ẢNH HƯỞNG của VI KHUẨN BACILLUS CHỌN lọc lên ARTEMIA FRANSISCANA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN NGỌC NGANG

ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS CHỌN LỌC
LÊN ARTEMIA FRANSISCANA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

i


TRẦN NGỌC NGANG

ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS CHỌN LỌC
LÊN ARTEMIA FRANSISCANA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

2011

ii


LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, Quý
Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Đặt biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã định
hướng, động viên hướng dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện
đề tài. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K33, lớp Sinh Học
Biển K33 đã tận tình giúp đỡ.
Cuối cũng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình, người thân đặc biệt
là ông bà, cha mẹ đã dành cho tôi nhiều tình cảm, ủng hộ về mặt vật chất lẫn
tinh thần để tôi có thể vượt qua mọi khó khăn trong suốt thời gian học tập.
Chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện
Trần Ngọc Ngang

iii


TÓM TẮT
Nghiên cứu khả năng ứng dụng dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc lên Artemia
fransiscana trong quá trình nuôi là đề tài còn khá mới mẽ nhưng đây cũng là
một hướng nghiên cứu mới nhằm góp phần năng cao hiệu quả sản xuất sinh
khối của Artemia. Đề tài được thực hiện gồm 2 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: gồm 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Trong đó 1 nghiệm thức
không bổ sung vi khuẩn (ĐC), 3 nghiệm thức còn lại được bổ sung vi khuẩn
lần lượt B37, B41 và B67, mật độ vi khuẩn bổ sung là như nhau 106 CFU/mL.
Kết quả cho thấy Artemia ở nghiệm thức được bổ sung vi khuẩn đạt kết tốt
hơn so với nghiệm thức (ĐC) về tỉ lệ sống, tăng trưởng về chiều dài cũng như
chất lượng con cái và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Chiều dài, chất
lượng con cái Artemia ở nghiệm thức B37 đạt cao nhất (9,5±0,1 mm/cá thể và
240,1±10,5 phôi/lần sinh sản lần lượt theo thứ tự) khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) so với nghiệm thức B41 (8,8±0,4 mm/cá thể, 219±3,9 phôi/lần
sinh sản), B67 (8,6±0,2 mm/cá thể, 213,9±3,2 phôi/lần sinh sản) và thấp nhất
ở nghiệm thức ĐC (7,9±0,1 mm/cá thể, 184,3±7,5 phôi/lần sinh sản). Tỉ lệ
sống của Artemia ở B37, B41 và B67 (85,7±3,8, 82,0±2,0 và 80,3±1,5 % lần
lượt theo thứ tự) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ĐC
(62,7±4,0%).
Thí nghiệm 2: gồm 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Trong đó 1 nghiệm thức bổ
sung vi khuẩn B37, 1 nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn (ĐC) và 2 nghiệm
thức còn lại được bổ sung chế phẩm vi sinh lần lượt là TADOBACILLUS và
BZT, mật độ bổ sung vi khuẩn là như nhau 106 CFU/mL. Kết quả cho thấy
Artemia ở nghiệm thức bổ sung B37 tiếp tục cho kết quả tốt hơn so với 2 loại
chế phẩm vi sinh TADOBACILLUS, BZT và ĐC về tỉ lệ sống, chiều dài và
chất lượng con cái. Artemia ở nghiệm thức B37 có chiều dài, số phôi/lần sinh
sản (9,3±0,2 mm/cá thể, 237,7±17,8 phôi/lần sinh sản lần lượt theo thứ tự) và
khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với TADOBACILLUS (8,3±0,4
mm/cá thể, 186,4±21,0 phôi/lần sinh sản), BZT (8,2±0,2 mm/cá thể,
189,4±24,4 phôi/lần sinh sản) và thấp nhất ở nghiệm thức ĐC (7,2±0,3 mm/cá
thể, 147,3±18,6 phôi/lần sinh sản). Tỉ lệ sống của Artemia ở 3 các nghiệm thức
B37 (81,7±3,5%), B41 (79,0±3,6%) và B67 (78,3±5,7%) khác biệt không có ý
nghĩa thống kê (P>0,05), tỉ lệ sống thấp nhất ĐC (65,3±0,6%) khác biệt có ý
nghĩa thống kê (P<0,05) so với các nghiệm thức còn lại.

iv


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Vòng đời của Artemia ( theo Sorgeloos và ctv., 1980) .....................5
Hình 4.1 Trung bình tỉ lệ nở (%) của Artemia NT1 .......................................17
Hình 4.2 Trung bình tỷ lệ sống (%) của Artemia ở thí nghiệm 1....................18
Hình 4.3: Trung bình chiều dài Artemia (mm/cá thể) NT1 ............................19

Hình 4.4 Trung bình số phôi/ lần sinh sản của con cái TN1...........................19
Hình 4.5 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus sp trong nước ở TN1 ..............20
Hình 4.6 Biến động mật độ Vibrio trong nước TN1.......................................20
Hình 4.7 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước TN1 ...........................22
Hình 4.8 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước TN2 ...........................25
Hình 4.9 Trung bình chiều dài (mm) của Artemia TN2 .................................22
Hình 4.10 Trung bình tỉ lệ sống (%) của Artemia TN2 ..................................22
Hình 4.11 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước TN2....................24
Hình 4.12 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước TN2 ......................24
Hình 4.13 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước TN2 .........................25
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: bảng giá trị OD600nm ......................................................................25

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................i
TÓM TẮT......................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................v
PHẦN I: GIỚI THIỆU ....................................................................................1
1.1
Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2
1.2 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................... 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................3
2.1. Vị trí phân loại và đặc điểm phân bố Artemia .................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm môi trường sống......................................................................... 3
2.1.3. Các chu kì sống của Artemia ..................................................................... 4
2.1.4. Đặc điểm dinh dưỡng................................................................................. 6

2.1.5. Đặc điểm sinh sản ...................................................................................... 6
2.2. Chế phẩm sinh học (Probiotics)........................................................................ 7
2.2.1. Sơ lược về chế phẩm sinh học: .................................................................. 7
2.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản .............................. 7
2.2.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus .................................................................. 8
2.2.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis............................................................. 8
2.2.2.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis.................................... 8
2.2.2.3 Vai trò của Bacillus subtilis ................................................................. 9
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến Artemia trong ao nuôi ........................................... 10
2.3.1 Nhiệt độ..................................................................................................... 10
2.3.2 pH.............................................................................................................. 10
2.3.3 Oxy hòa tan ............................................................................................... 10
2.3.4 Độ mặn...................................................................................................... 11
2.3.5 Ánh sáng ................................................................................................... 11
2.3.6 Hiện tượng hoa nước (algae bloom) ......................................................... 11
2.3.7 Hiện tượng đục bùn (clay turbidity).......................................................... 11

