chất vì hệ enzym là một trong những yếu tố ñặc trưng cho cơ chế lây nhiễm
và xâm nhập của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể côn trùng (Trần Minh
Tâm, 2002).
1.2.2.3. Khả năng biến ñổi các cơ chất khác nhờ vào hệ thống enzyme
Một ñặc tính sinh lý, sinh hoá rất quan trọng của Metarhizium anisopliae là
khả năng biến ñổi các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzym sinh ra trong quá trình
7
trao ñổi chất vì hệ enzym là một trong những yếu tố ñặc trưng cho cơ chế lây nhiễm
và xâm nhập của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể côn trùng (Trần Minh
Tâm, 2002).
Messias (1986) ñã nghiên cứu khả năng phân giải kitin của côn trùng thông
qua sự sinh trưởng và phát triển của nấm Metarhizium anisopliae, theo tác giả khi
bổ sung thêm thành phần biểu bì của sâu Dratraea saccharalis vào môi trường nuôi
cấy thì nấm phát triển tốt hơn. Tác giả cũng chứng minh ñược vai trò của enzym
phân giải kitin thông qua sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Phạm Thị Thuỳ,
2004).
1.2.2.4. Khả năng sinh ñộc tố diệt côn trùng
ðộc tố là một trong những sản phẩm thứ cấp không ổn ñịnh, sản phẩm thứ
cấp là một loại hợp chất ñược sinh ra từ các chất trao ñổi sơ cấp nhờ quá trình
chuyển hoá sinh hoá ñặc biệt. Các sản phẩm thứ cấp ñó thường ñược tích lũy vào
cuối giai ñoạn sinh trưởng của nấm khi các nguồn thức ăn và năng lượng ñã cạn dần
(Phạm Thị Thùy, 2004).
Nấm Metarhizium anisopliae có một số ngoại ñộc tố ñó là các sản phẩm thứ
cấp vòng peptid, L- prolyn, L - leucin, anhydride, L-prolyn -L- valine anhydride và
Desmethyl Destruxin B. Theo Lysenko và Kucera thì nấm M. anisopliae cũng sinh
ra ñộc tố Destruxin A và ñộc tố Destruxin B.
ðộc tố Destruxin A có bản chất hoá học là D - 2hydroxy – 4 – penteNry - L prolyl - L - isoleucyl - N – methyl - L - valyl – N – methyl - L - alanyl - β - alanyl
lacton.
Y. Kodaira (1961, 1962) ñã tách ñược ñộc tố Destruxin A từ dịch nuôi cấy
nấm M. anisopliae.
S. Tamura và cs. (1965 -1970) ñã tiến hành nuôi cấy nấm M. anisopliae cũng
ñã tách ñược những ñộc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có chứa 0,5% pepton.
Từ 1 lít dung dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận ñược 13 – 15 mg ñộc tố
Destruxin A và B, dịch lọc ñược xử lý bằng than hoạt tính rồi ñược phản hấp thụ
8
bằng N – butanol, sau ñó ñược tách bằng benzen và ñược làm sạch trên cột nhôm
oxit trung tính.
(Phạm Thị Thùy, 2004).
1.2.2.5. Cơ chế tác ñộng của nấm xanh Metarhizium anisopliae lên côn trùng
Những bào tử của nấm Metarhizium anisopliae khi dính vào côn trùng, gặp
ñiều kiện thuận lợi sẽ nẩy mầm và mọc thành sợi nấm xuyên qua vỏ kitin của côn
trùng. Chúng phát triển trong cơ thể côn trùng tạo thành ống mầm xuyên qua vỏ côn
trùng, tiếp tục phân nhánh tạo thành mạng sợi chằng chịt bên trong cơ thể côn trùng.
