PHÂN TÍCH tồn lưu KHÁNG SINH FLORFENICOL và FLORFENICOL AMINE TRONG cá TRA (pangasianodon hypophthalmus) BẰNG hệ THỐNG sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN ANH KHOA

PHÂN TÍCH TỒN LƯU
KHÁNG SINH FLORFENICOL VÀ FLORFENICOL
AMINE TRONG CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
BẰNG HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN ANH KHOA

PHÂN TÍCH TỒN LƯU
KHÁNG SINH FLORFENICOL VÀ FLORFENICOL
AMINE TRONG CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
BẰNG HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CBHD:
Ths. TRẦN MINH PHÚ

2011


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Luận văn tốt nghiệp đại học, đề tài “Phân tích tồn lưu kháng sinh
Florfenicol và Florfenicol Amine trong cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bằng hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)”. Do sinh
viên Trần Anh Khoa thực hiện dưới sự hướng dẫn của Ths. Trần Minh Phú, đã
được chỉnh sửa theo yêu cầu và sự góp ý của cán bộ hướng dẫn.

Cán bộ hướng dẫn

Cần Thơ, ngày 18 tháng 07 năm 2011
Sinh viên thực hiện

TRẦN ANH KHOA

i


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Quí thầy cô Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế biến Thủy sản, cùng quí thầy cô
Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi
trong suốt quá trình học tập tại trường.
Thầy Trần Minh Phú, cán bộ hướng dẫn đã tận tình chỉ dạy cho tôi phương
pháp thực hiện đề tài, cung cấp những tư liệu quí giá.
Anh Nguyễn Thanh Phong, cán bộ phòng thí nghiễm đã tận tình giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài.
Gia đình, người thân và toàn thể bạn bè lớp Chế biến thủy sản K33 đã động
viên giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cần Thơ, ngày 18 tháng 07 năm 2011
Sinh viên thực hiện

TRẦN ANH KHOA

ii


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

TÓM TẮT
Đề tài “Phân tích tồn lưu kháng sinh Florfenicol và Florfenicol Amine
trong cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng hệ thống sắc kí lỏng hiệu
năng cao (HPLC)” được thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 07/2011 tại
Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ.
Đề tài gồm 3 thí nghiệm: (1) Tối ưu hoá thông số máy HPLC cho chất phân

tích nhóm Phenicol (TAP, CAP, FF và FFA); (2) Khảo sát độ thu hồi của qui
trình chiết tách; (3) Xác định tồn lưu kháng sinh FF và FFA trong cá tra. Kết
quả nghiên cứu cho thấy: Hệ thống HPLC được tối ưu hoá với các thống số:
Cột ODS Hypersil (3µm, 3mm x 15cm), bước sóng là 224 nm, pha động là
MeOH/H2O + NH3 0,1% (20:80), phương pháp chạy là Isocratic flow. Giới
hạn phát hiện (LOD) của chất phân tích FF và FFA ở nồng độ là 100 ppb. Qui
trình chiết tách đã được chuẩn hoá tại phòng thí nghiệm CART, Đại Học
Liege, Bỉ được xác định lại độ thu hồi trong điều kiện Phòng Thí nghiệm Dinh
dưỡng và an toàn thực phẩm là 76%. Ở thí nghiệm phân tích tồn lưu kháng
sinh FF và FFA, kết quả cho thấy ở ngày thứ 15 sau khi ngưng gây nhiễm thì
nồng độ còn lại là 234111 so với ở ngày gây nhiễm thứ 7 (2273853 ppb) đã
giảm đi 88,2%. Ở ngày 30 thì nồng độ FF còn lại là 106±14,9 ppb. Trong quá
trình phân tích không phát hiện (KPH) được chất chuyển hoá FFA vì ảnh
hưởng của nền mẫu do có một số peak của một số chất khác xuất hiện trùng
thời gian lưu với FFA, những peak này có diện tích lớn hơn rất nhiều lần so
với peak tín hiệu của FFA.