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................12
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................... 12
3.1.1 Thời gian ................................................................................................... 12
3.1.2 Địa điểm.................................................................................................... 12
3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 12
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 12
3.3.1 Mô tả thí nghiệm....................................................................................... 12
3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus chọn lọc lên
Artemia franciscana trong quá trình nuôi. ..................................................... 12
3.3.1.2 Thí nghiệm 2: So sánh và đánh giá hiệu quả của vi khuẩn Bacillus
chọn lọc và Bacillus trong chế phẩm vi sinh lên một số chỉ tiêu sinh học của
Artemia........................................................................................................... 13
3.3.2 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn....................................................... 13

3.3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn (Huys, 2002)...................... 14
3.3.3.1 Chuẩn bị trước khi thu mẫu ............................................................... 14
3.3.3.2 Phương pháp thu mẫu ........................................................................ 14

vi


3.3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus sp ...................... 14
3.3.3.4 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn và Vibrio..................... 14
3.3.3.5 Xác định mật độ vi khuẩn trong chế phẩm vi sinh ............................ 15
3.3.4
Phương pháp thu các yếu tố môi trường ............................................ 15
3.3.5 Phương pháp thu mẫu Artemia ............................................................. 15
3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 16
3.3.7 Cách cho ăn và quản lý Artemia thí nghiệm ............................................. 16

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................17
4.1 Thí Nghiệm 1: Khảo sát khả năng ảnh hưởng của Bacillus sp chọn lọc lên tỷ lệ
nở, tỷ lệ sống cũng như tăng trưởng của Artemia trong quá trình nuôi. ................ 17
4.1.1 Một số yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm............................... 17
4.1.2 Sinh học Artemia....................................................................................... 17
4.1.2.1 Tỷ lệ nở trứng bào xác Artemia ........................................................ 17
4.1.2.2 Tỷ lệ sống của Artemia ...................................................................... 17
4.1.2.3 Chiều dài của Artemia........................................................................ 18
4.1.2.4 Trung bình số phôi/lần sinh sản ......................................................... 19
4.1.3 Biến động mật độ vi khuẩn trong nước..................................................... 19
4.1.3.1 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus sp trong nước:.......................... 19
4.1.3.2 Biến động mật độ Vibrio trong nước trong suốt quá trình thí nghiệm20
4.1.3.3 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước ở từng nghiệm thức ..... 20
4.2 Thí nghiệm 2: So sánh và đánh giá hiệu quả sử dụng của vi khuẩn Bacillus 37

và Bacillus sp có trong chế phẩm vi sinh thông qua các chỉ tiêu sinh học Artemia.
................................................................................................................................ 21
4.2.1 Các yếu tố môi trường............................................................................... 21
4.2.2 Sinh học Artemia....................................................................................... 21
4.2.2.1 Chiều dài Artemia .............................................................................. 21
4.2.2.2 Trung bình tỷ lệ sống của Artemia ở thí nghiệm 2 ............................ 22
4.2.2.3 Trung bình số phôi/lần sinh sản của Artemia ở thí nghiệm 2 ............ 22
4.2.3 Biến động mật độ vi khuẩn trong nước ở thí nghiệm 2 ............................ 23
4.2.3.1 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước................................ 23
4.2.3.2 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước ở thí nghiệm 2 .......... 24
4.2.3.3 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước ở thí nghiệm 2 ............. 24

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..........................................................26
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 26
5.2 Đề xuất ............................................................................................................. 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................27
PHỤ LỤC .....................................................................................................28
PHỤ LỤC A .................................................................................................28
A.1.Môi trường chuyên biệt để xác định mật độ vi khuẩn Bacillus................28
A.2. Môi trường LB ......................................................................................28
A.3. Môi trường phân lập Vibrio ...................................................................28
PHỤ LỤC B..................................................................................................29
Phụ lục B.1: Nhiệt độ (ºC) buổi sáng và chiều ở TN1....................................29
Phụ lục B.2: pH buổi sáng và chiều ở thí TN1...............................................29
vii


Phụ lục B.3: Các chỉ tiêu sinh học của Artemia TN1 .....................................30
Phục lục B.4: Mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước TN1...............................30

Phục lục B.5: Mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước TN1 .................................30
Phụ lục B.6: Mật độ tổng vi khuẩn trong nước TN1 ......................................30
Phụ lục B.7: Nhiệt độ (ºC) buổi sáng và chiều TN2.......................................31
Phụ lục B.8: pH buổi sáng và chiều TN2.......................................................31
Phụ lục B.9: Sinh học Artemia TN2 ..............................................................32
Phụ lục B.10: Mật độ vi khuẩn Bacillus TN2 ................................................32
Phụ lục B.11: Mật độ vi khuẩn Vibrio TN2 ...................................................32
Phụ lục 12: Biến động mật độ tổng vi khuẩn TN2 .........................................32

viii


PHẦN I: GIỚI THIỆU
Nghề nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của
nước ta, kim ngạch xuất khẩu hàng năm khá cao, thu lại nguồn ngoại tệ lớn,
đồng thời giải quyết được công ăn việc làm cho hàng ngàn lao động. Theo kế
hoạch của Bộ Thủy sản, đến năm 2010 tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản
nước ta sẽ phấn đấu đạt đến 2.000.000 tấn với giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt
trên 2,5 tỉ USD. Nhắm tới chỉ tiêu này diện tích nuôi thủy sản sẽ phải mở rộng
tương ứng với tôm sú sẽ tăng lên 260.000 ha, cá biển 40.000 ha, cá lồng bè
40.000 ha và tôm càng xanh đạt 32.000 ha. Cùng với việc gia tăng diện tích
nuôi, nhu cầu con giống đáp ứng cho chỉ tiêu này cũng phải đạt tới mức 35 tỷ
con tôm sú giống, trên 500 triệu con giống giáp xác, khoảng 400 triệu con
giống cá biển nước lợ (cá song, cá hồng, cá cam, cá vược, cá măng…), 3,5 tỷ
con giống tôm càng xanh và 12 tỷ con giống cá khác (H. Phương, 2004). Để
sản xuất 1 triệu giống PL15 tôm càng xanh thì cần khoảng 15kg trứng bào xác
Artemia, tôm sú cần 4-5kg (số liệu Khoa Thủy sản, ĐHCT).
Trong khi đó để sản xuất giống các loài cá biển thì nhu cầu trứng dao động
khoảng 200-500g để sản xuất 1.000 con cá giống ( Do vậy nhu cầu về thức ăn để sản xuất con
giống ở nước ta là rất lớn và đặc biệt là trứng bào xác Artemia có thể lên đến