Côn trùng huy ñộng tất cả tế bào bạch huyết (lympho - cyte) ñể chống ñỡ, nhưng
nấm Metarhizium anisopliae ñã sử dụng ñộc tố Destruxin A và B làm cho tế bào
bạch huyết lần lượt bị tiêu diệt, ñây cũng là lúc côn trùng chết, cơ thể cứng lại là do
các sợi nấm ñan xen lại với nhau. Cũng có trường hợp khi bị nấm tấn công cơ thể
côn trùng bị ngắn lại hoặc bị khô do hệ thống tiêu hoá bị tổn thương hoặc do thiếu
nguồn thức ăn. Khi nấm Metarhizium anisopliae ký sinh thì tuyến mỡ và mô khác
của côn trùng bị hòa tan do lipaza và proteaza của nấm tiết ra (Phạm Thị Thùy,
2004).
1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng và phát triển của nấm
Metarhizium anisopliae
1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển,
nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc có thể sẽ không mọc. Trong quá trình
nảy mầm ñể hình thành bào tử nấm Metarhizium anisopliae cần các nguồn C, N.
Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi trường thích
hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa kitin làm nguồn carbon, nếu bổ
sung thêm chất kitin và glucose thì trong quá trình nuôi cấy, nấm Metarhizium
anisopliae sẽ thu ñược số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi
trường nuôi cấy là rất cần thiết ñối với các loài nấm, nó giúp cho sự phát triển và
hình thành bào tử ñính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastoospore). Tuy nhiên
9
không phải nguồn thức ăn C và N nào cũng ñều có lợi cho sự sinh trưởng và phát
triển cũng như sự nảy mầm và hình thành bảo tử của nấm Metarhizium anisopliae,
vì ngoài nguồn nitơ vô cơ ra, nấm Metarhizium anisopliae còn sử dụng tốt nguồn
hữu cơ như protein, pepton và các axit amin. Các nguyên tố vi lượng như Zn2+,
Mg2+ có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm.
Về phương pháp nuôi cấy theo các tác giả Rombach, Basto Cruz và cs.,
Hegedus và cs., Miao và cs., Jenkins và Prior, Shimanzu và cs. thì sử dụng phương
pháp nuôi cấy chìm ñể sản xuất nấm sẽ thu ñược kết quả tốt, vì trong nuôi cấy
chìm, người ta ñã xác ñịnh ñược khả năng sinh bào tử chồi và lượng sinh khối
Metarhizium anisopliae là rất cao. Bằng phương pháp nuôi cấy chìm (tại Trung
Quốc), Li và cs. ñã thí nghiệm tách chiết theo phương pháp bản mỏng và các tác giả
ñã xác ñịnh ñược ñộc tố của nấm M.etarhizium anisopliae là Destruxin A, B, C và
D (trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004).
1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và ñộ ẩm
Nhiệt ñộ và ẩm ñộ là hai yếu tố quan trọng có ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng
và phát triển của nấm Metarhizium anisopliae. Theo kết quả nghiên cứu của Viện
Bảo vệ Thực vật xác ñịnh phạm vi nhiệt ñộ thích hợp cho nấm Metarhizium
anisopliae phát triển tốt, phát triển ñều trong khoảng 25 - 300C. Ẩm ñộ thích hợp
trong phạm vi từ 80 - 90%, trên hoặc dưới ngưỡng nhiệt - ẩm ñộ ñó thì nấm sẽ phát
triển yếu, khi nhiệt ñộ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành bào tử
(Phạm Thị Thùy, 2004).
1.3.3. Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng có tác dụng xúc tiến bào tử nảy mầm và hình thành bào tử, mặt
khác ánh sáng cũng có tác dụng ức chế và diệt nấm.
Qua nhiều năm sản xuất nấm côn trùng, Viện Bảo vệ Thực vật xác ñịnh nấm
Metarhizium anisopliae phát triển tốt trong ñiều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một
lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian 6 - 8 giờ cũng ñủ cho nấm phát triển
tốt. Nếu dưới ánh sáng trực xạ nấm Metarhizium anisopliae rất khó nẩy mầm. Vì
10
vậy, phòng nuôi cấy nấm cần phải che ánh sáng mặt trời ñể hạn chế tia tử ngoại
(Phạm Thị Thùy, 2004).