iii


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

PHỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii
TÓM TẮT ..................................................................................................... iii
PHỤ LỤC ......................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................... viii
CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................1
1.1 Mục tiêu của đề tài ..............................................................................1
1.2 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................1
1.3 Thời gian thực hiện .............................................................................2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..........................................................3
2.1 Giới thiệu về kháng sinh......................................................................3
2.1.1 Định nghĩa .................................................................................3
2.1.2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm .....................3
2.1.3 Tác hại của kháng sinh ...............................................................3
2.2 Giới thiệu về Flophenicol và Flophenicol Amine ................................3
2.3 Công thức cấu tạo của Flophenicol và Flophenicol amin .....................5
2.3.1 Flophenicol ................................................................................5
2.3.2 Flophenicol amine......................................................................6
2.3.3 Sự chuyển hoá của FF ................................................................6
2.4 Các nghiên cứu về Florfenicol và Florfenicol Amine ..........................7
2.4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá tra ở Việt Nam .......7
2.4.3 Các phương pháp xác định dư lượng FF và FFA ........................7
CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .....................9
3.1 Vật liệu và hóa chất .............................................................................9
3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................10
3.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa các thông số của máy HPCL cho chất
phân tích nhóm Pheniol ....................................................................10

iv


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ thu hồi của qui trình chiết tách .......10
3.2.3 Thí nghiệm 3: Phân tích tồn lưu kháng sinh Florfenicol và
Florfenicol amine trong cá tra. .......................................................... 13
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................... 16
4.1 Các yếu tố môi trường .......................................................................16
4.1.1 Nhiệt độ môi trường .................................................................16
4.1.2 pH ............................................................................................ 16
4.1.3 Lượng oxy hòa tan ...................................................................17
4.2 Thí nghiệm 1: Tối ưu hoá thông số cho máy HPLC........................... 17
4.2.1 Phương pháp 1 ......................................................................... 17
4.2.2 Phương pháp 2 ......................................................................... 18
4.3 Xây dựng đường chuẩn .....................................................................19
4.4 Hiệu suất thu hồi: .............................................................................. 19
4.5 Phân tích thức ăn ............................................................................... 20
4.6 Sự tồn lưu của Florfenicol và Florfenicol Amine............................... 21
CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 23
5.1 Kết luận ............................................................................................ 23
5.2 Đề xuất.............................................................................................. 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 24
PHỤ LỤC 1 ..................................................................................................26
PHỤ LỤC 2 ..................................................................................................31
PHỤ LỤC 3 .................................................................................................. 38
PHỤ LỤC 4 .................................................................................................. 40

v


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
NAFIQAD

National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Deparment

VASEP

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam

FDA

Food and Drug Administration

USDA

United States Deparment of Agriculture

RASFF

Rapid Alert System for Food and Feed

EEC

European Economic Community

MRL

Maximun residue limits

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

FF

Florfenicol

FFA

Florfenicol Amine

TAP

Thiamphenicol

CAP

Chloramphenicol

GM

Malachite Green

LC

Liquid chromatography

HPLC

High pressure Liquid chromatography

LC-MS

Liquid chromatography – Mass spectrometry

GC

Gas chromtography

GC-MS

Gas chromatography – Mass spectrometry

ACN

Acetonitrile

MeOH

Methanol

EtOAc

Ethyl Acetate

SXKD

Sản xuất kinh doanh

UV - vis

Ultraviolet – visible spectroscopy

ppm

Parts per million

ppb

Parts per billion

ng

Nanogram

L

Microliter

µm

Micrometer

g

Gram

mm

Milimeter

vi


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các giá trị MRL khác nhau tuỳ theo loại sản (theo quy định Châu Âu
năm 1990 số 2377/90 và số 508/1999 và 1181/2002) ..................................... 5
Bảng 3.1 Điều kiện HPLC ........................................................................... 15
Bảng 4.1 Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm ............................................... 16
Bảng 4.2 pH trung bình trong các ngày thu mẫu ........................................... 16
Bảng 4.3 Hàm lượng Oxy hoà tan trung bình trong các ngày thu mẫu .......... 17
Bảng 4.4 Diện tích peak tương ứng với nồng độ chuẩn................................. 19
Bảng 4.5 Kết quả phân tích mẫu khi gây nhiễm FF ...................................... 20
Bảng 4.6 Kết quả phân tích mẫu thức ăn gây nhiễm kháng sinh ................... 20
Bảng 4.7 Sự tồn lưu kháng sinh trên cá sau 7 ngày cho cá ăn kháng sinh....... 21
Bảng 4.8 Sự tồn lưu sau 30 ngày cho ăn kháng sinh ...................................... 21

vii


Luận văn đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của Florfenicol.................................................... 5
Hình 2.2 Công thức cấu tạo của Florfenicol Amine ........................................ 6
Hình 2.3 Sự chuyển hoá của FF ...................................................................... 6
Hình 3.1 Qui trình ly trích FF và FFA .......................................................... 12
Hình 3.2 Sơ đồ thu mẫu cá trong thí nghiệm................................................. 14
Hình 4.1 Sắc kí đồ của HPLC ở phương pháp 1 ........................................... 17
Hình 4.2 Sắc kí đồ của HPLC ở phương pháp 2 ........................................... 18
Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn ...................................................................... 19
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự tồn lưu của FF trong thời gian thí nghiệm.. ...... 22