hàng trăm tấn mỗi năm, tỷ lệ thuận với sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy
sản. Chủ động sản xuất trứng Artemia trong nước nhằm đáp ứng nhu cầu các
trại giống là một vấn đề quan trọng bởi vì: (1) Tiết kiệm một lượng lớn ngoại
tệ cho đất nước (hiện tại giá nhập khẩu trứng bào xác Artemia giao động 30150 USD/kg tùy theo chất lượng trứng), (2) Chủ động sản xuất vì không phụ
thuộc vào trứng nhập khẩu từ nước ngoài (cung cầu khó dự đoán), (3) Chất
lượng trứng sản xuất tại Vĩnh Châu-Bạc Liêu có chất lượng dinh dưỡng tốt
hơn, kích thước Artemia-nauplii nhỏ hơn so với các loại trứng nhập khẩu
khác. Xác định rõ tầm quan trọng của nghề nuôi Artemia đã tạo tiền đề phát
triển cho ngành Artemia nói riêng và ngành thủy sản Việt Nam nói chung. Vấn
đề đặt ra ở đây là làm sao ứng dụng các tiến bộ khoa học, các công nghệ mới
vào nghề nuôi Artemia để góp phần tăng năng suất và chất lượng của Artemia.
Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc sử dụng các vi sinh
vật hữu ích để tạo ra các chế phẩm sinh học. Một trong các nhóm vi khuẩn
được nghiên cứu nhiều nhất là nhóm Bacillus hầu hết các loài thuộc giống
Bacillus không độc hại cho con người và động vật thủy sản (Trích dẫn bởi
Olmos, 2005). Nhóm vi khuẩn Bacillus hiện đang được ứng dụng nhiều trong
ngành nuôi trồng thủy sản như: Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007)
về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan,
các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu
cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp gần 2 lần
so với đối chứng. Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam rất ít nghiên cứu khả năng
ứng dụng của vi khuẩn Bacillus lên Artemia. Chính vì thực trạng trên đề tài
“Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc lên Artemia franciscana” được
thực hiện với mục tiêu và nội dung sau:

1


1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát khả năng ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh lên quá trình nuôi Artemia

fransiscana nhằm góp phần năng cao khả năng sản xuất sinh khối của
Artemia.
1.2 Nội dung nghiên cứu
Xác định dòng vi khuẩn Bacillus sp có tác dụng tốt nhất đối với Artemia
franciscana trong quá trình nuôi
So sánh và đánh giá hiệu quả sử dụng của vi khuẩn Bacillus sp đã được chọn
lọc và Bacillus sp có trong chế phẩm vi sinh lên Artemia thông qua các chỉ
tiêu: tỷ lệ nở, tỷ lệ sống và tăng trưởng về chiều dài, chất lượng con cái.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vị trí phân loại và đặc điểm phân bố Artemia
Đặc điểm phân loại
Artemia thuộc nhóm giáp xác có hệ thống phân loại như sau:
Ngành:

Arthropoda

Lớp:

Crustacea

Lớp phụ:

Branchiopoda

Bộ:

Anostraca

Họ:

Artemiidae

Giống:

Artemia

Loài: Artemia franciscana
Người ta tìm thấy nhiều quần thể Artemia trinh sản (quần thể chỉ có con cái và
không có hoạt động thụ tinh trong sinh sản) ở Châu Âu và Châu Á. Các quần
thể Artemia trinh sản có sự sai biệt lớn về di truyền nên khi gọi chung là
Artemia trinh sản đã gây nên nhiều sự nhầm lẫn, do đó nếu chưa xác định quần
thể Artemia một cách chính xác các nhà khoa học đề nghị chỉ nên gọi chung là
Artemia.
Phân bố của Artemia trên thế giới
Sự phân bố của Artemia được chia làm hai nhóm:
Những loài thuộc về Cựu thế giới (Old World) là những loài bản địa tồn tại từ
rất lâu trong các hồ, vịnh tự nhiên.
Những loài thuộc về Tân Thế Giới (New World) là những loài mới xất hiện ở
những vùng trước đây không có sự hiện diện của Artemia. Sự có mặt của
chúng do người, chim hoặc là gió tạo ra mà tiêu biểu là loài Artemia
franciscana (đại diện cho loài Artemia Tân thế giới) đã được sử dụng rộng rãi
để thả nuôi ở nhiều ruộng muối trên khắp các lục địa.
2.1.2. Đặc điểm môi trường sống
Mặt dù Artemia có thể sinh sống tốt ở nước biển tự nhiên (độ mặn 35‰)
nhưng chúng không thể di chuyển từ nơi này sang nơi khác qua đường biển vì
tập tính di chuyển chậm chạp, thậm chí hoặc một số loài trong giai đoạn phát

triển (do ảnh hưởng của môi trường) có màu sắc sặc sỡ nên dễ làm mồi cho kẻ
thù. Sự tồn tại của Artemia trong môi trường tự nhiên lệ thuộc vào khả năng
thích nghi về sinh lý với độ mặn cao để tránh địch hại (cá, tôm…) và cạnh
tranh với các sinh vật ăn lọc khác. Sự thích nghi về sinh lý của chúng với độ
mặn cao theo một cơ chế bao gồm:
Hệ thống điều hòa áp suất thẩm thấu rất tốt.

3


Khả năng tổng hợp các sắc tố hô hấp cao nhằm thích nghi với tình trạng oxy
thấp ở nơi có độ mặn cao.
Khả năng sản xuất trứng bào xác khi điều kiện môi trường trở nên bất lợi.
Vì thế Artemia chỉ có thể thấy ở những nơi mà sinh vật dữ không thể xuất hiện
(cao hơn 70‰). Ở độ mặn bảo hòa (250‰ hoặc cao hơn) Artemia chết đồng
loạt do môi trường vượt ngưỡng chịu đựng (trở lên gây độc) và việc trao đổi
chất cực kỳ khó khăn.
Các dòng Artemia khác nhau thích nghi rộng với sự biến đổi môi trường khác
nhau đặc biệt là nhiệt độ (6-35oC), độ muối (độ mặn của nước) và thành phần
ion trong môi trường sống. Ở các thủy vực nước mặn với muối NaCl là thành
phần chủ yếu tạo nên các sinh cảnh Artemia ven biển và các sinh cảnh nước
mặn khác nằm sâu trong đất liền, chẳng hạn hồ Great Salt Lake (GSL) ở Utah,
Mỹ. Các sinh cảnh Artemia khác không có nguồn gốc từ biển nằm sâu trong
lục địa có thành phần ion khác rất nhiều so với nước biển. Vực nước Sulphate
(Chaplin lake, Saskatchewan, Canada), vực nước carbonate (hồ Mono Lake,
California, Mỹ), và các vực nước giàu lân (rất nhiều hồ ở Nebraska, Mỹ).
Artemia được nuôi rộng rãi ở Việt Nam thuộc dòng Artemia franciscana, mặc
dù có nguồn gốc từ Mỹ (San Fancisco Bay, USA) nhưng sau thời gian thích
nghi dòng này gần như đã trở thành dòng bản địa của Việt Nam và chúng có
nhiều đặc điểm khác xa so với tổ tiên chúng đặc biệt là khả năng chịu nóng.

Hiện tại chúng có thể phát triển tốt trong điều kiện:
Độ mặn: 80-120‰
Nhiệt độ: 22-35oC
Oxy hòa tan: không thấp hơn 2 mg/l
pH trung tính tới kiềm (7.0-9.0)
2.1.3. Các chu kì sống của Artemia
Ngoài tự nhiên, vào thời điểm trong năm khi điều kiện sống không còn thích
hợp, Artemia đẻ trứng bào xác (trứng nghỉ) và trứng sẽ nổi trên mặt nước, sau
đó được sóng gió thổi dạt vào bờ. Các trứng nghỉ này ngưng hoạt động trao
đổi chất và ngưng phát triển khi ở tình trạng được giử khô. Nếu cho vào nước
biển hoặc điều kiện tự nhiên thuận lợi (nhiệt độ ấm áp, mưa nhiều độ mặn
giảm…), trứng bào xác có hình cầu lõm sẽ hút nước, phồng to. Lúc này, bên
trong trứng, sự trao đổi chất bắt đầu. Sau khoảng 20 giờ, màng nở bên ngoài
nứt ra và phôi xuất hiện.