1.3.4. Ảnh hưởng của ñộ thoáng khí
Nấm Metarhizium anisopliae thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng
ñòi hỏi ñiều kiện có hàm lượng oxy thích hợp trong cả biên ñộ rộng cũng như trong
dụng cụ nuôi cấy. Quá trình nghiên cứu, Phạm Thị Thùy và cs. ñã rút ra kết luận
phạm vi thích hợp cho nấm Metarhizium anisopliae phát triển là 0,3 - 0,7m3 môi
trường/m3 không khí. Nếu sản xuất lớn cần ñể ñộ dầy bề mặt (xốp) của nấm trên
khay hay nia khoảng 10 - 15cm, trong phòng sản xuất có không gian thích hợp và
ñiều kiện ẩm ñộ phù hợp (Phạm Thị Thùy, 2004).
1.3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước
Nấm Metarhizium anisopliae ñòi hỏi lượng nước thích hợp, nếu quá khô
hoặc quá ẩm thì nấm ñều phát triển không tốt, tỷ lệ nước thích hợp trong môi trường
ñể nấm phát triển tốt nhất là 30 - 50% (Phạm Thị Thùy, 2004).
1.3.6. Ảnh hưởng của ñộ pH
Phạm vi nấm Metarhizium anisopliae sống ở ñộ pH: 3,5 - 8,0, song nấm
Metarhizium anisopliae ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở ñộ pH từ
5,5 - 6. Vì vậy, Phạm Thị Thùy ñã bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4
và MgSO4.7H2O, mục ñích là ñể duy trì tính ổn ñịnh pH trong môi trường nuôi cấy
(Phạm Thị Thùy, 2004).
Theo Trần Văn Mão (2002) thì nấm Metarhizium anisopliae có pH từ 6,9 7,2. Nói chung, lợi dụng hợp chất cacbon làm giảm pH nhưng lợi dụng protein lại
làm tăng pH. Vì vậy, theo Phạm Thị Thùy (2004) ñã bổ sung vào môi trường một
lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4.7H2O mục ñích là ñể duy trì tính ổn ñịnh của pH
trong môi trường nuôi cấy.
Và theo Issaly và cs. (2005), số lượng bào tử Metarhizium anisopliae ñạt
cao nhất khi pH = 7.
11
1.4. Tình hình sản suất chế phẩm Metarhizium anisopliae
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1878, Metschnhikov ñã phát hiện và phân lập ñược nấm xanh
Metarhizium anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì (Anisophiae
austrinia). Tác giả ñã tìm ra con sâu mang bệnh nấm và nghiên cứu ñể nhân nuôi
chúng rồi thử lại bằng cách sử dụng bào tử nấm thuần khiết gây bệnh trên ấu trùng
và dạng trưởng thành của sâu non bọ ñầu dài hại củ cải ñường (Bothinaderes
punctiventris), ông nhận thấy có hiệu quả. Sau ñó, Metschnhikov vẫn miệt mài với
những nghiên cứu ứng dụng nấm trên ñồng ruộng và xác ñịnh khả năng sử dụng
nấm gây bệnh trên côn trùng vào thực tiễn sản xuất. Cùng với học trò của mình là
nhà côn trùng học Isac Craxinstic, ông ñã tiến hành sản xuất bào tử nấm
Metarhizium anisopliae dạng thuần khiết rồi trộn với chất bột nền và ñưa ra ñồng
ruộng ñể diệt sâu non và trưởng thành bọ ñầu dài hại củ cải ñường (Bothinaders
punctiventris), hiệu quả ñạt ñược 55 - 80% sau 10 - 15 ngày thử nghiệm (Phạm Thị
Thuỳ, 2004).