viii


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

CHƯƠNG I
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, xuất khẩu thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng
trong nền kinh tế Việt Nam, nên việc quảng bá thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng
thủy sản đặc biệt là con cá tra ngày càng được chú trọng. Trong 6 tháng đầu
năm 2011 xuất khẩu thuỷ sản đạt 2,7 tỷ USD, tăng 28% so với cùng kỳ năm
2010 (Trung tâm tin học và thống kê - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn). Theo Kim Thu (2011) chỉ tiêu xuất khẩu năm 2015 là 6,5 – 7,5 tỷ USD
và năm 2020 là 8 tỷ USD đã được Thủ tướng chính phủ duyệt trong chiến lược
phát triển thuỷ sản đến năm 2020.
Nhưng bên cạnh sự tăng trưởng mạnh mẽ đó thì xuất khẩu thủy sản cũng vấp
phải một số khó khăn về những yêu cầu khắc khe của các thị trường xuất khẩu

như Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản,.... về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, đảm bảo
sức khỏe của người tiêu dùng. Trong khi đó, tình hình sử dụng kháng sinh,
thuốc thú y thủy sản vẫn còn tồn tại trong ngành nuôi trồng thủy sản ở Việt
Nam, đặt biệt là ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Để đảm bảo về vệ
sinh an toàn thực phẩm, đáp ứng các yêu cầu của các thị trường nhập khẩu
chính của Việt Nam nên Bộ Thuỷ sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS
ban hành ngày 24 tháng 2 năm 2005 về danh mục 17 loại kháng sinh cấm sử
dụng, ứng với các loại kháng sinh bị cấm sử dụng ở Châu Âu và Mỹ và danh
mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Florfenicol với nồng độ không
vược quá 1000 g/g. Xuất phát từ tình hình đó nên đề tài “Phân tích tồn lưu
kháng sinh Florfenicol và Florfenicol Amine trong cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bằng hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)” được
thực hiện.
1.1 Mục tiêu của đề tài
Tiếp tục xây dựng qui trình phân tích kháng sinh nhóm Phenicol
(Thiamphenicol (TAP), Chloramphenicol (CAP), Florfenicol (FF) và
Florfenicol Amine (FFA)) bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Khảo sát độ thu hồi của quy trình chiết tách.
Xác định tồn lưu kháng sinh FF và FFA trong cá tra.
1.2 Nội dung nghiên cứu
Tối ưu hóa các thông số phân tích cho nhóm kháng sinh Phenicol trên hệ
thống HPLC-UV.

1


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Xác định tồn lưu kháng sinh FF và FFA trong cá tra
1.3 Thời gian thực hiện
Từ tháng 01/2011 đến 07/2011

2


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về kháng sinh
2.1.1 Định nghĩa
Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ
phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong
quá trình phát triển của vi khuẩn.
2.1.2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm,
nhưng chủ yếu là do các nguyên nhân sau:
Có thể nhiễm lần vào thức ăn do thức ăn tiếp xúc môi trường có chứa kháng
sinh.
Do sử dụng thường xuyên kháng sinh: Mục đích kích thích tăng trọng; Phòng
bệnh mùa dịch bệnh; Chữa bệnh.
Nhằm kéo dài thời gian bảo quản, tránh hư hỏng cho thực phẩm.
2.1.3 Tác hại của kháng sinh
Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn
dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây ra sự kháng thuốc của E. Coli

(Escherichia coli). Khi E. Coli đã kháng thuốc thì nó có thể chuyền plasmid
kháng thuốc của nó cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác sống trong đường
ruột.
Phản ứng mẫn cảm đối với người nhạy cảm với kháng sinh.
Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thực phẩm tồn lưu kháng sinh.
Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc.
Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn.
2.2 Giới thiệu về Florfenicol và Florfenicol Amine
Florfenicol và Florfenicol Amine là kháng sinh thuộc nhóm Phenicol được sử
dụng trong nông nghiệp và trong thủy sản. FF có cấu trúc tương tự giống như
chloramphenicol (CAP) và TAP, nhưng nó lại tác dụng rộng hơn so với CAP
trên một số loài vi khuẩn và độc tính không bằng CAP, FF ức chế sự tổng hợp
protein của vi khuẩn và không bị sự kháng thuốc, được chứng minh có hiệu
quả trong việc kiểm soát nhiều loại bệnh do vi khuẩn cá như Aeromonas
3