4


Hình 2.1: Vòng đời của Artemia ( theo Sorgeloos và ctv., 1980)
Phôi được màng nở bao quanh. Trong khi phôi đang treo bên dưới vỏ trứng
(giai đoạn dù) sự phát triển của ấu trùng được tiếp tục và tiếp tục một thời gian
ngắn sau đó màng nở bị phá vỡ (giai đoạn nở) ấu thể Artemia được phóng
thích ra ngoài.
Ấu trùng mới nở (Instar I, có chiều dài 400-500 µm) có màu vàng cam, có một
mắt nauplii (ấu thể) màu đỏ ở phần đầu và ba đôi phụ bộ (anten I có chức năng
cảm giác, anten II có chức năng bơi lội và lọc thức ăn và bộ phận hàm dưới để
nhận thức ăn). Mặt bụng ấu trùng được bao phủ bằng mảnh môi trên lớn (để
nhận thức ăn: chuyển các hạt từ tơ lọc thức ăn vào miệng). Ấu trùng giai đoạn
I không tiêu hóa được thức ăn, vì bộ máy tiêu hoá chưa hoàn chỉnh. Lúc này,
chúng sống dựa vào noãn hoàng.

Sau khoảng 8 giờ từ lúc nở, ấu trùng lột xác trở thành ấu trùng giai đoạn II
(Instar II). Lúc này, chúng có thể lọc và tiêu hóa các hạt thức ăn cỡ nhỏ (tế bào
tảo, vi khuẩn, chất hữu cơ) có kích thước từ 1-50 µm (1/1000mm) nhờ vào đôi
anten II vì lúc này bộ máy tiêu hóa đã bắt đầu hoạt động. Ấu trùng tăng trưởng
và trải qua 15 lần lột xác trước khi đạt giai đoạn trưởng thành. Các đôi phụ bộ
xuất hiện ở vùng ngực và dần dần biến thành chân ngực. Mắt kép xuất hiện ở
hai bên mắt.
Từ giai đoạn 10 trở đi, các thay đổi về hình thái và chuyên hóa chức năng của
các cơ quan trong cơ thể bắt đầu: Anten mất chức năng vận chuyển và trải qua
sự biệt hóa về giới tính. Ở con đực anten của chúng phát triển thành càng bám.
Trong khi đó anten của con cái bị thoái hóa thành phần phụ cảm giác (râu cảm
giác). Các chân ngực bây giờ được biệt hóa thành ba bộ phận chức năng: Các
đốt chân chính, các nhánh chân trong (vận chuyển và lọc thức ăn) và nhánh
chân ngoài dạng màng (mang).
Artemia trưởng thành (dài khoảng 10-12mm) có cơ thể kéo dài với hai mắt
kép, ống tiêu hóa thẳng, râu cảm giác và 11 đôi chân ngực.

5


Con đực có đôi giao cấu ở phần sau của vùng ngực (vị trí sau đôi chân ngực
thứ 11). Con cái rất dễ nhận dạng nhờ vào túi ấp hoặc tử cung nằm ngay sau
đôi chân ngực thứ 11.
Tuổi thọ trung bình của Artemia trong các ao nuôi trên ruộng muối khoảng 4060 ngày tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, độ mặn, thức
ăn…) Tuy nhiên quần thể Artemia trong ruộng muối vẫn tiếp tục tồn tại ngay
cả trong mùa mưa khi độ mặn xuống thấp (<60‰) nếu trong ao nuôi không bị
địch hại (tôm, cá, coperpode…) tấn công và vẫn được cung cấp đầy đủ thức
ăn.
2.1.4. Đặc điểm dinh dưỡng
Artemia là loài sinh vật ăn lọc không chọn lựa, chúng sử dụng mùn bã hữu cơ,

tảo đởn bào và vi khuẩn có kích thước nhỏ hơn 50 µm . Các sinh cảnh tự nhiên
có hiện diện Artemia cho thấy sự có mặt của chuỗi thức ăn đơn giản và rất ít
thành phần giống loài tảo. Artemia thường hiện diện ở nồng độ muối cao mà ở
nồng độ này hiếm gặp các loài tôm, cá dữ và động vật cạnh tranh thức ăn khác
như luân trùng, giáp xác nhỏ ăn tảo. Ở các sinh cảnh này nhiệt độ, thức ăn và
nồng độ muối là những nhân tố ảnh hưởng đến mật độ của quần thể Artemia
hoặc ngay cả đến sự vắng mặt tạm thời của chúng.
Trong quần thể nuôi Artemia trên ruộng muối nông dân thường sử dụng phối
hợp phân chuồng (chủ yếu là phân gà) kết hợp với phân vô cơ (Urea, DAP…)
để gây màu trực tiếp (trong ao nuôi Artemia) hoặc gián tiếp (ngoài ao bón
phân) trước khi cấp nước “màu” (nước tảo) vào trong ao nuôi. Phân gà khi
được bón trực tiếp vào ao nuôi, ngoài việc cung cấp dinh dưỡng kích thích tảo
phát triển, phân còn là nguồn thức ăn trực tiếp cho Artemia. Ngoài ra, khi
lượng nước tảo cung cấp vào ao hàng ngày thiếu hụt, nông dân còn sử dụng
cám gạo, bột đậu nành hoặc các loại phụ phẩm nông nghiệp khác… để duy trì
quần thể Artemia.
2.1.5. Đặc điểm sinh sản
Đối với quần thể Artemia lưỡng tính, khi trưởng thành con đực dùng đôi càng
ôm phần bụng con cái gọi là “hiện tượng bắt cặp” để thụ tinh cho hoạt động
sinh sản và hiện tượng này thường kéo dài suốt vòng đời của chúng. Quá trình
giao cấu diễn ra khi bơi lội trong tư thế bắt cặp, con đực sẽ cong mình và dùng
một trong hai gai sinh dục chuyển sản phẩm sinh dục vào buồng trứng của con
cái và trứng sẽ được thụ tinh.
Trứng phát triển trong hai buồng trứng dạng ống ở phần bụng. Khi chín, trứng
có dạng hình cầu và di chuyển qua hai ống dẫn vào tử cung. Thông thường
trứng thụ tinh phát triển thành ấu trùng bơi lội tự do (phương thức đẻ con) và
được con mẹ sinh ra ngoài môi trường. Trong điều kiện bất lợi, các phôi chỉ
phát triển đến giai đoạn phôi vị, lúc này chúng sẽ được bao bọc bằng một lớp
vỏ dày (được tiết ra từ tuyến vỏ trong tử cung) biến thành trứng nghỉ hay còn
gọi là trứng “tiềm sinh” và được con cái phóng thích ra ngoài.