Theo Bartlett M. C. và Jaronski S. T.(ñược trích dẫn bởi Yasuhisa Kunumi,
2005), Krassilstchik là người ñầu tiên dùng môi trường nhân tạo ñể sản xuất chế
phẩm nấm ký sinh côn trùng vào năm 1884. Brazil cũng ñã sản xuất chế phẩm nấm
diệt côn trùng bằng gạo hoặc cám lúa mì ñựng trong bọc plastic thanh trùng
(Aquino và cs. 1975, 1977, ñược trích dẫn bởi Bartlett M. C. và Jaronski S. T.)
Vấn ñề ñược nghiên cứu nhiều nhất là thành phần dinh dưỡng cũng như
phương pháp nuôi cấy nấm côn trùng. ðể nhận ñược lượng sinh khối và bào tử
nấm, Dangar và cs. ñã nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường
Czapek-Dox là phù hợp nhất. Các tác giả cũng ñã nhận thấy trong số các loại ngũ
cốc sử dụng làm nguồn cacbon thì gạo là phù hợp hơn cả. Basta Cruz và cs. khi
nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae ñể sản xuất chế phẩm nhận thấy, trên môi
trường gạo cho số lượng bào tử hình thành nhiều gấp 3 lần và thời gian hình thành
bào tử cũng nhanh hơn so với môi trường ñậu tương ngâm. Các tác giả ñó còn sử
12
dụng các loại cám, trấu, nước dừa và cùi dừa ñể sản xuất ra sinh khối nấm
Metarhizium anisopliae.
Nuôi cấy nấm ñể sản xuất thuốc trừ sâu sinh học còn phụ thuộc rất nhiều vào
nguồn gốc chủng mới phân lập và nguyên liệu làm môi trường, mặc dù thuốc vi
nấm ñược sản xuất từ các nước khác nhau nhưng ñều cho hiệu quả diệt côn trùng
cao. Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới ñã phát hiện ñược hơn 750 loài nấm có
khả năng gây bệnh trên côn trùng. Trên cơ sở công nghệ sinh học, nhiều phòng thí
nghiệm sinh học trên thế giới ñã nghiên cứu và chế tạo ra các loại thuốc trừ sâu có
nguồn gốc từ nấm.
Tại Cuba, những năm 1970 - 2002, viện công nghệ sinh học Lahabana ñã
nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm Metarhizium anisopliae trên môi trường
tấm gạo với dung dịch cacbonat canxi 0,5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi
sấy khô sau ñó nhân giống thuần. Phương pháp này ñã ñạt ñược kết quả bước ñầu
trong việc sử dụng nấm trừ một số sâu hại cây trồng. Hiện nay nền công nghệ sinh
học ở Cuba phát triển rất nhanh, phương pháp nhân giống nấm trên tấm hoặc gạo ñã
ñược phát triển quy mô lớn. Phương pháp này ñã ñược thử nghiệm ở viện Bảo Vệ
Thực Vật năm 2002 song kết quả thu ñược không ổn ñịnh, mất nhiều thời gian, tốn
công cho luộc và sấy tấm khi sản xuất trong túi nilon dễ bị tạp nhiễm, chất lượng
thấp và không ổn ñịnh, vì sản xuất rất phức tạp, năng suất không cao 10 7-108 bào
tử/gam. So với lên men xốp của viện Bảo vệ thực vật (1996) thì phương pháp của
Cuba cho hiệu suất thấp hơn và thời gian nuôi cấy lâu hơn, giá thành ñắt hơn mặc
dù có cải tiến nhân giống bằng môi trường dịch thể sau ñó nuôi cấy nấm trong túi
PP, nhưng ñiều quan trọng nhất vẫn phải ñảm bảo là phân loại và xác ñịnh ñúng
chủng giống, nếu sai nấm sẽ không có hiệu quả (Phạm Thị Thùy, 2004).
Lotong và Suwanarit (1983) ñã mô tả việc nuôi cấy nấm trong bọc poly
propylene kích thước 16 x 25 cm, chứa 10g cơm ñã ñược chủng nấm Aspergillus
flavus hoặc A. oryzae ñược ủ ở 30oC. Hiện tại có 2 nhà máy ñịa phương của Thái
Lan ñang sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium trong bọc nilon có kích thước 40 x
13