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

salmonicida, Vibrio salmonicida, Edwardsiella ictaluri (Gaunt et al., 2003,
2004 trích từ Lewbart (2004)) nên nó được khuyến khích sử dụng cho gia súc
cung cấp thực phẩm cho con người. Ở châu Âu và Canada, FF đã được sử
dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở cá với tên thương mại là Aquafen và
Aquaflor (Schering-Plough, Kenilworth, NJ, Mỹ). Ở Nhật Bản, FF được sử
dụng trong thuỷ sản để phòng ngừa bệnh đuôi vàng và điều trị các bệnh nhiễm
trùng huyết đường ruột của cá da trơn. Ngoài ra, FF được sử dụng để trị các
bệnh nhiễm khuẩn ở cả người và động vật (hoạt động ngay cả trên vi khuẩn
Gram + và Gram −, đặt biệt là vi khuẩn yếm khí). Tuy nhiên, bên cạnh tác

dụng hiệu quả của thuốc, kháng sinh này cũng mang tác dụng ngược lại, cũng
như CAP, FF cũng có khuynh hướng ức chế tạo máu, thiếu máu ác tính. Theo
EEC 508/1999 và 1181/2002 và thông tư số 15/2009/TT-BNN ban hành ngày
17 tháng 3 năm 2009, FF bị hạn chế sử dụng với liều lượng tồn lưu cho phép
trong thủy sản là không vượt quá 1000 µg/kg (tổng của FF và FFA). FF đã
được đưa vào Phụ lục I của quy định Châu Âu năm 1990 (Council Regulation,
EEC) số 2377/90; Council Regulation (EEC) 508/1999 và 1181/2002 với giá
trị MRL khác nhau tuỳ theo loại sản phẩm (Bảng 2.1)

4


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Bảng 2.1: Các giá trị MRL khác nhau tuỳ theo loại sản (theo quy định Châu
Âu năm 1990 số 2377/90 và số 508/1999 và 1181/2002)
Thuốc và
hoá chất

Loại tồn lưu

Sản
phẩm
Bò

Heo

Tổng

của
Florfenicol Florfenicol
và
Florfenicol-Amine

Gà

Cá

MRLs

Mô xác
định

200 µg/kg

Cơ

3000 µg/kg

Gan

300 µg/kg

Thận

300 µg/kg

Cơ

500 µg/kg

Da + mỡ

2000 µg/kg

Gan

500 µg/kg

Thận

100 µg/kg

Cơ

200 µg/kg

Da + mỡ

2500 µg/kg

Gan

750 µg/kg

Thận

1000 µg/kg

Cơ, da, bộ
phận của
cá

Khác

Không sử dụng
cho động vật nuôi
lấy trứng hay thịt
cung cấp cho
người

2.3 Công thức cấu tạo của Florfenicol và Florfenicol Amine
2.3.1 Florfenicol
Tên
(UIPAC):
2,2-dichloro-N-[(1R,2S)-3fluoro-1-hydroxy-1-(4methanesulfonylphenyl)propan-2-yl]acetatmide
(Nguồn: en.wikipedia.org)
Công thức phân tử : C12H14Cl2FNO 4S
Công thức cấu tạo:

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Florfenicol
(Nguồn: en.wikipedia.org)
5


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

2.3.2 Florfenicol Amine
Tên (UIPAC):
propan-1-ol

(1R,

2S)-2-amino-3-fluoro-1-(4-methylsulfonylphenyl)

(Nguồn: chemicalregister.com)
Công thức phân tử: C 10 H 14 FNO 3 S
Công thức cấu tạo:

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Florfenicol Amine
(Nguồn: chemicalregister.com)

2.3.3 Sự chuyển hoá của FF

Hình 2.3 Sự chuyển hoá của Florfenicol
(Nguồn: Wrzesinski, L.C and L.S Crouch, 2003. Determination of Florfenicol
Amine in Channel Catfish Muscle by Liquid Chromatography. Journal of
AOAC International, 86: 516)
6


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

2.4 Các nghiên cứu về Florfenicol và Florfenicol Amine
2.4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá tra ở Việt Nam