Artemia trưởng thành trong vòng 2 đến 3 tuần và tham gia sinh sản với sức
sinh sản tối đa 300 ấu thể hoặc trứng bào xác trong vòng 4 ngày.Trong vòng
6


đời con cái có thể tham gia cả hai phương thức sinh sản (đẻ con hoặc đẻ trứng)
và trung bình mỗi con đẻ khoảng 1500-2500 phôi.
2.2. Chế phẩm sinh học (Probiotics)
2.2.1. Sơ lược về chế phẩm sinh học:
Probiotics là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của các sinh vật sống có tác
động hữu ích đối với vật chủ nhờ khả năng cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật
chủ hay sống tự do trong môi trường, giúp hấp thu thức ăn tốt hơn đồng thời
có thể nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra còn hạn chế được
mầm bệnh (Phạm Thị Tuyến Ngân, 2007).
Probiotics là tập hợp những vi khẩn có lợi, hầu hết chúng là vi khuẩn lactic
acid (Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L.casei, L.rhamnosus,
L.bulgaricus…), giống Vibrio (Vibrio alginolyticus), giống Bacillus
(B.subtilis, B.licheniformis, B.megaterium, B.polymyxa,…), Actinomycetes,
Nitrobacteria…chúng được sử dụng trong các bể ương hay trong ao nuôi để
hạn chế các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al., 1998); ngoài ra còn giúp
cải thiện chất lượng nước và nâng cao sức đề kháng của vật chủ (Lê Đình
Duẫn và ctv, 2007). Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) thì
một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic đó là tập hợp các
enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase,
chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế
phẩm sinh học giúp xử lý nền nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm chủng
nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc nhóm Aspergillus, Streptomyses…).
Theo Nair et al., 1985 thì khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh như
Aeromonas hydrop vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có hila
và Vibrio parahaemolyticus (trích dẫn theo Xiang-Hong et al., 1998). Sử dụng

các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ ruột cá bơn (Scophthalmus maxumus)
trong ao nuôi có thể kiềm hãm vi khuẩn V. anguillarum gây bệnh (Olsson et
al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có hiệu quả
với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007).
Nghiên cứu của Xiang-Hong et al., (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn có
lợi có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho biết
thêm những vi khuẩn có lợi cho nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu
cơ có hại. Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi.
Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh
vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên
cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến
chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt hiểu quả cao trong việc chuyển đổi vật
chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy hữu cơ và các
chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007).
2.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn
chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể
khả năng gây bệnh của một số loài vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là
7


biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiển (Xiang-Hong et al.,
1998).
Cơ chế tác động của chế phẩm sinh học là: khống chế sinh học (những dòng vi
khuẩn có lợi tác động ức chế dòng vi khuẩn gây bệnh), tạo ra sự sống (các vi
khuẩn sẽ phát triển trong nước) và xử lý sinh học (phân hủy các chất hữu cơ
trong nước bằng các vi khuẩn có lợi). Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy
sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi
thủy sản. Nghiên cứu gần đây nhất “Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus (B8,
B37, B38) lên môi trường và tôm nuôi (Penaeus monodon) trong bể” kết quả

cho thấy hiệu quả xử lý môi trường của dòng vi khuẩn B37 là tốt nhất tỷ lệ
sống của tôm là 93,33±1,65% cao nhất so với các nghiệm thức còn lại (Phạm
Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010). Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn
và ctv., (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả
rất tốt, chế phẩm sinh học làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm
sạch, và ổn định môi trường nước đồng thời còn làm tăng năng suất gấp 2 lần
so với đối chứng. Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của vi khuẩn
chọn lọc trong bể nuôi tôm sú (Penaeus monodon) cho thấy dòng vi khuẩn
B37 mang lại hiệu quả xử lý nước tốt nhất so với các dòng vi khuẩn còn lại.
Tỷ lệ sống tôm đạt (93,33±1,65% cao nhất so với các nghiệm thức còn lại
(Nguyễn Anh Duy, 2010).
2.2.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus
2.2.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis
Giới: Bacteria
Ngành:

Firmicutes

Bộ:

Bacillates

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài: Bacillus subtilis
( />Năm 1872, Ferdinand Cohn, đã phát hiện và đặt tên là B. subtilis. Bacillus
subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước 2-3×0,7-0,8µm, nội
bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8× 0,8µm. Ở điều kiện 100ºC, bào tử B.
subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô
cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ B. subtilis hình thành bào tử khi môi
trường biến đổi đột ngột, cũng như sống thời gian dài dưới những điều kiện
bất lợi khan hiếm chất dinh dưỡng. Tuy nhiên, B. subtilis cũng có thể phản
ứng với sự thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ các điều kiện
nghèo dinh dưỡng đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi (Mirel et al.,2000).
2.2.2.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis
Khi môi trường bị thay đổi đột ngột hoặc do thiếu thức ăn, các loài thuộc
giống Bacillus và Clotridia khác nhau tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động
8


tạm thời gọi là nội bào tử, có thể chống lại các tấn công lớn có thể phá hủy
thành tế bào (Driks, 1999). Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải
để sinh sôi nẩy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là loại tế
bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh
(Nguyễn Lân Dũng,1983). Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về
bào tử của B. anthracis có thể sống sót ở điều kiện nhiệt độ và điều kiện gây
sốc khác. Theo Driks (1999), bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào
tử. Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều lớp bao quanh bào tử được cấu thành
bởi hơn 25 loại polypeptide liên kết chéo chặt chẽ với nhau. Tuy nhiên lớp áo
bào tử cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường thích hợp. Bào tử có
thể chuyển thành tế bào phát triển qua một quá trình gọi là sự nảy mầm.Trong
quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh.
Nhiều loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer
sinh học (Protein, starch, pectin,…) đóng vai trò quan trọng trong các chu

trình sinh học nitơ và cacbon.
(http:/www.texbookofbacteriology.net/Bacillus.htm). Quá trình hình thành bào
tử của vi khuẩn cần khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks,1999). Trong quá trình
hình thành bào tử, nhiễm sắc thể phân đôi thành các bản sao riêng biệt. Cuối
cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong bào tử, các phần còn lại bị
hủy đi và bào tử được phóng thích. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), phần lớn
vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào
tử sẽ nảy mầm và mỗi bào tử chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng.
Trong tất cả các loài, không phải tất cả tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong
bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong
môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên có thể
chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng và trong suốt
pha tĩnh (Banwart, 2000).
2.2.2.3 Vai trò của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis tạo protease kiềm (subtilisin) với lượng lớn, có đặc tính bền
vững hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều
ngành công nghiệp khác nhau. Subtibilin chủ yếu được sử dụng trong các
ngành công nghiệp các chất tẩy rửa và cả trong y dược học. Ngoài ra subtibilin
còn sử dụng trong xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc,
làm nước mắm cá, làm thức ăn gia xúc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác,
xử lý rác thải trong lò mổ gia cầm.
Trong những năm gần đây tất cả protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị
trường đều là protease được sản xuất từ các chủng Bacillus, mà chủ yếu là
Bacillus subtilis. Năm 1971, đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những
nghiên cứu về protease kiềm ở Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố
thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản, tính chất lý hóa của protease
kiềm từ vi khuẩn Bacillus ( />Năm 1972, người ta đã nghiên cứu và sản xuất trên quy mô lớn các protease
kiềm ở một vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease
kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị

9


trường thương mại. Vi khuẩn Bacillus trở thành “một thế giới vi sinh mới”.
( />Theo Bùi Quang Tề, (2003) khi sử dụng dòng vi khuẩn (đa số là vi khuẩn kỵ
khí) có chức năng phân hủy vật chất hữu cơ tồn đọng trong ao nuôi. Chuyển
hóa amoniac thành đạm hữu ích, cân bằng quần thể vi sinh vật trong ao nuôi
và được xem là nhóm phân hủy mùn bã hữu cơ có hiệu quả nhất. Ngoài ra
Bacillus subtilis còn giúp làm giảm sự phát triển của nhóm vi khuẩn có hại
như: Vibrio, Aeromonas và ký sinh trùng đơn bào. Trong hệ thống nuôi tôm ít
thay nước người ta sử dụng probiotic để xử lý khí độc, chuyển hóa đạm
amoniac thành đạm ít độc, nhóm này rất cần thiết cho nền đáy. B. subtilis là
một trong những vi khuẩn có tiềm năng nhất, thuận lợi trong việc cải thiện sức
khỏe và kích thích hệ miễn dịch. Theo các nghiên cứu lâm sàng trong báo cáo
khoa học về thuốc “sự kích thích miễn dịch bởi Bacillus subtilis” của nhà vi
sinh vật học J. Harman, các thành phần của tế bào vi khuẩn B. subtilis có thể
hoạt hóa gần như tất cả các hệ thống của thành tế bào vi khuẩn B. subtilis có
thể hoạt hóa gần như tất cả các hệ thống phòng thủ miễn dịch của con người,
bao gồm sự hoạt hóa ít nhất 3 kháng thể chuyên biệt (IgM, IgG, IgA) chống lại
hiệu quả nhiều virus, nấm, mầm bệnh vi khuẩn gây hại thường xâm nhập và
gây nhiễm vào cơ thể người.
( Theo một nghiên cứu của
(Gong et al., 2006). Chủng B. subtilis PY-1 phân lập từ bó mạch của cây bông
có khả năng kháng mạnh nhiều mầm bệnh nấm trên cây trồng đặc biệt là nấm
Fusarium oxysporum gây ra thiệt hại kinh tế lớn trong nhiều mùa vụ. Theo tác
giả, các chất kháng sinh tạo ra bởi chủng B. subtilis PY-1 ổn định ở các điều
kiện pH trung tính và kiềm, không nhạy với nhiệt độ cao. Gần đây các nhà
khoa học, kiểm soát mầm bệnh và thay thế thuốc diệt sinh vật (methyl
bromide) có nguy cơ gây ra thiệt hại môi trường nghiêm trọng.
(./Bacillus-subtilis.html/).

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến Artemia trong ao nuôi
2.3.1 Nhiệt độ
Nghiên cứu sự thích nghi được thực hiện trên trứng bào xác và con trưởng
thành thông qua đo đạc hàm lượng protein gây sốc (Clegg và ctv., 2000) khi
chúng được nuôi thả trong điều kiện nhiệt độ cao. Qua đó cho thấy con trưởng
thành Artemia có nguồn gốc từ trứng bào xác Vĩnh Châu có khả năng chịu
đựng nhiệt độ cao hơn so với con trưởng thành từ dòng gốc AFB.
Khi nâng nhiệt độ môi trường lên 38oC thì thời gian để 50% quần thể chết do
nóng ở dòng Artemia VC khoảng 60 phút trong khi dòng Artemia SFB chỉ có
thể chịu đựng trong thời gian khoảng 35 phút. Điều kiện thích hợp nhất để
Artemia sinh trưởng và phát triển là vào khoảng 22-35oC.
2.3.2 pH
Theo Dhont và Lavens (1996) pH thích hợp cho nhất cho Artemia nằm trong
khoảng 6,5-8.
2.3.3 Oxy hòa tan
10


Trong ao nuôi, hàm lượng oxy thường cao hơn ở lớp nước bề mặt đặt biệt là
khi xãy ra hiện tượng phân tầng. Khi oxy hòa tan thấp hơn 2mg/l nó sẽ ảnh
hưởng tới sự sản xuất sinh khối trong ao. Mức oxy thích hợp cho ao nuôi
Artemia là cao hơn 2.5mg/l.
2.3.4 Độ mặn
Trong suốt thời gian từ 1996-1998 dòng SFB từ Mỹ đã được Khoa Thủy sản,
Đại học Cần Thơ nghiên cứu nuôi thả tại Vĩnh Châu ở các điều kiện khác nhau
(80-120‰), kết quả cho thấy độ mặn ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sản
xuất trứng bào xác. Đối với Artemia SFB sản xuất nhiều trứng bào xác ở
120‰ so với 80‰ trong khi đó dòng Artemia Vĩnh Châu (CV, các thế hệ con
cháu của dòng Artemia SFB đã được cấy thả tại Vĩnh Châu từ 1986 và được
xem như dòng thích nghi) thì khả năng sản xuất trứng bào xác cao và ổn định

ở độ mặn dao động quanh 80‰. Độ mặn thích hợp để Artemia phát triển là
80-120‰
2.3.5 Ánh sáng
Ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển phôi của Artemia. Ánh sáng thích hợp
đối với Artemia là 1000 lux (dùng đèn neon đặt cách bể ấp trứng khoảng 3040 cm) tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của phôi Artemia.
2.3.6 Hiện tượng hoa nước (algae bloom)
Theo Võ Thị Gương và ctv (2001) thì đối với ao nuôi Artemia, đất đáy ao giàu
dinh dưỡng, giàu chất hữu cơ, giàu Ca, Mg, ít Fe có khả năng hấp thụ lân thấp
đồng thời khả năng đệm P cao, trong điều kiện đất khử, P được phóng thích ở
dạng P hữu dụng cao để góp phần tạo nên tình trạng tảo phát triển quá mức
(algal bloom) gây hại cho Artemia.
2.3.7 Hiện tượng đục bùn (clay turbidity)
Theo Võ Thị Gương và ctv (2001) thì hàm lượng Na cao so với các cation K,
Ca và Mg trong đất và nước, đồng thời kế hợp với độ mặn cao làm hạt sét
phân tán lơ lửng làm ao nuôi bị đục, đây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến
Artemia.