Theo Phương Thảo (2011) hệ thống cảnh báo nhanh của EU (Rasff Portal),
tháng 3/2010, có 3 lô hàng thuỷ sản Việt Nam xuất khẩu sang thị trường này
bị cảnh báo. So với 2 tháng trước, số lô hàng bị cảnh báo có xu hướng gia
tăng. Tính chung 3 tháng đầu năm 2010, có tới 6 lô hàng thuỷ sản Việt Nam
nhập khẩu vào EU bị cảnh báo. Hai trong số 3 lô hàng bị cảnh báo trong tháng
3 có chứa dư lượng kháng sinh Neomycin vượt quá giới hạn cho phép.
Theo VASEP (2011) trong 4 tháng đầu năm 2011 đã có 100 lô hàng thủy sản
Việt Nam nằm trong hệ thống cảnh báo FDA của Mỹ cảnh báo. Còn tại thị
trường EU, hệ thống cảnh báo nhanh về an toàn vệ sinh thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi (RASFF-Rapid Alert System for Food and Feed) đã cảnh báo về 45
lô hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu chưa đạt tiêu chuẩn vì các nguyên nhân
khác nhau, trong đó có nhiễm các chất kháng sinh chlorpyriphos, trifluralin,
chloramphenicol… Tại Nhật Bản, đã quyết định kiểm soát chặt chẽ 100% số
lô tôm của Việt Nam xuất sang Nhật đối với Trifuralin và Enrofloxacin.
Theo NAFIQAD (Cơ quan quản lý chất lượng nông lâm sảm và thuỷ sản)
trong 5 tháng đầu năm 2011, khi kiểm tra dư lượng kháng sinh, hoá chất cấm
sử dụng tại Nam bộ đã phát hiện: Tại An Giang 02 mẫu cá tra thương phẩm
nhiễm Enrofloxacin (7,55 ppb và 4,90 ppb); Hậu Giang 01 mẫu cá rô đồng
nhiễm Trifuralin (265,69 ppb); Trà Vinh: 01 mẫu cá tra thương phẩm nhiễm
Enrofloxacin (12,48 ppb); Đồng Tháp: 03 mẫu cá tra thương phẩm nhiễm
Enrofloxacin (15,7 ppb, 7,65 ppb và 17,2 ppb) và 01 mẫu cá tra thương phẩm
nhiễm Trifuralin (21,14 ppb); Bến Tre: 01 mẫu cá tra thương phẩm nhiễm
Trifuralin (1,0 ppb); Vĩnh Long: 01 mẫu cá tra thương phẩm nhiễm
Enrofloxacin (5,00 ppb), 01 mẫu cá tra thương phẩm nhiễm Enrofloxacin
(1.642,57 ppb) và Ciprofloxacin (85,17 ppb); Cần Thơ: 02 mẫu cá tra thương
phẩm nhiễm Trifuralin (38,0 ppb và 38,1 ppb); Tiền Giang: 01 mẫu tôm sú
thương phẩm nhiễm Trifuralin (1,5 ppb).
2.4.3 Các phương pháp xác định dư lượng FF và FFA
Nhiều phương pháp khác nhau đã được tiến hành thử nghiệm để xác định hàm
lượng FF trong mô cơ của các loài động vật và thủy sản bao gồm sắc ký lỏng

(LC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép
khối phổ (GC-MS). Tuy nhiên, một vài phương pháp đã được nghiên cứu và
được sử dụng để phân tích tồn lưu kháng sinh, chẳng hạn như:
Jiancheng Li et al., (2006) đã xác định tồn lưu Florfenicol và chất chuyển hóa
Florfenicol Amine trong mô cơ của lợn bằng phương pháp HPLC. Sau khi
7


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

tiêm FF và FFA vào cơ thể lợn với nồng độ 20 mg/kg, sau 6 ngày nồng độ FF
và FFA còn lại như sau: Ở cơ 61 ng/g (FF), gan 78 ng/g (FFA), thận 103 ng/g
(FF) và 165 ng/g (FFA). FF được chiết tách bằng acetone/H2O (tỉ lệ 80:20) và
khử béo bằng n-hexane. Thông số phân tích, LC: Cột Inertsil ODS-3 (4,6 mm
x 250 mm, 5 m), bước sóng 225 nm, nhiệt độ lò cột ở nhiệt độ phòng.
Lewbart et al. (2005) đã nghiên cứu tác dụng của Florfenicol trên red PACU
(Piaractus brachypomous) sau khi tiêm vào cơ. FF được phân tích bằng hệ
thống HPLC với cột Zorbax RX-C8 (4,6 mm x 15 cm; 5m MAC MOD Inc.,
Chadds Ford, PA, USA), pha động: 73% nước và 27% acetonitrile. Sử dụng
đầu dò UV và bước sóng là 223 nm. Tốc độ dòng là 1 mL/phút. Giới hạn phát
hiện là 0,39 g/mL.
Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA-United States Deparment of Agriculture)
(2006) đã phân tích FF bằng hệ thống GC/MS. FF (cũng như FFA) có giới hạn
phát hiện là 0,5 ppm trong gan trâu, bò và 0,3 ppm trong cơ. Phương pháp này
sử dụng HCl 6N để thuỷ phân mẫu, trung hoà bằng NaOH bão hoà. Mẫu được
chiết bằng ethyl acetate và loại béo bằng dichloromethane. Hệ thống GC/MS
được sử dụng là GC 6890 kết hợp với đầu dò khối phổ Aligent 5973. Cột là
Fused Lilica Capillray – J & DB – 17 liquid phase ( 0,5 m, 15 m x 0,25 mm).

Thêm vào đó việc phát triển phương pháp dựa trên các nghiên cứu của
Pfenning et al. (2002), Van de Riet et al. (2003), là những nghiên cứu đã thành
công trong đồng thời phân tích cả bốn chất trong nhóm phenicol hay trên các
mẫu khác nhau bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ. Van De Riet et al. (2003)
đã chiết các Florfenicol và Florfenicol Amine bằng acetone, được hòa tan
trong acid và khử béo bằng hexan. LC được sử dụng là pha đảo ngược với cột
sắc ký Hypersil C18-BD (2,0mm x 15 cm, 5m) và pha động: Kênh (A): dung
dịch deionized +0.1% dung dịch acid acetic; Kênh (B): acetonitrile + 0.1%
dung dịch acid acetic. LC/MS detector.—Waters Micromass Model ZQ-2000.
Giới hạn phát hiện cho FF là 0,1 ng/g và FFA là 1,0 ng/g. Pfenning đã chiết
mẫu với ethyl acetate và hỗn hợp acetonitrile-ethyl acetate và khử béo với
hexane. Hệ thống GC sử dụng cột C18 PSE và các cột PRS SPE. Giới hạn
phát hiện cho CAP, FF, FFA và TAP là: 0,7ng/g; 1,4 ng/g; 2,4 ng/g; 2,4 ng/g
và 1,3 ng/g.

8


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

CHƯƠNG III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Vật liệu và hóa chất
Hóa chất, dụng cụ và phương tiện trong phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh
Dưỡng và Chế biến Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
 Thiết bị:
Bể thí nghiệm có thể tích 500 L (dạng bể tròn)
Máy cô quay Bϋchi Rotavapor R-200

Máy vortex VX100
Máy li tâm lạnh Mikro 22B
Máy lắc ống nghiệm Sharker SK-200
Cân phân tích có d=0,01 và d = 0,0001
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 2010
Cột sắc ký:
ODS Hypersil (3 m, 2 mm x 15 cm)
Luna C18 (5 µm, 3 mm x 15 cm)
Bình cầu quả lê
Ống fancon loại 15 mL
Các dụng cụ và phụ kiện cần thiết trong phân tích sắc ký.
 Hoá chất:
Thuốc: Vimeflore FDP đóng chai, dạng dịch lỏng, thể tích 250 mL. Thành
phần gồm: Florfenicol (25 g); Doxycyline (12,5 g); Propylen Glycol (50 g) và
Exp.qsp 250 mL.
Kháng sinh chuẩn:
Kháng sinh Florfenicol (FF): Số hiệu 76639-94-6
Kháng sinh Florfenicol amine (FFA): Số hiệu 76639-93-5
Sodium sulfate khan (Na2SO4)
Ethyl acetate (EtOAc) loại dùng cho phân tích sắc ký
Hexane loại dùng cho phân tích sắc ký
Methanol (MeOH) loại dùng cho phân tích sắc ký
Acetionitrile (ACN) loại dùng cho phân tích sắc ký
Nước cất loại dùng cho HPLC
9


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Cá tra có trọng lượng 20 g/con, không bệnh, không dị tật khỏe mạnh mua ở
trại cá giống Cần Thơ. Được thuần dưỡng trước khi tiến hành thí nghiệm 2
tuần.
Nguồn nước sử dụng cho thí nghiệm là nước máy đã được lọc kỹ.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa các thông số của máy HPLC cho chất
phân tích nhóm Phenicol
Chạy chuẩn nhóm Phenicol (TAP, CAP, FF và FFA) trên hệ thống HPLC-UV
3.2.1.1 Phương pháp 1
Điều kiện HPLC
Cột sắc ký

ODS Hypersil (3m, 2 mm x 15 cm)

Bước sóng

224 nm

Pha động

MeOH/H2O + NH3 0,1% (Tỉ lệ 20:80)

Tốc độ dòng

0,3 mL/phút

3.2.1.2 Phương pháp 2
Điều kiện HPLC
Cột sắc ký

Luna C18 (5 µm, 3 mm x 15 cm)

Bước sóng

224 nm

Pha động

MeOH/H2O + NH3 0,1% (20:80)