11


PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Từ tháng 02 năm 2011 đến tháng 06 năm 2011
3.1.2 Địa điểm
Tại trại cua và phòng Vi Sinh-Bộ môn thủy sinh học ứng dụng Khoa Thủy
sản-Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
12 chai thủy tinh 250ml
12 chai thủy tinh 1000ml

Máy đo độ mặn
Máy đo pH
Máy sục khí
Nhiệt kế
Đèn neon
Hóa chất cố định mẫu
Hóa chất phân tích mẫu
Các trang thiết bị thu mẫu và phân tích mẫu vi sinh, Phòng thí nghiệm Vi sinh
(Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng-Khoa Thủy sản).
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Mô tả thí nghiệm
3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus chọn lọc lên
Artemia franciscana trong quá trình nuôi.
Mật độ Artemia trong thí nghiệm là 200 con/L và mật độ vi khuẩn là như nhau
106 CFU/mL ở các nghiệm thức được bổ sung vi khuẩn. Thí nghiệm được bố
trí trong chai thủy tinh 1L với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại:
Nghiệm thức 1: không bổ sung vi khuẩn (ĐC)
Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn B37 (Bacillus cereus).
Nghiệm thức 3: bổ sung vi khuẩn B41 (Bacillus amyloliquefaciens).
Nghiệm thức 4: bổ sung vi khuẩn B67 (Bacillus subtillis).
Để ấp nở Artemia sử dụng 12 chai thủy tinh 250 mL chứa nước có độ mặn
35‰ đã được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút. Cân 6g trứng bào xác
Artemia cho vào cốc thủy tinh chứa đầy nước trong 2 giờ trước khi bóc vỏ.
Trứng bào xác Artemia được bóc vỏ bằng nước javel (NaOCl) với nồng độ
như sau: Áp dụng cho 2g trứng cần: 10ml (Javen 35% hoạt tính) + 0.66 ml
NaOH (dung dịch NaOH 40%) + 10 ml Na2S2O3 + 17.2 ml nước ngọt. Mật độ

12

cho ấp nở là 2g/L, điều kiện ấp nở theo điều kiện chuẩn (độ mặn: 30 - 35‰,
nhiệt độ: 28 - 30°C, ánh sáng: 1000 lux (dùng đèn neon đặt cách bể ấp khoảng
30 – 40 cm), sục khí liên tục, thời gian ấp nở: 20 – 24 giờ).
Tiệt trùng 12 chai thủy tinh 1 L chứa 0,5 L nước có độ mặn 35‰ ở 121°C để
chuẩn bị nuôi Artemia. Sau khi xác định tỷ lệ nở Artemia được bố trí vào chai
nuôi với mật độ 200 con/L. Sử dụng tảo Chaetoceros làm nguồn thức ăn chính
cho Artemia trong suốt quá trình nuôi.
Vi khuẩn được bổ sung ngay sau khi tiến hành ấp và nuôi Artemia với mật độ
bổ sung là như nhau 106 CFU/mL ở tất cả các nghiệm thức và nhịp độ bổ sung
vi khuẩn 3 ngày/lần. Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày.
3.3.1.2 Thí nghiệm 2: So sánh và đánh giá hiệu quả của vi khuẩn Bacillus
chọn lọc và Bacillus trong chế phẩm vi sinh lên một số chỉ tiêu sinh học
của Artemia.
Từ kết quả thí nghiệm 1 ta chọn ra loài vi khuẩn Bacillus ở nghiệm thức đạt
kết quả tốt nhất để tiến hành thí nghiệm 2. Thí nghiệm 2 gồm 4 nghiệm thức, 3
lần lặp lại:
- Nghiệm thức 1: Không bổ sung vi khuẩn (ĐC)
- Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn Bacillus chọn lọc
- Nghiệm thức 3: bổ sung chế phẩm vi sinh TADOBACILLUS
- Nghiệm thức 4: bổ sung chế phẩm vi sinh BZT
Cách bố trí, thu và phân tích mẫu được thực hiện tương tự như thí nghiệm 1.
Thí nghiệm 2 được thực hiện trong 15 ngày.
3.3.2 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn
Ba loài vi khuẩn Bacillus B37, B41 và B67 được phụ hồi trên môi trường
TSA. Các chủng này sau đó được tiếp tục nuôi tăng sinh bằng môi trường
Luria Bertani (LB), phụ lục (A.2). Vi khuẩn Bacillus được cho vào bình tam
giác có gắn sục khí, ở 30°C trong vòng 24 giờ. Sau khi nuôi tăng sinh, mật độ
vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600 nm.
Phương pháp đo OD: sau khi nuôi tăng sinh sử dụng máy đo quang phổ tại
bước sóng 600 nm để xác định giá trị OD. Mẫu đối chứng không có vi khuẩn

được đo đầu tiên và có giá trị bằng 0. Dung dịch huyền phù vi khuẩn cần đo sẽ
có giá trị OD trong khoảng 0,125 - 1,25. Theo tiêu chuẩn Mac Farland giá trị
OD bằng 1 tương ứng mật độ vi khuẩn 1,2 × 109 tế bào/mL.
Mật độ vi khuẩn được tính theo công thức
Mật độ vi khuẩn (tế bào/ml) = 1200 × OD × 106 × Độ pha loãng

13


Bảng 3.1: bảng giá trị OD600mm
Giá Trị OD600

0,125

Mật Độ Vi Khuẩn
150
(106 CFU/Ml)

0,250

0,500

0,750

1,000

1,250

300

600

900

1200

1500

3.3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn (Huys, 2002)
3.3.3.1 Chuẩn bị trước khi thu mẫu
Các ống falcon, ống nghiệm được tiệt trùng trước khi thu mẫu. Các ống
nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85% đã được tiệt trùng ở 1210C trong
15 - 20 phút. Môi trường NA + 1,5% muối NaCl, TCBS (Thiosulfate Citrate
Bile Sucrose Agar), (phục lục A.3) và môi trường chuyên biệt cho Bacillus sp
(phục lục A.1)
3.3.3.2 Phương pháp thu mẫu
Mẫu nước được thu bằng ống falcon tiệt trùng, thu mẫu cách mặt nước 2030cm. Sau đó trữ lạnh ngay ở 40C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ.
3.3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus sp
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý (0,85%) đã tiệt trùng ở
121°C trong 20 phút để pha loãng mẫu. Đối với mẫu nước tại phòng thí
nghiệm lấy mẫu nước ra khỏi tủ mát để nhiệt độ phòng. Mở nắp dụng cụ chứa
mẫu trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1 ml mẫu nước từ mỗi chai sang các ống
nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã được tuyệt trùng, trộn điều bằng máy 1
phút. Ta được mẫu có độ pha loãng 10-1. Từ mẫu này chuyển 1 ml dung dịch
sang ống nghiệm khác chứa 9 ml nước muối sinh lý được độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp.
Sau đó sắp xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng vào cùng một giá đem sấy
ở 80°C. Khi nhiệt độ đạt 80°C tính thời gian đến 30 phút rối lấy ống nghiệm
ra. Sau đó dùng micropiet hút 100 µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa
chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus, rồi dùng que thủy tinh tán

đều cho đến khi mẫu khô. Ủ ở 28°C trong 24 - 48 giờ. Mỗi mẫu nước cần
chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần sau khi ủ kiểm
tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20-200. Số
khuẩn lạc tổng cộng được điếm trên những đĩa Petri có số khuẩn lạc > 20 và <
200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/mL nước. Xác định số
lượng khuẩn lạc trong mỗi đĩa môi trường và tính số trung bình cùng độ lệch
chuẩn. Số lượng vi khuẩn được tính bằng công thức:
Số tế bào/ mL (CFU/mL) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10
3.3.3.4 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn và Vibrio
Sau khi pha loãng dùng micropipette hut 100 µL dung dịch vi khuẩn cho vào
đĩa chứa môi trường TCBS chuyên biệt cho giống Vibrio, môi trường NA cho
tổng vi khuẩn. Dùng que tủy tinh tán điều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28°C trong
14


24–48 giờ. Mỗi mẫu nước cần chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha
loãng lập lại 3 lần. Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số
khuẩn lạc dao động từ 20 đến 200. Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên đĩa
Petri có số khuẩn là >20 và <200 và được tính bằng đơn vị khuẩn lạc/mL
nước. Công thức tính mật độ vi khuẩn:
Số tế bào/mL (CFU/ mL) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10
3.3.3.5 Xác định mật độ vi khuẩn trong chế phẩm vi sinh
Đối với hai nghiệm thức sử dụng chế phẩm vi sinh (CPVS): CPVS (BZT) và
(TADOBACILLUS) thành phẩm ở dạng bột nên khi sử dụng phải hòa tan vào
nước. Tiến hành cân 1g chế phẩm hòa tan vào 9 mL nước muối sinh lý sau đó
để lên máy lắc 2 giờ để kích thích hệ vi khuẩn trong CPVS hoạt động. Tiếp
theo pha với nước muối sinh lý ở nồng độ 10-5 và sấy ở nhiệt độ 80oC 20 phút.
Cuối cùng cấy lên đĩa có môi trường chuyên Bacillus sp và dùng phương pháp
đếm số khuẩn lạc để xác định mật độ.
3.3.4 Phương pháp thu các yếu tố môi trường

Nhiệt độ (oC): được đo bằng nhiệt kế thuỷ tinh 2 lần/ngày vào lúc 7 giờ và 14
giờ. Độ mặn (‰) được đo bằng khúc xạ kế (Salinometer) 1 lần/ngày vào lúc 7
giờ. pH được đo bằng pH kế 2 lần/ngày vào lúc 7 giờ và 14 giờ.
3.3.5 Phương pháp thu mẫu Artemia
Các chỉ tiêu sinh học của Artemia: tỷ lệ nở,tỷ lệ sống, tăng trưởng chiều dài và
số phôi/lần sinh sản được thu một lần vào thời điểm kết thúc thí nghiệm (ngày
thứ 15).
Tỷ lệ sống của Artemia được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng
mắt thường, Artemia mang trứng được cho vào đĩa Petri và đưa lên kính nhìn
nổi để đếm số phôi có trong buồng trứng, mỗi nghiệm thức được thực hiện với
3 lần lặp lại.
Chiều dài của Artemia được xác định bằng cách bắt ngẫu nhiên 30 con, sau đó
tiến hành đo dưới kính hiển vi chuyên dùng có thước đo.
1×A

Chiều dài Artemia (mm/cá thể) =
10 × γ

A: Số vạch trên kính hiển vi
γ: Độ phóng đại của kính
Tỷ lệ nở: Số lượng ấu trùng nauplii nở từ 100 trứng dưới điều kiện nở chuẩn
được tính bằng công thức:
N × 100

H% =
N+U+E

N: số nauplii đếm được trong mẫu thu
15

U: Số trứng ở giai đoạn bung dù hiện diện trong mẫu thu
E: Số phôi không nở trong mẫu thu
3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel (số trung bình, độ lệch) và so sánh
thống kê (một nhân tố) theo phần mềm Statistica.
Số liệu vi sinh được chuyển dạng thành dạng Log trước khi xử lý bằng phần
mềm Excel và sau đó được kiểm tra lại bằng phần mềm thống kê Statistica
3.3.7 Cách cho ăn và quản lý Artemia thí nghiệm
Tảo Chaetoceros sp. được sử dụng làm thức ăn cho. Artemia trong suốt quá
trình nuôi. Chế độ cho ăn: 4 lần/ngày, liều lượng cho ăn theo kiểu thoả mản
bằng cách quan sát màu nước trong chai thí nghiệm, biểu hiện bơi lội của
Artemia và sự hiện diện của thức ăn trong đường ruột Artemia (nếu đường ruột
đứt quãng thì lượng thức ăn đưa vào không đủ). Trong thời gian nuôi quản lý
thức ăn luôn được chú trọng, không cho ăn quá dư thức ăn vì dễ làm bẩn nước
và ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của Artemia. Tảo Chaetoceros sp. được ly tâm
trước khi cho Artemia ăn

16


PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí Nghiệm 1: Khảo sát khả năng ảnh hưởng của Bacillus sp chọn lọc
lên tỷ lệ nở, tỷ lệ sống cũng như tăng trưởng của Artemia trong quá trình
nuôi.
4.1.1 Một số yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm
Do được bố trí trong phòng kín, nhìn chung nhiệt độ trong chai thí nghiệm
tương đối ổn định. Nhiệt độ trung bình lúc 7 giờ (24,5±0,55°C), 14 giờ
(34,5±0,52°C). Theo Delos Santos et al.,(1980) cho rằng nhiệt độ thích hợp
cho sự phát triển của Artemia 22-35°C. Nhiệt độ ở các nghiệm thức dao động

tương đối nhỏ và nằm trong khoảng tốt nhất cho sự phát triển của Artemia.
Độ mặn ở các nghiệm thức được duy trì khoảng 35‰ nhằm tạo điều kiện cho
vi khuẩn Bacillus phát triển. Độ mặn không ảnh hưởng rõ ràng đến sự sinh
trưởng cũng như tốc độ tăng trưởng đặc trưng (%/ngày) của Artemia (Nguyễn
Tấn Sĩ, 2008).
Chỉ tiêu pH khác biệt không có ý nghĩa thống (P>0,05) ở 4 nghiệm thức và
dao động từ 7,5 – 7,9. theo Dhont và Lavens (1966) pH thích hợp cho Artemia
nằm trong khoảng 6,5 – 8. Như vậy pH của các nghiệm thức dao động trong
khoảng phù hợp cho sự phát triển của Artemia.
4.1.2 Sinh học Artemia
4.1.2.1 Tỷ lệ nở trứng bào xác Artemia
Trứng bào xác Artemia đã được áp dụng kỹ thuật bóc vỏ trước khi cho nở
nhằm tạo ra ấu trùng vô trùng và điều kiện ấp nở theo điều kiện chuẩn (Dhont,
1996). Tỷ lệ nở của Artemia trung bình đạt 84,9%. Tỷ lệ nở của Artemia ở các
nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05) và được thể hiện
qua Hình 4.1. Chứng tỏ vi khuẩn Bacillus không có khả năng cải thiện tỉ lệ nở
của Artemia.
100

a

a

a

a

ĐC

B37

B41

B67

90
80

Tỉ lệ nở (%)

70
60
50
40
30
20
10
0
Nghiệm thức

Hình 4.1 Trung bình tỉ lệ nở (%) của Artemia NT1
4.1.2.2 Tỷ lệ sống của Artemia
17