Tốc độ dòng

0,3 mL/phút

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ thu hồi của qui trình chiết tách
Nguyên tắc: Chiết mẫu bằng ethyl acetate và khử béo mẫu bằng nhexane.
Chuẩn bị mẫu: Cân 2 g mẫu đã nghiền, sau đó đem trữ mẫu ở -20 oC. Rã đông
khi phân tích.
Chuẩn bị mẫu có gây nhiễm kháng sinh: Cân 2 g mẫu đã nghiền cho vào
ống fancon 15 mL, sau đó cho thêm 30 L chuẩn gồm TAP, CAP, FF và FFA
10 ppm vào.
Quy trình chiết tách: Quy trình chiết tách được sử dụng từ quy trình chiết
tách nhóm phenicol đã được tối ưu hoá tại phòng thí nghiệm CART, Đại học
Liege, Bỉ. Quy trình chiết tách được thực hiện theo các bước sau:
1.Cân 2 g mẫu cá đã nghiền cho vào ống fancon 15 mL
2.Thêm 2 g sodium sunfate khan.
3.Thêm 7 mL ethyl acetate, đậy nắp ống fancon
10

Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

4.Vortex 1 phút
5. Lắc ngang 20 phút, tốc độ 300 vòng/phút
6. Ly tâm lạnh trong 15 phút, ở 20oC và tốc độ là 4000 rmp
7.Chuyển phần dung dịch phía trên sang ống fancon (15 mL) mới; Phần rắn
tiếp tục thêm 7 mL ethyl acetate. Vortex 1 phút, lắc ngang (20 phút, tốc độ
300 vòng/phút), ly tâm lạnh (20 phút, 4000 rmp, 20oC). Dịch chiết lần 2 cho
vào dung dịch chiết lần 1.
8.Tiếp tục ly tâm lạnh (20 phút, 4000 rmp, 5oC).
9.Chuyển phần dịch sang bình cầu, làm khô bằng cách cô quay.
Làm sạch mẫu (Nếu mẫu có nhiều béo thì loại béo với hexane)
10.Thêm 1 mL ACN
11.Thêm 1 mL n-hexane
12.Loại bỏ n-hexane (Phần dung dịch phía trên)
Nếu mẫu vẫn còn béo tiếp tục thực hiện lại hai bước (11,12) giống như trên
đến khi mẫu không còn chất béo.
13.Làm khô mẫu dưới dòng khí N2 ở 40 oC
14.Thêm 1 mL dung dịch pha động (MeOH/H2O + 0,1% NH3 (20:80))
15. Lọc qua đầu lọc có đường kính 2 µm
16. Chứa mẫu trong vial ở 4oC chờ phân tích
17. Phân tích bằng HPLC

11


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Cân 2 g mẫu nghiền đồng nhất
Thêm 2 g Na2SO4
Thêm 7 ml Ethy acetate

Ống fancon 15

 Vortex 1 phút
 Lắc ngang 20 phút, 300 vòng/phút
 Ly tâm lạnh: 15 phút,
4000 rmp, 20oC

Hỗn hợp tách hai lớp

Rắn (xác
 Thêm 7 ml Ethyl acetate
 Vortex 1 phút
 Lắc ngang 20 phút,300 vòng/phút
 Ly tâm lạnh: 15 phút,

Dịch chiết
(lần 1)

4000 rmp, 20 oC
Hỗn hợp tách 2 lớp
Rắn
(xác thịt)

Ống fancon
15 ml mới

 Vortex 1 phút
 Ly tâm lạnh: 20
phút, 4000 rmp, 5oC

Dịch chiết (lần 2)

Cô quay

Bỏ
 Thêm 1 ml ACN
 Thêm 1 ml n-hexane
 Loại n-hexane

Hoàn nguyên
Làm khô bằng N2 ở 40 oC

Thêm 1 ml pha động:
(H2O + 0,1% NH3)
Lọc
HPLC

Hình 3.1: Sơ đồ qui trình ly trích

12


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

3.2.3 Thí nghiệm 3: Phân tích tồn lưu kháng sinh Florfenicol và
Florfenicol Amine trong cá tra.
3.2.3.1 Thức ăn
Thức ăn được dùng trong thí nghiệm là thức ăn công nghiệp 30% N được bổ
sung Florfenciol và Doxicylin.
Thuốc kháng sinh được bổ sung vào thức ăn bằng cách sử dụng pipete hút
chính xác 100 L dung dịch thuốc kháng sinh và hoà tan thuốc bằng nước cất,
sau đó phun đều lên 0,1 kg thức ăn. Thức ăn phối trộn với kháng sinh chỉ sử
dụng trong ngày.
3.2.3.2 Xác định tồn lưu kháng sinh FF và FFA trong thức ăn
Mục đích:
Xác định chính xác lượng kháng sinh FF tồn lưu trong thức ăn phối trộn là bao
nhiêu.
Phương pháp tiến hành:
Mẫu thức ăn được thu lại sau mỗi lần phối trộn thức ăn với kháng sinh và
được bảo quản ở nhiệt độ -20oC trước khi tiến hành phân tích.
Qui trình phân tích:
Mẫu thức ăn thí nghiệm sẽ được chiết tách và làm sạch dựa trên Quy trình
chiết tách nhóm Phenicol được tối ưu hoá tại phòng thí nghiệm CART, Đại
học Liege, Bỉ (Hình 3.1 mục 3.2.2) trước khi tiến hành phân tích trên hệ thống
HPLC.
3.2.3.3 Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh Florfenicol và Florfenicol
Amine trong sản phẩm cá tra
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí gồm có 3 bể cá (thể tích bể là 500 L), mỗi bể chứa 50
con khối lượng 20 g/con, bể nuôi được sục khí liên tục. Cá được mua ở trại cá
giống Cần Thơ và được nuôi trong bể 2 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm
Cho cá ăn thức ăn có chứa kháng sinh mỗi ngày 2 lần trong 7 ngày liên tục,
sau đó cho cá ăn thức ăn không chứa kháng sinh trong các ngày tiếp theo.
Thu mẫu
Thu mẫu các yếu tố môi trường: nhiệt độ, pH, oxy đo mỗi ngày 2 lần đo trong
7 ngày cho cá ăn thức ăn có chứa kháng sinh và định kỳ vào các ngày thu mẫu.
Thu mẫu cơ thịt cá để phân tích tồn lưu kháng sinh: Thu mẫu (5 con/lần/bể)
vào các khoảng thời gian như sau:

13


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Hình 3.2 Sơ đồ thu mẫu cá trong thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu cá phân tích
Sau khi thu mẫu cá được đem fillet, loại bỏ xương, da, vây, cắt nhỏ, xoay
nhuyễn và đem trữ mẫu ở nhiệt độ -20 oC để chờ phân tích.
Phương pháp phân tích
Phân tích mẫu tồn lưu kháng sinh FF và FFA bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
 Các dung dịch sử dụng trong thí nghiệm
Hỗn hợp H2O + 0,1% NH 3: Hút 250 L NH3 cho vào 250 mL nước cất (loại
dùng cho HPLC).
Dung dịch MeOH/H 2O + NH3 0,1%: hút 100 mL MeOH cho vào 400 mL
H2O+NH3 0,1%.
Cách pha chuẩn FF và FFA
1. Chuẩn gốc 1000 ppm: cân 0,250 mg chuẩn gốc FF và 0,250 mg chuẩn gốc

FFA, 0,250 mg chuẩn gốc CAP và 0,250 mg chuẩn gốc TAP cho vào vial (1,5
mL), hút chính xác 1000 L MeOH cho vào vial, vortex.
2. Chuẩn trung gian 10 ppm: hút chính xác 10 µL dung dịch chuẩn gốc và 990
µL MeOH cho vào vial, vortex.
3. Chuẩn trung gian 1 ppm: hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn trung gian
10 ppm và 900 µL MeOH cho vào vial, vortex.
4. Chuẩn làm việc 500 ppb: hút chính xác 500 µL chuẩn trung gian 1 ppm và
500 µL MeOH cho vào vial, vortex.
5. Chuẩn làm việc 100 ppb: hút chính xác 100 µL chuẩn trung gian 1 ppm và
900 µL MeOH cho vào vial, vortex.

Điều kiện HPLC
14


Luận văn Đại học

Ngành Chế biến Thuỷ sản

Bảng 3.1 Điều kiện HPLC
Thời gian (phút)

%A

%B

10

20

80

Phương pháp

Isoratic flow

A

MeOH

B

H2O + NH3 0,1%

Thể tích tiêm

20 L

Tốc độ dòng

0,3 mL/phút

Bước sóng

224 nm

Cột sắc ký

ODS Hypersil (3m, 3mm x 15 cm)

Áp suất

108 kgf/cm2

3.2.3.7 Phương pháp xử lí số liệu
Phân tích số liệu trên Microsoft Excel 2007
Số liệu được nhập vào Excel 2007 sau đó tiến hành xử lí bằng các hàm công
thức có sẵn trong Excel.
Xử lí trung bình: Dựa vào hàm Average để tính trung bình cho các bể nuôi.
Xử lí sai số: Dùng hàm Stdev để tính các khoảng sai số cho trung bình các bể.

15